大肠埃希菌的检测

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检验依据： 2010年版«中国药典»二部 附录(fùlù)ⅪJ 微生物限度检查法检验标 准规定：口服制剂细菌数1g不得超过 1000个；1ml不得超过100个。霉菌及酵 母菌数1g不得超过100个。控制菌1g （1ml）不得检出大肠埃希菌。
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注意事项
1．实训过程要严格无菌操作。 2．供试液稀释及注入培养皿时应摇匀再
取，供试液从制备至加入培养基不得超过 1h. 3．配制MUG培养基时，务必调pH，否则 pH偏高，MUG分解，本身则显荧光。 4.培养时间：供试品培养液接种于MUG培 养基中的培养时间，一般在4h、24h 观察 是否产生(chǎnshēng)荧光，如荧光很微弱， 不能准确判断时，该延长培养至48h再观 察结果。
培养基
胨10.0g
硫酸锰0.5mg
硫酸锌0.5mg 硫酸镁0.1g
氯化钠5.0g 氯化钙50.0mg
磷酸二氢钾0.9g 磷酸氢二钠6.2g
亚硫酸钠40.0mg 去氧胆酸钠1.0g
MUG 75mg
水1000mL
除MUG外，取上述成分，混合。微温溶
解，调节(tiáojié)PH7.2-7.4，加入MUG，溶
EMB培养18-24h后，检查有无疑似 大肠埃希菌菌落（大肠埃希菌落形 态特征见表），若无，判供试品未 检出大肠埃希菌；若有，进一步做 培以养下基试验大肠埃希菌落菌形落态形态特征
呈紫黑色、浅紫色、篮紫色或粉红
色，菌落中心呈深紫色或无明显暗色
EMB
中心，圆形，微突起，边缘整齐，表 面光滑，湿润，常有金属光泽。
成吲哚。吲哚的存在可用显色反应表现 出来。吲哚与对二甲基氨基苯醛结合， 形成玫瑰吲哚，为红色化合物。
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伊红美蓝培养基（EMB培养基）
蛋白胨水琼脂培养基100ml，20%乳
糖溶液2ml，2%伊红水溶液2ml，0.5%
美蓝水溶液1ml，将已灭菌的蛋白胨水
琼脂培养基（pH7.6）加热溶化
(rónghuà)，冷却至60℃左右时，再把已
靛基质(jī zhì)（Indole）试验中，大肠埃希菌 能分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚。吲哚 的存在可用显色反应表现出来。吲哚与对二 甲基氨基苯醛结合，形成玫瑰吲哚，为红色 化合物。
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因此根据大肠埃希菌的这一性质，对 MUG呈阳性者，再加对-甲氨基苯甲醛 (jiǎ quán)试剂数滴，轻摇试管，培养液 上层呈现玫瑰红色者(阳性)，报告检出 大肠埃希菌。如果两者都为阴性，报 告未检出大肠埃希菌。如果一阴一阳， 需要进一步的培养和生化试验检查。
若管内培养(péiyǎng)物呈现荧光，为MUG 阳性，不呈现荧光，则为MUG阴性。
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观察后，沿着(yán zhe)培养管的管壁加 入数滴靛基质试液，叶面呈玫瑰红色， 为靛基质阳性，呈试剂本色，为靛基质 阴性。
本底对照应为MUG阴性和靛基质阴性。 靛基质实验原理 某些细菌能分解蛋白胨中的色氨酸，生
灭菌的乳糖溶液，伊红水溶液及美蓝溶
液按上述量以无菌操作加入。摇匀后，
立即倒平板。乳糖在高温灭菌易被破坏
必须严Байду номын сангаас控制灭菌温度，115℃灭菌
20min。
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结果(jiē guǒ)分析：
1.MUG、靛基质结果判断 MUG培养结果：在366nm紫外线下观察 靛基质结果：液面呈玫瑰红色，为靛基质阳
故常来源于人和动物的粪便，所以常 作为粪便污染(wūrǎn)的指标。一旦被 检药物中查出大肠埃希菌，表明该药 品已被粪便污染(wūrǎn)，可能存在肠 道致病菌和寄生虫卵，患者服用该药 物后有引起感染的危险。因此，大肠 埃希菌被列为重要的卫生指标菌。国 家药品卫生标准规定口服药品不得检 出大肠埃希菌。
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检测(jiǎn cè)原理：
中国药典采用了MUG－Indole快速测定药品 中大肠埃希菌。
在MUG试验中，将MUG（4-甲基伞形酮葡糖 苷酸）作为目标菌的基本营养物加入培养基 中，被大肠埃希菌的β-葡萄糖醛酸酶直接分 解产物又作为一种指示系统，在366 nm紫外 光下呈现兰白色荧光，即MUG阳性；若无荧 光，即MUG阴性。
解，每管分装5mL，灭菌。
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实验(shíyàn)步骤：
取供试供试液1mL，直接或处理后接种在 制好的100mL胆盐乳糖培养(péiyǎng)基中, 在37℃恒温箱中培养(péiyǎng)18～24 h， 进行增菌培养(péiyǎng)。
取上述培养(péiyǎng)物0.2mL,接种至含5mL MUG培养(péiyǎng)基的试管内培养 (péiyǎng)，于5小时，24小时在366nm紫外 灯光下观察，同时用未接种的MUG培养 (péiyǎng)基做本底对照。
性；呈试液本色，为靛基质阴性(yīnxìng) MUG阳性、靛基质阳性，判检出大肠杆菌； MUG阴性(yīnxìng)、靛基质阴性(yīnxìng)，
判未检出大肠杆菌； MUG阳性、靛基质阴性(yīnxìng)或MUG阴性
(yīnxìng)、靛基质阳性，需进一步做以下检 查
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2。EMB培养结果(jiē guǒ)判断
伊红美蓝培养基emb培养基?蛋白胨水琼脂培养基100ml20乳糖溶液2ml2伊红水溶液2ml05美蓝水溶液1ml将已灭菌的蛋白胨水琼脂培养基ph76加热溶化冷却至60左右时再把已灭菌的乳糖溶液伊红水溶液及美蓝溶液按上述量以无菌操作加入
大肠(dàcháng)埃希菌 的检测
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检测意义 大肠埃希菌是肠道中存在的正常菌群，
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谢谢(xiè xie) 观看！！
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本方法对大肠埃希菌的检出率达98％。 培养温度：控制菌培养温度为30～
35℃。
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实训器材(qìcái)：
蒸汽灭菌物品： 1.乳糖胆盐发酵(fā jiào)培养基试管10
支 干热灭菌物体： 5mL移液管1支 1mL移液管5支
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流程图：
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甲基伞形酮葡糖苷(tánggān)酸(MUG)