一种从雷公藤中快速大量分离高纯度雷公藤甲素的方法[发明专利]

[19]
中华人民共和国国家知识产权局
[12]发明专利申请公布说明书
[11]公开号CN 101367862A [43]公开日2009年2月18日
[21]申请号200810046163.8[22]申请日2008.09.25
[21]申请号200810046163.8
[71]申请人成都普思生物科技有限公司
地址610045四川省成都市武侯区武科东三路9
附2号
[72]发明人张黎 杨兵 董维臻 夏柯 [74]专利代理机构成都天嘉专利事务所代理人赵丽
[51]Int.CI.C07J 73/00 (2006.01)A61P 29/00 (2006.01)A61P 13/12 (2006.01)
A61P 1/16 (2006.01)
权利要求书 2 页 说明书 5 页 附图 2 页
[54]发明名称
一种从雷公藤中快速大量分离高纯度雷公藤甲素
的方法
[57]摘要
本发明公开了一种从雷公藤中分离纯化雷公藤
甲素单体的工艺方法，它按如下工艺步骤进行：A.
加热提取：乙醇或甲醇温浸后除渣；B.溶剂萃取：
采用有机溶剂萃取提取浓缩液以富集产品；C.色谱
柱层析：用中性氧化铝或者硅胶作为填料，二氯甲
烷－甲醇或者氯仿－甲醇梯度洗脱，分段收集馏分；
D.高效制备液相分离；
E.结晶：采用两相溶剂结晶
法，将分段收集的馏分用石油醚－乙酸乙酯、二氯
甲烷－甲醇或者二氯甲烷－乙酸乙酯结晶，得到纯
度99.5％以上的雷公藤甲素无色针状结晶产品。

本
发明方法简易快速，溶剂消耗少，经济环保，且得
率高，可以一次性制备得到较大量的产品，具有较
高的经济价值和学术价值。

200810046163.8权 利 要 求 书第1/2页 1.一种从雷公藤中分离高纯度雷公藤甲素的方法，其特征在于按如下工艺步骤进行：
A.加热提取：选取粒度为10—60目的雷公藤茎叶粉，按质量比加入5倍量的醇溶剂，于25—65℃加热2—5小时，经过滤除渣，滤液减压回收除去醇溶剂后，得到水悬浮液；
B.溶剂萃取：将步骤A所得水悬浮液，先用2倍体积比的石油醚萃取，水相再用氯仿或者二氯甲烷萃取，各萃取3—5次，每次用量按体积比，均为水悬浮液的3—5倍，石油醚层回收石油醚后弃去，合并氯仿或者二氯甲烷层萃取液，于45—65℃温度下经减压浓缩得到密度为1.26深黄色沉淀；
C.色谱柱层析：将B步骤所得的深黄色沉淀甲醇溶解干法拌样后进行常压色谱柱层析，其中，层析柱填料为氧化铝或者硅胶，粒度为100—400目，色谱直径为5—50cm；梯度洗脱所选用的洗脱剂为二氯甲烷—甲醇或者氯仿—甲醇的混合溶剂，按体积比由高到低，依次按100—5：1的洗脱剂比例，分段收集馏分；
D.高效制备液相分离：将C步骤分段收集的馏分合并后，加入甲醇至刚好溶解，再经高效制备液相分离得到雷公藤甲素半成品；
E.结晶：将D步骤所得雷公藤甲素半成品，采用两相溶剂结晶法进一步纯化得到纯度达99.5％的无色针状结晶产品，所用结晶溶剂为石油醚—乙酸乙酯、二氯甲烷—甲醇或者二氯甲烷—乙酸乙酯组合中的任意一种或者几种。

2.根据权利要求1所述的从雷公藤中分离高纯度雷公藤甲素的方法，其特征在于步骤A所述醇溶剂选自体积百分比浓度为95％的乙醇或100％的甲醇。

3.根据权利要求1所述的从雷公藤中分离高纯度雷公藤甲素的方法，其特征在于步骤A所述雷公藤茎叶粉与醇溶剂的加热温度为55℃。

4.根据权利要求1所述的从雷公藤中分离高纯度雷公藤甲素的方法，其特征在于步骤D所述高效制备液相填料为十八烷基硅烷键合硅胶，柱规格为25cm*10cm或25cm*5cm，色谱条件：检测波长215nm，流动相为甲醇—水或者乙腈—水。

5.根据权利要求4所述的从雷公藤中分离高纯度雷公藤甲素的方法，其特
200810046163.8权 利 要 求 书 第2/2页
征在于所述流动相中甲醇的体积百分比浓度为20—80％。

6.根据权利要求4所述的从雷公藤中分离高纯度雷公藤甲素的方法，其特征在于所述流动相中乙腈的体积百分比浓度为15—45％。

7.根据权利要求1所述的从雷公藤中分离高纯度雷公藤甲素的方法，其特征在于步骤E所述石油醚—乙酸乙酯的体积比为5—1:1。

8.根据权利要求1所述的从雷公藤中分离高纯度雷公藤甲素的方法，其特征在于步骤E所述二氯甲烷—甲醇的体积比为20-10:1。

9.根据权利要求1所述的从雷公藤中分离高纯度雷公藤甲素的方法，其特征在于步骤E所述二氯甲烷—乙酸乙酯的体积比为20-5:1。

200810046163.8说 明 书第1/5页一种从雷公藤中快速大量分离高纯度雷公藤甲素的方法
技术领域
本发明涉及一种从中草药药材中分离活性成分的方法，具体而言，本发明涉及一种从雷公藤中快速大量分离高纯度雷公藤甲素的方法。

背景技术
雷公藤甲素(triptolide)是从卫矛科植物雷公藤Tripterygium wilfordii Hook.f.中分离出的活性最高的环氧化二萜内酯化合物，是雷公藤的主要有效成分之一，其相关效价比雷公藤总苷高100—200倍。

经药理和临床试验表明，其具有确切的免疫抑制、抗炎、抗生育及抗肿瘤等生物活性。

目前，雷公藤多甙片是市场上主要的以雷公藤为原料的制剂，用于类风湿性关节炎，肾病综合症，白塞氏三联症，麻风反应，自身免疫性肝炎等，但是其毒性较大，有效剂量和中毒剂量差别很小，药物的安全性很难控制，其中的单一的最有效成分雷公藤甲素由于可以很好控制剂量，也可作为结构改造的前体，其需求越来越大。

雷公藤甲素在植物中含量极低，目前主要采用常压反复硅胶柱层析进行分离，得率低，不但对操作人员毒性很大，而且有毒溶剂消耗也大。

发明内容
本发明旨在克服上述缺陷，提供一种从雷公藤中快速大量分离高纯度雷公藤甲素的方法。

该方法简便易行、消耗溶剂少、得率高，安全无毒、环保。

为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
一种从雷公藤中快速大量分离高纯度雷公藤甲素的方法，其特征在于按如下工艺步骤进行：
A.加热提取：选取粒度为10—60目的雷公藤茎叶粗粉，按质量比加入5倍量的醇溶剂，于25—65℃加热2—5小时，经过滤除渣，滤液减压回收除去醇溶剂后，得到水悬浮液；
所述醇溶剂选自体积百分比浓度为95％的乙醇或100％的甲醇，优选95％的
乙醇。

所述雷公藤茎叶粗粉的粒度优选20目。

所述雷公藤茎叶粗粉与醇溶剂的加热温度优选55℃。

B.溶剂萃取：将步骤A所得水悬浮液，先用2倍体积比的石油醚萃取，水相再用氯仿或者二氯甲烷萃取，各萃取3—5次，每次用量按体积比，均为水悬浮液的3—5倍，石油醚层回收石油醚后弃去，合并氯仿或者二氯甲烷层萃取液，于45—65℃温度下经减压浓缩得到深黄色沉淀(密度为1.26)。

所述石油醚、氯仿或者二氯甲烷均为分析纯。

C.色谱柱层析：将B步骤所得的深黄色沉淀甲醇溶解干法拌样后进行常压色谱柱层析。

其中，层析柱填料为中性氧化铝或者硅胶，粒度为100—400目；色谱柱规格据分离量而定，直径为5—50cm。

梯度洗脱所选用的洗脱剂为二氯甲烷—甲醇或者氯仿—甲醇的混合溶剂，按体积比由高到低，依次按100—5：1的洗脱剂比例，分段收集馏分。

D.高效制备液相分离：将C步骤分段收集的馏分合并后，加入甲醇至刚好溶解，再经高效制备液相分离得到雷公藤甲素半成品。

所述高效制备液相填料为十八烷基硅烷键合硅胶(C18)，柱规格为25cm*10cm或25cm*5cm，色谱条件：检测波长215nm，流动相为甲醇—水或者乙腈—水，含量都可达90％。

所述流动相中甲醇的体积百分比浓度为20—80％。

所述流动相中乙腈的体积百分比浓度为15—45％。

.E.结晶：将D步骤所得雷公藤甲素半成品，采用两相溶剂结晶法进一步纯化得到纯度达99.5％的无色针状结晶产品。

所用结晶溶剂为石油醚—乙酸乙酯、二氯甲烷—甲醇或者二氯甲烷—乙酸乙酯组合中的任意一种或者几种。

所述石油醚—乙酸乙酯的体积比为5—1:1。

所述二氯甲烷—甲醇的体积比为20-10:1。

所述二氯甲烷—乙酸乙酯的体积比为20-5:1。

本发明的优点在于：
1、步骤少，耗时短，得率高，操作简便，易于工业化生产。

2、溶剂消耗少，提取、萃取、柱层析、制备液相分离等步骤中的溶剂都可回收再利用。

3、所用溶剂毒性较小，层析过程中所用的石油醚、乙酸乙酯、丙酮等，可替代通常柱层析采用的氯仿、甲醇等，安全无毒，环保。

4、经济效益好。

能进行大规模生产，且工序简便，仅包括5个步骤，易于控制，分离效率高。

5、具有较高的学术价值。

目前国内关于雷公藤甲素分离纯化的文献报道都是常规柱层析，高效制备液相色谱用于雷公藤甲素的分离纯化也属首次。

本发明为雷公藤甲素的进一步开发利用提供药理原料、理论和实践支持。

附图说明
图1为本发明B步骤所述HPLC检测图谱
图2为本发明D步骤所述制备分离在线监测图谱
图3为本发明D步骤所述HPLC检测图谱
图4为本发明E步骤所述HPLC检测图谱
具体实施方式
实施例1
一种从雷公藤中快速大量分离高纯度雷公藤甲素的方法，其特征在于按如下工艺步骤进行：
A.加热提取：选取粒度为10目的雷公藤茎叶粗粉30kg，按1：5的质量比加入甲醇，在50℃下加热3小时，经过滤除渣，滤液减压回收除去甲醇后，得到水悬浮液；
B.溶剂萃取：取步骤A所得水悬浮液10L，先用20L石油醚萃取，水相再用30L二氯甲烷萃取，各萃取3次。

石油醚层回收石油醚后弃去，二氯甲烷萃取液合并后50℃浓缩，得到深黄色沉淀(密度为1.26)150g。

C.色谱柱层析：取B步骤深黄色沉淀20g，甲醇溶解干法拌样后进行常压色谱柱层析。

层析柱填料为硅胶，粒度为300—400目。

色谱柱规格为直径5cm。

梯度洗脱，洗脱剂为二氯甲烷—甲醇的混合溶剂，由高到低，依次按100：1，50：1，20：1和5：1，分段收集馏分。

馏分中段雷公藤甲素纯度达50％。

D.高效制备液相分离：将C步骤分段收集的馏分合并后，加入甲醇至刚好溶解，再经高效制备液相分离得到纯度达90％的雷公藤甲素半成品。

所述制备液相填料为十八烷基硅烷键合硅胶(C18)，柱规格为25cm*5cm，色谱条件：检测波长215nm，流动相为乙腈—水(乙腈的体积百分比为19％)。

E.结晶：将D步骤所得雷公藤甲素半成品，采用两相溶剂结晶法进一步纯化得到纯度达99.5％的无色针状结晶产品1g。

所用结晶溶剂为石油醚—乙酸乙酯，其体积比为5:1。

实施例2
一种从雷公藤中快速大量分离高纯度雷公藤甲素的方法，其特征在于按如下工艺步骤进行：
A.加热提取：选取粒度为20目的雷公藤茎叶粗粉500kg，按1：5的质量比加入95％的乙醇，在55℃下加热3小时，经过滤除渣，滤液减压回收除去乙醇后，得到水悬浮液；
B.溶剂萃取：取步骤A所得水悬浮液500L，先用1000L石油醚萃取，水相再用1500L二氯甲烷萃取，各萃取5次。

石油醚层回收石油醚后弃去，二氯甲烷萃取液合并后55℃浓缩，得到深黄色沉淀9000g(密度为1.26)。

C.色谱柱层析：取B步骤深黄色沉淀9000g甲醇溶解干法拌样后进行常压色谱柱层析。

层析柱填料为硅胶，粒度为100—200目。

色谱柱规格为直径50cm。

梯度洗脱，洗脱剂为氯仿—甲醇的混合溶剂，由高到低，依次按100：1，50：1，20：1和5：1，分段收集馏分。

馏分中段雷公藤甲素纯度达50％以上、前段和后段中雷公藤甲素纯度为10％—30％。

D.高效制备液相分离：将C步骤分段收集的馏分合并后，加入甲醇至刚好溶解，再经高效制备液相分离得到雷公藤甲素半成品。

所述制备液相填料为十八烷基硅烷键合硅胶(C18)，柱规格为25cm*20cm，色谱条件：检测波长215nm，流动相为甲醇—水(甲醇的体积百分比浓度为40％)。

E.结晶：将D步骤所得雷公藤甲素半成品，采用两相溶剂结晶法进一步纯化得到纯度达99.5％的无色针状结晶产品20g。

所用结晶溶剂选用二氯甲烷—乙酸乙酯，其体积比为4:1。

200810046163.8说 明 书 附 图第1/2页
图1
图2
200810046163.8说 明 书 附 图 第2/2页
图3
图4。