rage在mgo诱导jurkat细胞分泌炎症因子tnf-α和ifn-γ中的作用

目录
英文缩略词表 (3)
中文摘要 (4)
英文摘要 (6)
前言 (8)
材料与方法 (10)
结果 (19)
讨论 (25)
小结 (29)
结论 (30)
参考文献 (31)
致谢 (36)
综述 (37)
英文缩略词表
英文缩略英文全称中文名称MGO Methylglyoxal 甲基乙二醛
RAGE Receptor For Advanced Glycation End
Products
晚期糖化终产物受体
CaM CaMKIV Calmodulin
Calmodulin-dependent Protein Kinase IV
钙调蛋白
钙调蛋白依赖性蛋白激
酶IV
p38 MAPK p38 mitogen-activated protein kinase p38丝裂原活化蛋白激
酶
NAC N-acetyl-L-cysteine N-乙酰-L-半胱氨酸TNF-αTumor Necrosis Factor-α肿瘤坏死因子α
IFN-γInterferon-γ干扰素-γ
FBS Fetal Bovine Serum 胎牛血清
DMSO Dimethyl Sulfoxide 二甲基亚砜
PHA Phytohemagglutinin 植物血球凝集素PMSF Phenylmethanesulfonyl Fluoride 苯甲基磺酰氟
TEMED Tetramethylethylenediamine四甲基乙二胺
ECL Enhanced Chemiluminescence增强化学发光法ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay 酶联免疫法
GLO-1 Glyoxalase-1 乙二醛酶-1
RAGE在MGO诱导Jurkat细胞分泌炎症因子
TNF-α和IFN-γ中的作用
中文摘要
目的：甲基乙二醛（MGO）是葡萄糖活性代谢产物，晚期糖化终产物受体（RAGE）可抑制MGO代谢的关键酶乙二醛酶1（GLO-1）。

MGO和晚期糖化终产物受体的水平在糖尿病人中明显增高，与糖尿病加速动脉粥样硬化有关，但它们之间相互作用在糖尿病加速动脉粥样硬化中的意义仍不清楚。

本课题组前期研究发现MGO诱导Jurkat 细胞分泌炎症因子TNF-α、IFN-γ。

本实验将进一步研究RAGE及其胞内信号对MGO 诱导的Jurkat细胞分泌TNF-α和IFN-γ的影响，为了解糖尿病加速动脉粥样硬化机制提供了实验基础。

方法：①不同浓度的MGO（0、15、30、60μM）作用PHA（0.25μg/ml）预刺激的Jurkat细胞24h，Western blot 检测RAGE表达。

②不同浓度MGO（0、15、30、60μM）作用于PHA预刺激的Jurkat细胞24h，ELISA检测TNF-α和IFN-γ的分泌；部分实验加RAGE抗体（1μg/ml）预处理，同时设非特异抗体（1μg/ml）为对照。

③不同浓度MGO（0、15、30、60μM）作用PHA预刺激的Jurkat细胞24h, Western blot 测钙调蛋白依赖性蛋白激酶IV（CaMKIV）的表达；部分实验加RAGE抗体（1μg/ml）预处理，同时设非特异抗体（1μg/ml）为对照。

免疫荧光检测30μM MGO作用0、15、30、60min后的Jurkat 细胞内CaMKIV转核情况；部分实验加RAGE抗体（1μg/ml）预处理，同时设非特异抗体（1μg/ml）为对照。

④30μM MGO作用PHA预刺激24h 的Jurkat细胞0、15、30、60min，Western blot 检测p38MAPK磷酸化表达；部分实验加RAGE抗体（1μg/ml）预处理，同时设非特异抗体（1μg/ml）为对照。

⑤30μM MGO作用于CaMKIV抑制剂KN62（10μM）、p38 MAPK抑制剂SB203580（25μM）预处理的Jurkat 24h，ELISA检测TNF-α和IFN-γ的分泌。

结果：①MGO作用于PHA预刺激的Jurkat细胞24小时，Western Blot显示Jurkat 细胞表达RAGE，15、30、60μM MGO均上调RAGE的表达，与MGO未作用组比较差异有统计学意义（P<0.05）。

②15、30、60μM MGO 作用于Jurkat细胞24h可促使Jurkat细胞分泌TNF-α及IFN-γ，与MGO未作用组比较差异有统计学意义
（p<0.05）。

RAGE抗体能抑制MGO诱导Jurkat细胞分泌TNF-α及IFN-γ（p<0.05），而非特异抗体预处理对MGO诱导Jurkat细胞分泌TNF-α及IFN-γ无影响（p>0.05）。

③15-60μM MGO能增加CaMKIV的表达，与MGO未作用组比较差异有统计学意义（p<0.05）。

RAGE抗体抑制MGO诱导的CaMKIV的表达（p<0.05）；而非特异抗体预处理对MGO诱导CaMKIV的表达无影响（p>0.05）。

免疫荧光显示30μM MGO 作用15-60min促进Jurkat 细胞CaMKIV核转位；RAGE抗体抑制MGO诱导的CaMKIV蛋白核转位，而非特异抗体预处理对MGO诱导CaMKIV蛋白核转位无影响。

④30μM MGO作用Jurkat细胞15-60min引起Jurkat细胞内p38MAPK磷酸化表达增加（p<0.05）；RAGE抗体抑制MGO引起的p38MAPK磷酸化（p<0.05），而非特异抗体预处理对MGO诱导p38MAPK磷酸化无影响（p>0.05）。

⑤CaMKIV，p38 MAPK通路抑制剂预处理抑制MGO诱导TNF-α和IFN-γ的分泌（p<0.05）。

结论：MGO上调Jurkat细胞表面RAGE的表达，并通过RAGE引起CaMKIV表达增加、促进CaMKIV核转位以及p38MAPK磷酸化,进一步促进炎症因子TNF-α及IFN-γ分泌。

关键词：甲基乙二醛；晚期糖化终产物，受体；信号转导；淋巴细胞；炎症因子
The role of RAGE in the secretion of TNF-α and IFN-γinduced by MGO in Jurkat cells
ABSTRACT
Objective: Methylglyoxal (MGO) is a reactive metablite of glucose and is efficiently catabolised to D-lactate by glyoxalase-1. The receptor for advanced glycation endproducts (RAGE) regulates the level of glyoxalase-1(GLO-1). The plasma concentration of MGO and the expression of RAGE are increased in diabetic patients. Both MGO and the receptor for advanced glycation endproducts (RAGE) have been shown to play a causative role in atherosclerosis. However, whether they function interactively in the process remains uncertain. Recently, we have demonstrated enhanced expression of tumor necrosis factor -alpha (TNF-α) and interferon -gamma (IFN-γ)in Jurkat cells induced by MGO. We therefore studied the effects of RAGE on the methylglyoxal induced expression of TNF-α and IFN-γ in Jurkat cells.
Methods:①Jurkat cells which prestimulated by PHA (0.25μg/ml) for 24h were incubated in different concentrations of MGO ( 0,15,30,60 μM) for another 24h, then the expression of RAGE was determined by Western blot. ②Jurkat cells were incubated in different concentrations of MGO for 24h, then the releases of TNF-а and IFN-γ were determined by ELISA. To further explore the role of RAGE in the expression of cytokines, neutralizing antibody for RAGE was added to the cells 60 min before the addition of 30μM MGO. ③Jurkat cells were treated with different concentrations of MGO for 24h, the expression of CaMKIV was determined by Western blot. In order to study the nuclear translocation of CaMKIV, Jurkat cells were treated with 30μM MGO for 0, 15, 30 and 60 min, and the nuclear translocation of CaMKIV was observed by immunofluorescence assay. ④Jurkat cells were treated with 30uM MGO for 0-60min, the expression of pp38MAPK /p38MAPK was determined by Western blot. Neutralizing antibody for RAGE was used before MGO treated in addition. ⑤ For the purpose of exploring the role of CaMKIV and p38MAPK in expression of cytokines, the inhibitor KN62 and SB203580 were added to the cells 30min before the addition of 30uM MGO, the productions of TNF-α and IFN-γ
were investigated by ELSIA.
Results:①Exposure of PHA-actived Jurkat cells to MGO enhanced the expression of RAGE. ②From ELISA, we found a significant increase in TNF-α and IFN-γ expression s in Jurkat cells exposed to MGO; Furthermore, the MGO-stimulated TNF-α and IFN-γexpressions were significantly suppressed by a neutralizing Abs for RAGE.③Exposure of PHA-actived Jurkat cells to MGO enhanced the expression of CaMKIV. Furthermore, the MGO-stimulated CaMKIV was significantly suppressed by Abs for RAGE. After exposure to the 30μM MGO for 0-60min, the translocation of CaMKIV protein was accelerated by fluorescence microscopy; In addition, the nuclear translocation of CaMKIV induced by MGO were blocked by a neutralizing RAGE antibody.④After exposure to the 30μM MGO for 0-60min, the expression of pp38/p38MAPK increases, but were growed downwards by RAGE antibody.⑤TNF-αand IFN-γ expression were significantly suppressed in the presence of the specific inhibitors SB203580and KN62 respectively. Conclusion:The findings from this study suggested that MGO can up-regulate the expression of RAGE in Jurkat cells, and promote the secretion of inflammatory cytokines TNF-α and IFN-γ via RAGE, p38MAPK and CaMKIV signal pathways .
Key words:Methylglyoxal; Receptor, Advanced glycation endpeoducts; signal transduction; Lymphocyte; inflammatory cytokine
前言
糖尿病是动脉粥样硬化的主要危险因素之一，目前认为动脉粥样硬化是一种慢性的炎症免疫反应。

在动脉粥样硬化形成发展中,有大量免疫相关的细胞参与并构成动脉粥样硬化的免疫反应,包括免疫系统的单核/巨噬细胞和淋巴细胞、内皮细胞、平滑肌细胞等，它们在各种细胞因子的协凋下相互作用，相互影响，共同参与了动脉粥样硬化的发生、发展。

以往的研究多集中在单核/巨噬细胞、内皮细胞、平滑肌细胞等，近年研究表明T淋巴细胞在动脉粥样硬化的发生、发展也起重要作用[1-2]。

所以本课题以T淋巴细胞为研究对象从免疫反应角度探讨糖尿病促进动脉粥样硬化进程的作用机制。

因为长期高血糖可引起晚期糖基化终产物（AGEs）生成增多，有关AGEs在动脉粥样硬化中的作用研究较多。

AGEs主要通过晚期糖基化终产物受体（RAGE）介导的慢性炎症反应引起糖尿病的各种并发症[3-4]。

另一方面近年研究发现葡萄糖降解产物甲基乙二醛（MGO）和乙二醛甚至比高糖和AGEs对内皮细胞功能影响更大，引起人们高度重视[5-6]。

葡萄糖降解产物即高浓度的葡萄糖在体内降解形成的一组高反应性的二羰基化合物，包括MGO、乙二醛、2-脱氧-D-葡萄糖、3,4-双脱氧葡糖醛酮烯等。

MGO是目前研究较多的二羰基化合物，它主要来自糖酵解生成的磷酸丙糖中间体，通过非酶催化脱磷酸，或由磷酸丙糖异构酶活性位点的烯二醇中间体降解而成[5]；其他如细胞色素催化的丙酮氧化和葡糖胺反应等也可产生MGO。

MGO 主要通过乙二醛酶-1（GLO-1）和醛糖还原酶途径代谢[7-8]。

MGO 等作为非酶糖化反应的中间体，在糖尿病患者中大量存在。

有文献报道正常人血浆MGO的浓度约为3.3μM，但糖尿病患者长期处于高血糖环境，血浆MGO的浓度明显增高，1型糖尿病较正常高5-6倍，2型糖尿病较正常高2-3倍[9-10]。

研究表明MGO不但可通过形成AGEs与糖尿病并发症密切相关，而且接近糖尿病人体内浓度的MGO可直接影响细胞功能。

Wang等发现30μM MGO作用12小时可引起中性粒细胞分泌炎症因子IL-6、IL-8和TNF-α[11]。

Gawlowski等也发现用0-17μM MGO作用150分钟能引起外周血单核细胞表达组织因子，促进凝血[12]。

另外还发现MGO与糖尿病多伴发的高血压发病有关[13-14]。

所以人们已在实验中通过高表达GLO-1或提高GLO-1的活性来减少高糖相关的危害[15]。

另一方面研究发现RAGE也是治疗糖尿病高血糖相关的重要靶点，RAGE不仅仅是AGEs、S100/钙颗粒素等的受体，而且能促进这些配体的形成，在体内形成恶性循环[16-19]。

近年研究发现RAGE高表达可减少谷胱甘肽的水平从而减少乙二醛酶-1活性（乙二醛酶-1的作用需谷胱甘肽协同），使体内MGO浓度升高，进而生成更多的AGEs[17]。

事实上，RAGE的表达不仅受配体的影响，许多与慢性炎症相关的因素如细胞因子、氧自由基、氧化低密度脂蛋白等均可上调RAGE的表达[18]。

虽然各种葡萄糖降解产物不是RAGE的经典配体，但研究发现高压灭菌的腹膜透析液中的葡萄糖降解产物MGO、2-脱氧-D-葡萄糖、3,4-双脱氧葡糖醛酮烯可增加腹膜间皮细胞表面RAGE及其他AGEs的受体的表达，并引起腹膜间皮细胞分泌血管内皮细胞生长因子，从而影响腹膜间皮细胞功能,加重慢性肾透析相关并发症的发生[19]。

本课题组前期研究发现MGO诱导Jurkat细胞分泌TNF-α、IFN-γ，其机制可能与氧化应激，p38MAPK、JNK信号通路有关[20]。

而Jurkat细胞表面存在RAGE的表达，RAGE的胞内信号通路也涉及氧化应激，MAPK 途径。

MGO是否通过RAGE诱导Jurkat细胞分泌炎症因子？抑制RAGE能否减轻T淋巴细胞炎症反应？本课题组在内皮细胞研究中发现钙信号通路中的钙调蛋白依赖蛋白激酶IV（CaMKIV）也是RAGE 胞内信号分子之一[21]，而CaMKIV与T淋巴细胞功能密切相关，因此本课题观察了MGO对Jurkat细胞表面RAGE表达的影响及其细胞内信号通路，从免疫功能紊乱角度阐明糖尿病加速动脉粥样硬化发展的机制，将为糖尿病并发症的防治提供新思路。

材料与方法
一、细胞株
人类T细胞白血病细胞株Jurkat细胞(中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心)
二、主要仪器及试剂
1、主要仪器
仪器与设备厂商
超净工作台苏州苏净集团
细胞培养箱日本SANYO公司
恒温水浴箱上海第七仪器厂
低温冰箱（–80℃）日本SANYO公司
双重纯水蒸馏器上海新嘉电子有限公司
电子天平AE-200 美国梅特勒公司
水平摇床江苏金坛医疗仪器厂
酶标仪ELX800 美国宝特Bio-Tek，ELX800
荧光显微镜（TE2000-U）日本尼康公司
OLYMPUS IX71荧光成像系统日本尼康公司
低温高速离心机ALLEGRA64 美国BECKMAN公司
微量加样器法国Gilson公司
Mini Trans-blot转移系统美国BIO-RAD公司
Mini protein 3 cell小型垂直电泳仪江苏金坛医疗器械厂
2、主要试剂
试剂名称来源
RPMI1640培养粉美国Gibico公司
胎牛血清杭州四季青生物公司
牛血清白蛋白美国Amresco公司
DMSO 美国Sigma公司
植物血球凝集素（PHA）美国Sigma公司
辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG 美国Pierce公司
辣根过氧化物酶标记山羊抗鼠IgG 美国Pierce公司
鼠抗人RAGE单克隆抗体美国Santa Cruz公司
兔抗人CaMKIV单克隆抗体美国Epitomics公司
兔抗人p38MAPK及pp38MAPK多克隆抗
Cell Signaling Technology
体
鼠抗人β-actin单克隆抗体北京中杉金桥生物技术有限公司非特异鼠IgG 美国Santa Cruz公司
p38MAPK阻滞剂（SB203580）美国Sigma公司
CaMK IV抑制剂（KN62）Cayman chemical
Dylight488 驴抗兔IgG 美国Jackson Immunoresearch
N-乙酰半胱氨酸(NAC) 江苏海门碧云天生物技术研究所人TNF-α ELISA试剂盒武汉博士德生物公司
人IFN-γ ELISA试剂盒武汉博士德生物公司
细胞裂解液RIPA（强）江苏海门碧云天生物技术研究所PMSF 南京凯基生物公司
过硫酸铵（APS）江苏海门碧云天生物技术研究所蛋白Marker 上海生物工程有限公司
硝酸纤维素膜（NC膜）北京中杉金桥生物技术有限公司封闭蛋白干粉博士德生物工程有限公司
ECL试剂盒江苏海门碧云天生物技术研究所
30% Acr-Bis溶液（29：1）江苏海门碧云天生物技术研究所
3、主要试剂的配制
（1）细胞培养基：90%RPMI1640培养基，10%FBS，碳酸氢钠2g，溶于800ml双蒸水中，调节pH至7.4左右，定容至1000ml，过滤除菌，分装后保存于-20℃冰箱。

（2）PHA溶液：5mg PHA粉末溶于25ml的无血清1640中，过滤，分装，-20℃冰箱保存。

用时取1mlPHA加入9毫升无血清1640配制备用。

（3）MGO溶液：取5μl MGO原液，加入13.53ml无血清的1640，配成浓度30μMMGO 溶液，分装-20℃冰箱保存。

用时根据实验所需浓度和细胞体积取30μMMGO溶液相应体积。

（4）0.01M磷酸盐缓冲液（PBS）：NaCl 8g，KCl 0.2g，无水Na2HPO4 1.44g，KH2PO4
0.24g，用双蒸水溶解后调pH至7.4，定容至1000ml，高压灭菌。

（5）磷酸盐吐温缓冲液（PBST）：1L 0.01M PBS溶液中加入0.1%Tween-20 2ml，混匀。

（6）浓缩胶储存液（1M Tris-Hcl PH6.8）：6.06g Tris，30ml双蒸水，用1M Hcl调PH 至6.8，双蒸水定容至50ml，4℃冰箱保存。

（7）分离胶储存液（1M Tris-Hcl PH8.8）：9.08g Tris，30ml双蒸水，用1M Hcl调节PH至8.8，双蒸水定容至50ml，4℃冰箱保存。

（8）10%十二烷基硫酸钠（SDS）：2.5gSDS定容至25ml，4℃冰箱保存。

（9）10%过硫酸铵（APS）：0.02gAPS溶于200μl双蒸水，－20℃冰箱保存。

（10）Tris-甘氨酸电泳缓冲液：Tris碱15g、甘氨酸72g、SDS 5g，蒸馏水500ml，混匀，完全溶解，即10×储存液，4℃冰箱保存。

用前取50ml加450ml蒸馏水，混匀，即1×储存液。

（11）电转液缓冲液（湿转）：Tris碱15.15g、甘氨酸71.5g，加蒸馏水800ml，甲醇200ml混匀，完全溶解，系1×储存液，4℃冰箱保存。

（12）Tris-缓冲盐水（TBS，10×）：Tris碱12.1g、氯化钠40g，加蒸馏水至500ml，搅拌混匀至完全溶解，调PH值至7.6，系10×储存液，4℃冰箱保存。

用前取100ml加900ml蒸馏水，混匀。

（13）Tris-HCl吐温缓冲液（PBST）：1L TBS（1×）缓冲液加入0.1%Tween-20 1-2ml，
混匀。

（14）封闭液：脱脂奶粉0.5g，溶解于10mlTBS（1×），即浓度为5%的封闭液。

（15）5×上样缓冲液：1M Tris-HCL（PH 6.8）1.25ml、SDS 0.5g、溴酚蓝25MGO、甘油2.5ml、β-巯基乙醇250ml，混匀。

（16）10×丽春红染液：0.5g丽春红，冰乙酸2.5ml，双蒸水50ml，混匀，过滤后室温保存，临用前用双蒸水稀释10倍。

（17）0.25%考马斯亮蓝：甲醇45ml，冰乙酸10ml，考马斯R250 0.25g，双蒸水45ml，混匀，过滤。

（18）10%分离胶：30%丙烯酰胺溶液3.3ml、双蒸水4ml、10%SDS 10μl、APS 10μl、TEMED 4μl、1.5M Tris（PH 8.8）2.5ml，混匀。

（19）5%浓缩胶：30%丙烯酰胺溶液0.67ml、双蒸水2.7ml、10%SDS 40μl、APS 40μl、TEMED 4μl，1.5M Tris（PH 6.8）0.5ml，混匀。

（20）p38MAPK阻滞剂（SB203580）：DMSO稀释至成5mg/ml ,分装后－20℃冰箱保存。

（21）NAC溶液：NAC0.196g，溶于400ul的双蒸水中，分装后－20℃冰箱保存。

（22）KN62溶液：1mg KN62溶于1ml乙醇中，分装后于－20℃冰箱保存。

三、方法
1、细胞培养
Jurkat细胞在37℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱，以含10%FBS 的RPMI1640
培养基常规培养。

最初复苏后，3-5天细胞生长至对数期，予换液，此后隔天换液。

2、免疫印迹法（Western-blot）检测MGO对Jurkat细胞RAGE表达的影响
（1）细胞处理
取对数生长期的Jurkat细胞，调节细胞浓度至2×105/ml，加入PHA溶液至终浓度为0.25µg/ml，在无菌6孔细胞培养板中每孔接种2ml细胞悬液，预培养24h。

加入MGO（0、15、30、60μM）作用24h。

（2）总蛋白质的提取
收集处理好的细胞，1500rpm×5min离心，弃上清，用PBS溶液洗涤3次，丢弃上清，吸尽液体。

加入RIPA裂解液60-80ul，在使用前数分钟内加入PMSF （1µlPMSF+100µlRIPA，即1:100比例）。

震荡混匀，于4℃约充分裂解20min。

同时
将低温离心机打开预冷至4℃，以14000rpm离心20min。

吸取上清，移入新的预冷过的EP管，－80℃冰箱保存，备用。

（3）BCA蛋白定量
将BSA标准液用细胞裂解液稀释成浓度不同的标准孔。

2ul待测蛋白样品中加入18ul细胞裂解液稀释后作为待测孔（96孔板）。

根据样品数量，按试剂A:试剂B=50:1，配置BCA工作液充分混匀，室温待用。

每孔加入BCA工作液200μl，振荡混匀，置37℃细胞培养箱30min。

用波长A550 nm酶标仪测定各孔的吸光值。

根据标准管的蛋白浓度和吸光度绘制标准曲线（相关系数大于0.99）。

从标准曲线上读出的待测孔浓度，乘以10倍即为原蛋白样品浓度。

（4）蛋白浓度配平与变性
把提取的各组蛋白配成同一浓度，体积不足者以RIPA裂解液补充，并加入5×上样缓冲液，充分混匀后，于98℃变性5min。

（5）灌胶
安装固定电泳装置，将配好的10%分离胶溶液注入两玻璃板间隙，小心加入薄层双蒸水，以隔绝空气进入凝胶溶液中，室温下静置30min；待分离胶凝固后，吸弃水
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层，再注入配好的5%浓缩胶溶液，插入梳子，不在齿尖留有气泡，静置15min左右，待浓缩胶聚合后上样。

（6）上样
浓缩胶凝固后，将电泳装置放入装有电泳液的槽中，并在内槽中加入电泳液，没过内玻璃板，外槽加入适量的电泳液。

拔去梳子。

依次加入适量Marker及蛋白样品。

一次实验两侧电泳槽上同样40μg的蛋白，一面检测RAGE的表达，一面检测Actin 做为对照。

（7）电泳
接通电源，以30v电压预电泳10min，接着80v直至上样缓冲液（蓝线）至分离胶和浓缩胶的分界线，然后将电压增大至120v，继续电泳至蓝线抵分离胶下缘。

（8）转膜
电泳结束后，根据蛋白分子量切取分离胶，浸泡于电转缓冲液中，剪取同样大小的8张中性滤纸和NC膜，放入电转液中浸泡数分钟后，按阴极：海绵、滤纸、胶、膜、滤纸、海绵、阳极顺序叠放，边缘对齐，赶尽气泡，加入电转液，电转槽放入
周边放满冰袋的大容器中，恒流390mA转膜90min。

（9）剪膜、洗膜
转膜完毕后，取出分离胶及NC膜，胶用考马斯亮蓝染色，丽春红染膜，观察蛋白转移的情况，然后用TBST将膜清洗至颜色完全消退。

（10）封闭
室温下TBST漂洗3次，每次10min，洗净膜上的SDS，5%脱脂奶粉封闭，4℃过夜。

（11）抗体孵育
TBST清洗3次，每次10min，一张膜加入鼠抗人RAGE单克隆抗体1：500），另一张膜加入鼠抗人β-actin单克隆抗体（1：1000）一抗，4℃孵育过夜，TBST清洗3次，每次10min，在辣根过氧化物酶标记山羊抗鼠IgG的（1：1000）二抗中反应1h（室温），TBST清洗3次，每次10min。

（12）化学发光胶片显影
取适量ECL试剂盒A液与等体积B液混合，备用。

将NC膜洗净放在干净的塑料膜上，滤纸吸干水分，滴上AB混合液，合上塑料膜，放入暗盒，关闭灯源，上
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面再放一张X线胶片，压紧，感光2~5min后，Actin曝光2min，RAGE爆光5分钟，胶片依次放入显影液、定影液中冲洗，最后用自来水冲洗干净胶片。

（13）条带分析
晾干的X线胶片，激光扫描仪获取图像，用Image J软件分析灰度值。

结果以目标蛋白灰度值比内参蛋白灰度值表示。

3、ELISA检测RAGE在MGO诱导Jurkat细胞分泌炎症因子中的作用
（1）细胞处理
取对数生长期Jurkat细胞，调节细胞浓度至1×105/ml，加入PHA溶液至终浓度为0.25µg/ml，在无菌24孔细胞培养板中每孔接种1ml细胞悬液，预培养24h。

之后予MGO （0、15、30、60μM）处理24h。

为检测RAGE在MGO诱导Jurkat细胞分泌炎症因子
中的作用，30μM MGO作用前60分钟加入鼠抗人RAGE单克隆抗体（1µg/ml），同时设非特异IgG（1µg/ml）为对照。

处理后的细胞，离心2500×10min，上清液保存于-80℃冰箱，备用。

收集的细胞则按前述方法，加入等量RIPA裂解液，提取总蛋白，并用BCA试剂盒测定蛋白浓度。

（2）ELISA试剂盒检测上清液中炎症因子TNF-α及IFN-γ的含量
①工作原理
该试剂盒是典型的夹心法酶联免疫吸附测定试剂盒。

预先包被的抗体为单克隆抗体，检测相抗体为多克隆抗体，经生物素标记。

样品和生物素标记的抗体先后加入酶标孔板反应后，PBS洗涤。

随后加入过氧化物酶标记的亲和素反应；再经洗涤后用低温3，3′，5，5′-四甲基联苯胺（TMB）显色。

TMB在过氧化物酶的催化下转化为蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。

颜色的深浅和样品中的TNF-α或IFN-γ呈正相关。

②准备试剂
TNF-α或IFN-γ标准品的稀释：在使用前2h内准备。

取1ml样品稀释液加入标准品管内，盖好后静置10min以上，然后反复颠倒/搓动以助溶解，即配置10,000pg/ml 标准品；取0.1ml10,000pg/ml标准品加入有0.9ml样品稀释液的Ep管中，混匀，即配置成了1000pg/ml标准品；取0.3ml1000pg/ml标准品，加入0.3ml样品稀释液，即为500pg/ml，依此配置250pg/ml、125pg/ml、62.5pg/ml、31.3pg/ml、15.6pg/ml。

生物素标记抗人TNF-α或IFN-γ抗体工作液：在使用前2h内准备。

根据每孔需
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要0.1ml并多出1-2孔试剂量计算总的用量后，按1μl生物素标记抗人TNF-α或IFN-γ加抗体稀释液99μl的比例配置工作液，轻轻混匀。

亲和素-过氧化氢酶复合物（ABC）工作液：在使用前1h内准备。

根据每孔需要0.1ml并多出1-2孔试剂量计算总的用量后，按1μlABC工作液加ABC稀释液99μl 的比例配置工作液，轻轻混匀。

③将1000 pg/ml 、500pg/ml 、250pg/ml、125pg/ml、62.5pg/ml、31.3pg/ml、15.6pg/ml 的标准品各0.1ml依次加入一排7孔中，1孔只加样品稀释液的作为零孔。

对于细胞培养上清，直接加已用样品稀释液稀释的样品100μl。

④酶标板上盖，37℃反应60min；反应后用自动洗板机吸去酶标板内的液体；或甩去酶标板内液体，再对着吸水纸拍几下，不洗。

⑤将准备好的生物素抗人TNF-α抗体工作液按每孔0.1ml依次加入（TMB空白显色孔除外）；37℃反应60min；0.01M PBS洗涤3次x 1min左右。

⑥将准备好的ABC工作液按每孔0.1ml依次加入（TMB空白显色孔除外）。

37℃反应30min；0.01M PBS洗涤3次x 1min左右。

⑦按每孔90μl依次加入已在37℃平衡30min的TMB显色液，37℃避光反应12-16min。

⑧按每孔0.1ml依次加入TMB终止液，同加TMB顺序，此时蓝色立转黄色。

⑨用酶标仪波长450nm测定OD值。

设零孔为对照，即所得的吸光值应减去零孔的吸光值。

⑩根据样品的吸光值在坐标上找出对应的浓度，使用EXCEL软件分析结果，结果以细胞因子含量比细胞蛋白含量表示（pg/mg）。

4、免疫印迹法和免疫荧光法检测RAGE在MGO诱导Jurkat细胞CAMK IV 表达中作用
取对数生长期的Jurkat细胞，调节细胞浓度至2×105/ml，加入PHA溶液至终浓度为0.25µg/ml，预培养24h。

加入MGO（0、15、30、60μM）作用24h。

为检测RAGE 在MGO作用下Jurkat细胞CaMKIV 表达中的作用，30μM MGO作用前60分钟加入鼠抗人RAGE单克隆抗体（1µg/ml），同时设非特异IgG（1µg/ml）为对照。

提取总蛋白，定量，进行10%SDS-PAGE电泳。

一次实验两侧电泳槽上同样40μg的蛋白，一面检测CaMKIV的表达，一面检测Actin做为对照。

常规转膜封闭后，一张膜加
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入兔抗人CaMKIV单克隆抗体（1：1000），另一张膜加入鼠抗人β-actin单克隆抗体（1：1000）一抗，4℃孵育过夜，TBST清洗3次，每次10min，在辣根过氧化物酶标记对应IgG的（1：1000）二抗中反应1h（室温），常规ECL检测，CAMK IV显影5min，定影75s; Actin显影2min，定影75s。

结果以目标蛋白灰度值比内参蛋白灰度值表示。

为检测RAGE在MGO诱导Jurkat细胞CaMKIV 蛋白核转位中的作用，取对数生长期Jurkat细胞，调节细胞浓度至1×105/ml，加入PHA溶液至终浓度为0.25µg/ml，在无菌24孔细胞培养板中每孔接种1ml细胞悬液，预培养24h。

予30μM MGO处理0、15、30、60min。

部分实验在30μM MGO作用前60分钟加入鼠抗人RAGE单克隆抗体（1µg/ml），同时设非特异IgG（1µg/ml）为对照。

处理结束后，1500rpm×5min 离心收集细胞，PBS清洗；制备细胞涂片，风干；5%多聚甲醛固定15min，PBS清洗3×5min；0.3%Triton X-100通透10min，PBS清洗3×5min；5%BSA溶液封闭30min；CaMK IV（1：200）一抗孵育过夜，PBST清洗3次×5min；二抗（Dylight488，1：200）室温避光孵育1h，PBS清洗3次×5min；后滴加抗荧光淬灭剂，指甲油封片；
调吸收波长至493nm，发射波长518nm荧光显微镜下观察。

5、免疫印迹法检测RAGE在MGO诱导Jurkat细胞p38MAPK磷酸化中作用
取对数生长期的Jurkat细胞，调节细胞浓度至2×105/ml，加入PHA溶液至终浓度为0.25µg/ml，预培养24h。

加入30μM MGO作用0、15、30、60min。

为检测RAGE 在MGO作用下Jurkat细胞p38MAPK磷酸化中作用，部分实验MGO作用前60分钟加入鼠抗人RAGE单克隆抗体（1µg/ml），同时设非特异IgG（1µg/ml）为对照。

提取总蛋白，定量，进行10%SDS-PAGE电泳。

一次实验两侧电泳槽上同样40μg的蛋白，一面检测磷酸化p38MAPK的表达，一面检测总p38MAPK做为对照。

常规转膜封闭后，一张膜加入兔抗人磷酸化p38MAPK单克隆抗体(1：1000），另一张膜加入鼠抗人总p38MAPK单克隆抗体（1：1000）一抗，4℃孵育过夜，TBST清洗3次，每次10min，在辣根过氧化物酶标记对应IgG的（1：1000）二抗中反应1h（室温），常规ECL检测，磷酸化p38MAPK显影5min，定影75s; 总p38MAPK显影3min，定影75s。

结果以pp38MAPK比p38MAPK灰度值表示。

6 . ELISA检测CaMKIV 和p38MAPK在MGO诱导Jurkat细胞分泌炎症因子中的作用
取对数生长期Jurkat细胞，调节细胞浓度至1×105/ml，加入PHA溶液至终浓度为
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0.25µg/ml，在无菌24孔细胞培养板中每孔接种1ml细胞悬液，预培养24h。

之后予30μM 处理24h。

为检测CaMKIV 和p38MAPK在MGO诱导Jurkat细胞分泌炎症因子中的作用，30μM MGO作用前60分钟加入CaMKIV的抑制剂KN62（10μM），p38MAPK抑制剂（25μM）。

处理后的细胞，离心2500×10min，上清液保存于-80℃冰箱，备用。

收集的细胞则按前述方法，加入等量RIPA裂解液，提取总蛋白，并用BCA试剂盒测定蛋白浓度。

同上应用ELISA试剂盒检测上清液中炎症因子TNF-α及IFN-γ的含量，结果以细胞因子含量比细胞蛋白含量表示（pg/mg）。

四、统计分析方法
采用SPSS16.0软件包进行统计学分析。

所有实验重复3次，常规进行方差齐性检验，实验数据以均数±标准差（s
x ）表示，单变量两组资料之间的比较采用t检验，多组资料之间的比较采用单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

结果
一、W estern Blot检测MGO对PHA预刺激的Jurkat细胞RAGE表达的影响
为检测MGO对Jurkat细胞表面RAGE表达的影响，本实验用不同浓度MGO（0、15、30、60μM ）作用PHA预刺激的Jurkat细胞24h，提取总蛋白，进行Western blot 检测RAGE表达。

结果显示PHA预刺激的Jurkat细胞表达RAGE,而15、30、60μM MGO均能上调RAGE的表达，与MGO未刺激组比较差异均有统计学意义（P<0.05，图1）。

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x±，n=3)
图1Western-Blot检测MGO对Jurkat细胞RAGE表达的影响（s
MGO组与对照组比较﹡P<0.01
x±，n=3)
Fig 1Effects of MGO on the expression of RAGE in Jurkat cells（s
Compared with control group﹡P<0.01
二、ELISA检测RAGE在MGO诱导PHA预刺激的Jurkat细胞分泌TNF-α和IFN-γ
的作用
为检测RAGE在MGO诱导PHA预刺激的Jurkat细胞分泌TNF-α和IFN-γ的作用，本实验用不同浓度MGO（15、30、60μM）作用PHA预刺激的Jurkat细胞24h,ELISA
检测上清TNF-α和IFN-γ的表达。

部分实验在MGO作用前加RAGE抗体预处理。

结果显示15、30、60μM MGO可诱导Jurkat细胞分泌TNF-α和IFN-γ，与对照组比较差异有统计学意义（P <0.05）。

RAGE抗体可明显抑制TNF-α和IFN-γ的表达（P <0.05），而非特异对照IgG不影响MGO诱导Jurkat细胞分泌TNF-α和IFN-γ（P >0.05,图2)。

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x±，n=3)
图2RAGE在MGO诱导Jurkat细胞分泌TNF-a和IFN-γ的影响（s
MGO组与对照组比较* P <0.01; anti-RAGE处理组与30μM MGO组比较# P<0.01
Fig 2 Effects of RAGE on the expression of TNF-a and IFN-γinduced by MGO in Jurkat cells （s
x±，n=3)
MGO group compared with Control group * P <0.01; Anti-RAGE group compared with 30μM MGO group # P <0.01
三、免疫印迹法和免疫荧光法检测RAGE在MGO诱导Jurkat细胞CaMKIV 表达中作用
为检测RAGE在MGO诱导Jurkat细胞CaMKIV 表达中作用，本实验用不同浓度MGO（15、30、60μM）作用PHA预刺激的Jurkat细胞24h, Western blot 测CaMK IV表达；部分实验在MGO作用前加RAGE抗体预处理，设非特异性IgG对照组。