RT-qPCR操作说明书

注意事项
1.以下的Protocol主要适用于（1）所使用的DNA1、反转录酶、RNA
酶抑制剂以及dNTPs均是Fermentas公司的；而在qPCR中，所使用的Supermix是Bio-RAD公司的。

2.RT-qPCR中的注意事项：
（1）MgCl2的浓度2~4mM；
（2）模板的浓度50ng~5pg之间；
（3）引物的浓度，500nM比较合适，若反应效果不好可以在
0.1~1uM之间选择；
（4）退火温度的选择，首次设置比实际小5℃的，之后在1~2℃选择；
（5）引物设计的时候Tm值最好在60℃附近，正反向引物的Tm 的差值在1~2℃之间；
（6）抽提得到的RNA，需要验证RNA的纯度，最好验证一下RNA 的完整性；
（7）在qPCR中，模板的体积要小于总反应体系的10%（主要是模板的加入量会影响反应体系中的MgCl2浓度）；
（8）扩增曲线一定要做。

通常如果有条件也要做退火温度梯度，以获得最佳的退火温度。

另外就是，一块板子上，尽可能
取尽量多的样本，而不是基因；
（9）扩增效率在90~110%的范围内是可以接受的；
（10）内参基因的选择，尽可能选择与靶基因处于同一信号通路
中的内参基因。

3.有关引物设计
（1）扩增子长度小于150bp；
（2）引物Tm的理想值57~60℃；
（3）3’端最后5个碱基里面G或C的含量少于三个；
（4）G C含量介于20~80%，理想值40~60%；
（5）避免引物二聚体及自身二级结构；
（6）避免引物内的自身重复序列；
4.在一个实验中不论是绝对定量还是相对定量都需要做标准曲线，
做标准曲线的方法，以反转录得到的cDNA为模板，用qPCR的引物做PCR得到的产物为模板，产物先稀释10000倍，以稀释后为基底，以10为倍数，稀释7~8个梯度（稀释点越多，稀释倍数越大，数据越精确），做qPCR，然后得到标准曲线。

利用标准曲线可以验证下列因素：
（1）扩增效率；扩增效率 E=10-1/斜率-1
（2）标准品的梯度范围；
（3）P CR抑制剂的存在于影响；
（4）P CR仪验证灵敏度。

注：如果使用反转录的试剂盒，那么从反转录开始则会有试剂盒的使用说明书，之后的步骤都按照说明书来！
RNA抽提
1.收集OD值等于0.2的硫化叶菌（ACVY），清洗细胞！
2.加入1ml的TRIzol，使用移液枪打匀几次！
3.室温下，孵育5min；
4.加入200ul的氯仿（每ml的TRIzol）。

用手剧烈震荡15s，室温
孵育2~3min；
5.≤12,000g，4℃离心15min；
6.小心移取无色相到新的离心管中！
7.RNA沉淀：加入0.5ml的异丙醇（每1ml的TRIzol）。

室温下孵育
10min；≤12,000g，4℃离心15min（通常情况下，离心之前RNA 是可见的）。

8.洗：移去上清，加入1ml的75%的乙醇（每1ml的TRIzol），轻轻
涡旋混匀，≤7500g，4℃离心5min；
9.稍微的风干RNA（不用风干的太狠），使用50ul的RNA-free Water
溶解RNA，用移液枪混匀几次，55~60℃孵育10min，测得浓度，部分溶解的RNA的A260/A280值<1.6.
10.-80℃保存或者是直接使用！
除去RNA中的DNA
1.DNAⅠ处理
37℃条件下孵育60min
2.加入1μl 的50mM的EDTA，之后65℃孵育10min，主要是用于除
去DNA1.
3.将用DNA酶处理之后的RNA做PCR验证，使用荧光定量的引物做
PCR。

主要是用于验证RNA中的DNA有没有除尽！
反转录
第一条cDNA的合成：
轻轻混匀，65℃孵育5min，之后放置在冰上5min；依照下列顺序加入下列物质：
轻轻混匀，并且简单离心，主要是让反应均匀；42℃孵育60min，之后70℃反应10min
RT-qPCR反应
反应体系组成：
Roche LightCycler LC480 Real-Time PCR system
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