希金斯炭疽菌磷酸二酯酶生物信息学分析

希金斯炭疽菌磷酸二酯酶生物信息学分析
韩长志
【摘要】磷酸二酯酶(Pde)在植物病原菌G蛋白信号传导途径上发挥着重要作用.Pde已在栗酒裂殖酵母菌、稻瘟病菌等中有相关报道,然而,对于侵染十字花科植物的希金斯炭疽菌中Pde研究尚不深入.基于酿酒酵母中已经报道的典型Pde序列,利用Blastp以及关键词对炭疽菌蛋白质数据库进行比对、搜索,并通过SMART保守结构域分析.同时,通过对该菌中典型Pde氨基酸序列进行理化性质、疏水性、细胞信号肽、跨膜区结构、亚细胞定位以及二级结构等生物信息学分析,此外,通过对希金斯炭疽菌中的典型Pde与其他物种中的同源序列进行遗传关系比较分析.通过上述生物信息学分析,以期为深入开展Pde定位、功能研究等方面研究,同时,为进一步实现以控制病原菌G蛋白信号途径功能新的药物靶标的开发提供有力的理论支撑.
【期刊名称】《科学技术与工程》
【年(卷),期】2014(014)027
【总页数】5页(P163-167)
【关键词】希金斯炭疽菌;磷酸二酯酶;理化性质;亚细胞定位;二级结构
【作者】韩长志
【作者单位】西南林业大学林学院,云南省森林灾害预警与控制重点实验室,昆明650224
【正文语种】中文
【中图分类】S432.42
希金斯炭疽菌(Colletotrichum higginsanum Sacc.)寄主范围较广[1,2]，主要有菜心、小油菜、大白菜、萝卜等十字花科蔬菜，同时，由于该菌还可以侵染模式植物拟南芥，特别是2012年随着该菌全基因组序列的释放[3]，为研究该菌与拟南芥互作关系提供了非常有利的条件。

在我国，该菌侵染菜心引起的炭疽病是菜心上最常见和发生最严重的病害之一[4]，基于此，对该菌致病基因进行深入研究，有助于解析该菌的侵染机制，为控制该病害化学药剂的开发提供重要的理论基础。

磷酸二酯酶(Pde)在植物病原菌G蛋白信号通路过程中发挥着重要作用，其功能主要在于将cAMP转化为5’-AMP以及将cGMP转化为5’-GMP，从而实现对于信号传递的调节。

cAMP、cGMP均是生物体内普遍存在的感受外界激素和营养信号的第二信使[5]，在生物生命活动中发挥着重要的生化作用。

现已明确酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae中含有2个Pde[6]。

另外，在模式真菌盘基网柄菌[7]以及致病真菌稻瘟菌[8]、禾谷炭疽菌(韩长志，另文已发)等诸多真菌中已见相关报道。

通过深入探析该酶所具有的生物学，有利于更加深入了解病菌信号传导以及致病机制。

本研究创新之处在于利用模式生物S. cerevisiae中已经报道的Pde，通过在炭疽菌属蛋白质数据库中进行Blastp比对分析，以及通过Pde关键词搜索，获得与C.higginsanum中的Pde，并通过对该蛋白的氨基酸序列进行保守结构域分析、理化性质、疏水性分析以及亚细胞定位等生物信息学分析，同时，基于上述发现的Pde氨基酸序列，NCBI在线进行同源序列搜索，通过遗传关系分析，以期为进一步开展同属于炭疽菌属但其基因组序列尚未公布的其他炭疽菌的研究提供重要的理论指导。

1 材料与方法
1.1 材料
根据S.cerevisiae S288c中含有的2个Pde氨基酸序列，利用炭疽菌属蛋白质数
据库在线Blastp比对[9]，所有参数均选择默认值，获得C.higginsanum中所含
有的典型Pde，同时，通过输入“Phosphodiesterases”、“PDEase”等关键词，在上述数据库中进行Pde检索；另外，利用NCBI明确该菌中Pde蛋白质登录号信息。

1.2 方法
1.2.1 保守结构域预测
利用SMART网站在线实现[10]。

1.2.2 蛋白质理化性质及疏水性预测
利用ExPaSy在线进行预测[11]。

1.2.3 蛋白质转运肽及信号肽预测
利用TargetP 1.1 Server、SignalP 3.0 Server在线分析分别实现转运肽的预测[12]、信号肽的预测[13]。

1.2.4 蛋白质二级结构及跨膜区结构预测
采用PHD、TMHMM 2.0 Server在线分析分别实现二级结构[14]、跨膜区结构预测[13]。

1.2.5 亚细胞定位分析
利用ProtComp v9.0实现[15]。

1.2.6 系统进化树构建
通过在NCBI中Blastp同源搜索，获得来自于不同物种的同源蛋白质序列，并利
用ClustalX[16]进行多种比对，采用MEGA 5.2.2中邻近法构建系统进化树，同时，各分支之间的距离计算采用p-distance模型，系统可信度检测采用自举法重复1 000次进行[17]。

2 结果与分析
2.1 C. higginsanum中存在2个Pde
结果显示，C. higginsanum中各存在一个与酿酒酵母Pde1、Pde2同源的序列，其ID为CH063_03640.1、CH063_10269.1，同时，通过保守域分析，结果显示，ScPde1与CH063_03640.1具有相似的保守结构域，ScPde2与
CH063_10269.1具有相同的HDc保守结构域(图1)，基于此，对
CH063_03640.1、CH063_10269.1进行命名为ChPde1、ChPde2(表1)。

此外，利用NCBI保守结构域分析，结果表明，ScPde1与ChPde1均含有PDEase_Ⅱ superfamily保守结构域；ScPde2与ChPde2均含有HDc保守结构域(结果未显示)，这与通过SMART分析结果一致。

图1 ScPde1、ScPde2和ChPde1、ChPde2保守功能域分析Fig.1 Conserved domain of ScPde1, ScPde2 in S. cerevisiae and CgPde1, CgPde2 in C. higginsanum
2.2 氨基酸组成情况
结果表明，S. cerevisiae与C. higginsanum中的Pde在不同类别的氨基酸数量
以及所占比例方面均存在着较大的差异，具体而言，S. cerevisiae中ScPde1、ScPde2所含最高比例的氨基酸均为Leu，所占比例分别为11.70%、11.60%；所含最低比例的氨基酸为均为Trp，所占比例分布为1.10%、1.50%(韩长志，另文
已发)；C. higginsanum中ChPde1、ChPde2所含最高比例的氨基酸分别为Ala、Leu，所占比例分别为9.90%、9.40%；所含最低比例的氨基酸分别为Met、Trp，所占比例均为0.80%(表2)。

表1 希金斯炭疽菌磷酸二酯酶信息Table 1 The information of phosphodiesterasesin C. higginsanumIDCH063_03640.1CH063_10269.1蛋
白质登录号CCF45569.1CCF39435.1氨基酸长度/aa517875基因序列长度/bp2
0782 798获取方法Blastp、关键词Phosphodiesterases、PDEase搜索Blastp、关键词PDEase搜索酿酒酵母同源ScPde1ScPde2文中名称ChPde1ChPde2
表2 ChPde1、ChPde2氨基酸组成情况Table 2 Amino acids composition of ChPde1and ChPde2 in C. higginsanum氨基酸类别氨基酸ChPde1数量所占比例/%ChPde2数量所占比例/%酸性氨基酸Glu (E)326.20536.10Asp
(D)275.20667.50碱性氨基酸Arg (R)295.60576.50Lys (K)173.30394.50His (H)203.90303.40非极性RAla (A)519.90758.60基氨基酸Val
(V)367.00515.80Leu (L)489.30829.40Ile (I)346.60414.70Trp
(W)51.0070.80Met (M)40.80283.20Phe (F)112.10343.90Pro (P)397.50536.10不带电荷的Asn (N)152.90273.10极性R基Cys (C)51.00131.50氨基酸Gln (Q)112.10283.20Gly (G)417.90455.10Ser (S)509.70788.90Thr
(T)316.00536.10Tyr (Y)112.10151.70
2.3 理化性质分析
结果显示，C. higginsanum中Pde理论等电点范围在5.5～6.5，属于酸性范围
内(表3)。

上述Pde在所预测的半衰期较为一致，均为30 h，其稳定性系数尽管
不同，但数值均大于40，同时，总平均亲水性(GRAVY)均为负值，上述结果表明C. higginsanum中的Pde属于亲水性不稳定性蛋白(表3)。

表3 ChPde1、ChPde2氨基酸理化性质Table 3 Amino acid physicochemical properties ofChPde1 and ChPde2 in C. higginsanumChPde1ChPde2相对分
子质量/Da55 302.497 080.9理论等电点5.855.74负电荷氨基酸残基数59119
正电荷氨基酸残基数4696分子式
C2443H3884N692O754S9C4249H6733N1207O1315S41原子数量7 78213 545半衰期/h3030不稳定性系数49.3646.29脂肪族氨基酸指数91.9180.30总平均亲水性-0.171-0.361
2.4 转运肽和信号肽特征
结果表明，C. higginsanum中Pde1、Pde2均显示定位于分泌途径上，其预测值分别为0.930、0.740，而对于预测可靠性方面所处的概率有所不同(表4)。

无论是根据经网络方法进行计算，还是根据隐马可夫模型进行计算，上述2个Pde均不含有信号肽(结果未显示)。

表4 ChPde1、ChPde2含有潜在转运肽的可能性Table 4 The possibility of transit peptide of ChPde1and ChPde2 in C. higginsanum叶绿体转运肽线粒体目标肽分泌途径信号肽定位情况预测可靠性*ChPde10.0480.0950.930—
1ChPde20.1990.0960.740—3
*：1～5，数值越大可靠性越差。

1表示其概率为大于0.8，2表示其概率在0.6～0.8，3表示其概率在0.4～0.6，4表示其概率在0.2～0.4，5表示其概率为小于0.2。

2.5 C. higginsanum中Pde均为亲水性蛋白
通过Protscale预测分析，S. cerevisiae和C. higginsanum不同物种间以及同一物种不同Pde间在亲水性最强氨基酸残基、位置以及疏水性最强氨基酸残基、位置方面均存在着较大差异，有待于今后进一步进行试验验证。

对ChPde1、ChPde2进行疏水性、亲水性数值进
行统计分析，结果显示，上述Pde均属于亲水性蛋白，这与通过GRAVY计算所得结果一致(表5、图2)。

2.6 亚细胞定位特征
结果表明，S. cerevisiae与C. higginsanum中的Pde定位不尽相同，前者中的ScPde1、ScPde2定位相同，均定位于细胞质中(韩长志，另文已发)，而后者中的ChPde1、ChPde2分别定位于细胞质、细胞核中(表6)。

由于Pde作为G蛋白信号通路上重要的效应酶，一般在细胞质中发挥作用，这与ScPde1、ScPde2、
ChPde1定位于细胞质中相一致，然而，预测ChPde2定位于细胞核，其功能有
待于后期进一步研究。

表5 ChPde1、ChPde2疏水性及亲水性氨基酸残基位置情况Table 5 The positions of hydrophobic and hydrophilicamino acid residue of ChPde1
and ChPde2in C. higginsanumChPde1ChPde2亲水性最强氨基酸残基N、EN
位置456、457740数值-1.979-2.779疏水性最强氨基酸残基NA、V位置290191、192数值1.3371.495亲水性氨基酸残基数值总和-159.827-468.514疏水性氨基酸残基数值总和80.203159.908
图2 ScPde1、ScPde2和ChPde1、ChPde2疏水性分析Fig.2 The hydrophobic prediction of ScPde1, ScPde2 in S. cerevisiae and CgPde1, CgPde2 in C. higginsanum表6 ChPde1和ChPde2亚细胞定位情况Table 6 The sub-cellular localization prediction of ChPde1 and ChPde2 in C. higginsanum
核质膜胞外细胞质线粒体内质网过氧化物酶体溶酶体高尔基体液泡
ChPde12.621.020.363.551.670.230.480.050.030ChPde25.040.810.630.971.95 00.090.060.450
2.7 二级结构分析
结果显示，S. cerevisiae与C. higginsanum中的Pde在二级结构组成方面具有
较大的差异性，具体而言，ScPde1含有近乎相同比例的α螺旋，β折叠结构和无规则卷曲三种形式组成，ScPde2则具有较高比例的α螺旋，所占比例为65.0%；ChPde1、ChPde2均具有较高比例的无规卷曲，所占比例分别为44.0%、48.0%，ChPde2具有较高比例的α螺旋(图3)。

图3 ScPde1、ScPde2和ChPde1、ChPde2序列二级结构分析Fig.3 The secondary structure prediction of ScPde1, ScPde2 in S. cerevisiae and
CgPde1, CgPde2 in C. higginsanum
2.8 系统进化树分析
以ChPde1、ChPde2为基础序列，通过在NCBI中Blastp同源性搜索，获得与
上述Pde具有一定同源性的不同物种的氨基酸序列，根据其同源关系数值，选择
8条序列，并结合ScPde1、ScPde2序列，利用MEGA 5.2.2进行系统进化分析，结果表明，ChPde1与禾谷炭疽菌(Colletotrichum graminicola)CgPde1亲缘关系较近，并与同属于炭疽菌属的其他真菌Colletotrichum orbiculare、Colletotrichum gloeosporioides聚为一类；与此相同，ChPde2也与属于与ScPde1同源关系与ChPde2亲缘关系较近，并与同属于炭疽菌属的真菌聚为一类(数据未显示)。

3 讨论
炭疽菌属真菌包括约600个种，可以侵染超过3 200种单子叶植物和双子叶植物[18]。

目前，生产上对该属病菌的防治药剂主要有多菌灵、甲基托布津、苯菌灵等，特别是与C.higginsanum同属的C. gloeosporioides对多菌灵的抗药性受到广
泛关注[19—21]，而生产上尚未有新的有效药剂用于炭疽病的防治。

前人关于Pde的研究多见于对其进行抑制剂的筛选工作[22,23]、基因功能[8]等方面。

随着对G蛋白信号通路众多效应酶研究的不断深入，有关磷酸二酯酶的研究
已在酵母、稻瘟病菌等诸多真菌中相关研究，而对于危害十字花科植物造成严重损失的C.higginsanum的Pde研究尚不够深入，有待于进一步开展以Pde亚细胞
定位、基因功能等相关基础研究。

4 结论
基于模式真菌酿酒酵母中已经报道的ScPde1、ScPde2，利用Blastp以及关键词对炭疽菌属蛋白质数据库进行比对、搜索，共获得2个C.higginsanum的Pde，同时，通过SMART保守结构域分析、理化性质、疏水性分析、细胞信号肽、跨膜
区结构以及二级结构等生物信息学分析，明确S. cerevisiae与C. higginsianum 中的Pde在不同物种间既具有保守性，又具有物种特异性，这与前期通过
S.cerevisiae与C.graminicola中Pde分析结果一致。

此外，通过对ChPde1、ChPde2与其他物种中的同源序列进行遗传关系比较分析，明确其与炭疽菌属真菌C.graminicola亲缘关系最近，为进一步解析其Pde功能提供重要的理论指导。

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