大连In-Fusion Cloning
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In-Fusion反应液是不会将其环化的，除非载体末端带有相同的15 nt同源性碱基。
建立In-Fusion应体系
3.线性化载体的纯化必须胶回收，低电压运行，确保线性分子和环状分子载体彻底分离。
转化感受态细胞 插入片段确认
反向PCR扩增
1.当找不到合适的酶切位点，可以采用反向PCR的方法。 2.同时这也是一种突变的方法（缺失，插入，点突变）。 3.引物设计时，15 nt悬挂的同源碱基可以来源于插入片段。 4.为了保证载体骨架完整性，推荐使用高保真酶，如CloneAmp HiFi PCR Premix（639298）。
7
Q2：引物合成的纯化方式和修饰要求？ A2：脱盐处理即可，较长引物可以PAGE纯化。 3’-OH，而5’无需磷酸化处理。
Q4：引物 除了15 bp的同源序列和目的基因的特异 性序列，还可以包含其它的序列？
A4：可以，在15 bp同源序列之后引入其它适当序 列，用于酶切位点构建、读码框的完整性和融合标 签。15 bp+其它序列+GSP序列。
规格
10 rxns 50 rxns 100rxns 10 rxns 50 rxns 100rxns
Cloning Enhancer
Nucleo -Spin
Stellar Competent Cells
CloneAMP HiFiPCR Premix
Lyophilized
√ √ √ √ √ √ √ √ √ √
推荐5:1或者10:1；插入片段50-100 bp时，推荐10:1或者 50:1。
A5：50 bp-15 kb，8-15 kb的克隆效率可能会 下降。
Q7：PCR产物如何纯化？
A7：如果PCR产物电泳检测显示单一条带，可以采用Cloning Enhancer（639613）处理； 小于350 bp的PCR产物，建议采用Cloning Enhancer（639613）处理； 如果PCR产物含有非特异性背景，请采用切胶方式分离目的片段回收纯化，推荐NucleoSpin Gel and PCR Clean-up（740609）。
/CN/Products/Cloning_and_Competent_Cells/Cloning_Resources/P rimer_Design_Tutorial/Primer_Design_Overview?sitex=10022:22372:US
A7：阅读框由引物序列决定，可以在15 bp同源序列之后，特异性序列之前添加1-2个碱基来保证读码 框完整性。
6
In-Fusion HD Cloning FAQs
Primer Design
Q1：同源序列必须是15 bp吗？ A1：推荐同源序列碱基为15 bp，小于12或者大 于20 bp的克隆效率会降低。根据经验，多片段 克隆，20 bp的同源性序列，效率会更好一些。 Q3：15 bp同源序列必须与载体末端完全契合吗？ A3：是的，必须与载体末端的15 bp完全契合， 如果不完全相同或者错开几个碱基，In-Fusion反 应可能无法进行，克隆效率也无法保证。 Q5：引物设计的基本原则？ A5：1.目的片段特异性序列设计在3’端，长度18-25 nt，Tm值58-65℃，上下游的∣Tm∣≤4℃，GC 含量40-60%，3’端最后5个碱基不要超过2个G or C。 2.15 nt同源性序列设计在5’端，与线性化载体末端同源。 载体为酶切获得，同源序列包含载体末端的5’端悬挂序列，而不是3’端悬挂序列。 载体为高保真酶PCR扩增获得，同源序列与线性载体末端同源。 3.OligoAnalyzer 3.1（IDT：/calc/analyzer）分析Tm值，默认的Na+ （50 mM），Mg2+（0 mM）和dNTP（0 mM）浓度。
In-Fusion® HD Cloning Kit w/NucleoSpin
In-Fusion® HD Cloning Kit w/Cloning Enhancer In-Fusion® HD Cloning System In-Fusion® HD Cloning System CE In-Fusion® HD Cloning Plus In-Fusion® HD Cloning Plus CE In-Fusion® HD EcoDry™ Cloning Plus
In-Fusion Cloning
宝生物工程（大连）有限公司 营销部 2015.8
主要内容
1 2
3 4 5
In-Fusion原理
In-Fusion特点
In-Fusion应用
In-Fusion FAQ & Tips
In-Fusion实验例
2
In-Fusion原理
50 ℃，15 min单管反应
In-Fusion酶
由于E.coli 的低水平重组功能，背景白斑大概不 到5%。
A5：采用转化效率超过108 cfu/μg的高效感受态细胞，推荐Stellar Competent Cells（636763）；扩增获得的 PCR产物必须纯化除去剩余dNTP；最好使用商品化纯化试剂盒；合成高质量引物确保同源序列正确性。
8
In-Fusion HD Cloning FAQs
电转化，1 μl反应液的稀释液（1:5）+50 μl 细胞.
Q2：单次In-Fusion反应中，阴性对照有多少克隆？ A2：Negative Control：1
μl pUC19 Control Vector （Linearized）+ 2 μl 5×In-Fusion HD Enzyme + 7 μl dH2O，
高效：阳性克隆率最高95%以上
方便性：多片段克隆，单管操作，一次反应 优化套装组合：各种套装，自由选择
4
In-Fusion应用
多片段克隆 插入突变位点
应用
构建载体模型 高通量克隆
5
In-Fusion HD Cloning FAQs
General Questions
Q1：如何选择PCR聚合酶？ Q2：In-Fusion Enzyme稳定性如何？
In-Fusion HD Cloning Tips
载体线性化
酶切处理
In-Fusion引物设计
1.单酶切或者双酶切。双酶切效果好于单酶切，请按照限制酶的供应商说明书操作酶切；线性 载体末端的完整性很重要，建议使用高质量的限制性内切酶，建议时间控制在几个小时以内。
目的基因片段扩增
2.不必去磷酸处理。
9
In-Fusion HD Cloning Tips
试剂选择指南，各种套装组合
产品名称 In-Fusion® HD Cloning Kit In-Fusion® HD Cloning Kit w/Competent Cells Cat No.
639648 639649 639650 639642 639643 639644
In-Fusion HD Cloning FAQs
Transformation
Q1：采用超过说明书推荐的In-Fusion反应液转化 感受态细胞，会获得更多的克隆吗？ A1：回答是否定的。过多的In-Fusion反应液对 于某些大肠杆菌是有毒性的，50 μl感受态加入 反应液量不要超过5 μl。 标准转化体系如下：化学转化，2.5 μl反应液+50 μl 细胞；
11
In-Fusion HD Cloning Tips
载体线性化 1.手动设计，请遵循引物设计原则。 2.使用在线工具：
/US/Support/xxclt_onlineToolsLoad.jsp?citemId=https://www.takar a-bio.co.jp/infusion_primer/infusion_primer_form.php§ion=16260&xxheight=1800
A2：升级后的产品（639648）可以在-20℃稳定 保存，而EcoDry（638912）可以室温稳定保存。 Q4：任何载体都适用In-Fusion吗？
A4：是的，最大做过的cosmid为46 kb，不过对 于超过10 kb的载体克隆效率会降低。 Q6：In-Fusion会引入序列错误吗？ A6：不会。目前没有发现采用In-Fusion而产生碱 基滑动、碱基添加和碱基缺失现象。超过4,000个 克隆测序结果显示克隆位点处几乎无任何错误。 大多数错误是由于引物合成错误导致。
10 rxns 50 rxns 100rxns 10 rxns 50 rxns 100rxns 10 rxns 50 rxns 100rxns 10 rxns 50 rxns 100rxns 10 rxns 50 rxns 100rxns 96 rxns 8 rxns 24rxns
√
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10
平板应该有很少的克隆。通常情况下，蓝斑数量 ≤5个，白斑数量根据菌株不同而不同。
Q3：不建议使用的感受态细胞有哪些？ A3：In-Fusion反应产物可能存在不稳定性，因此 不适用于不稳定DNA克隆的感受态细胞不推荐使 用，例如TOP10或者衍生类细胞（ccdB Survival 2T1R E.coli）及其它相关菌株（DH10B，MC1061）。 Q5：如何转化效率和整体克隆效率？
In-Fusion Enzyme mix具有3’外切酶活性，可以在克隆片段和载体的5’末端产生大约15 nt单链 悬挂末端。单链悬挂末端在同源处退火，重组环状链在E.coli中得到重组。
3
In-Fusion特点
选择In-Fusion的理由
第四代 产品
开放性：任何载体，任何酶切位点，任何位置 无缝克隆：无任何附加冗余序列 快速：15分钟反应
A1：任何PCR聚合酶均可，最好使用高保真聚合 酶。
Q3：载体和插入DNA片段的末端结构有何限制？ A3：没有特殊的限制，粘性末端、平滑末端、有无 “A”尾末端，磷酸化及非磷酸化末端都可以。 Q5：是否可以单次反应中克隆多重片段？ A5：可以通过单次反应对多个片段进行克隆，这是 多片段克隆的有效方法。多片段克隆，经过成功验 证最多插入5个片段，阳性克隆效率比单片段克隆 效率低，需要筛选更多的克隆来获得目标产物。 Q7：In-Fusion克隆方法会导致阅读框改变吗？
Vector & Insert Preparation
Q1：线性化载体是否需要去磷酸化处理？ A1：不需要，去磷酸化处理并不利于克隆反应， 而且对DNA末端有损伤，因此不推荐。 Q3：线性载体如何获得？ A3：单酶切或者双酶切后回收纯化；高保真聚合 酶反向PCR扩增后纯化。 Q5：插入片段大小范围是多少？ Q2：In-Fusion系统可以克隆的最大载体为多少？ A2：适合任何载体，载体最大为46 kb，但是超过 10 kb克隆效率会下降。 Q4：由Taq酶导入的A尾PCR产物，是否有影响？ A4：没有影响，也不会影响读码框。为了保证 PCR产物的正确性，推荐使用高保真酶。 Q6：载体与插入片段摩尔比例关系是多少？ A6：推荐插入片段：载体=2:1；插入片段100-300 bp时，
639639 639640 639641
639633 639634 639635 639645 639646 639647 639636 639637 639638 638909 638910 638911 638916 638917 638918 638919 638912 638913
10 rxns 50 rxns 100rxns
In-Fusion引物设计
2.片段/载体的六种组合方式：
• • • • • •
目的基因片段扩增
建立In-Fusion应体系
使用操作方法，请见：
单片段与限制酶酶切的线性化载体 单片段与反向PCR的线性化载体 单片段与已经线性化处理的载体 多片段与限制酶酶切的线性化载体 多片段与反向PCR的线性化载体 多片段与已经线性化处理的载体
Q4：单次In-Fusion反应中，阳性对照有多少克隆？ A4：Possitive Control：2
μl 2 kb Control Insert + 1 μl pUC19 Control Vector（Linearized）+ 2 μl 5×In-Fusion
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
HD Enzyme + 5 μl dH2O，平板上通常生长几百个白斑，
建立In-Fusion应体系
3.线性化载体的纯化必须胶回收，低电压运行，确保线性分子和环状分子载体彻底分离。
转化感受态细胞 插入片段确认
反向PCR扩增
1.当找不到合适的酶切位点，可以采用反向PCR的方法。 2.同时这也是一种突变的方法（缺失，插入，点突变）。 3.引物设计时，15 nt悬挂的同源碱基可以来源于插入片段。 4.为了保证载体骨架完整性，推荐使用高保真酶，如CloneAmp HiFi PCR Premix（639298）。
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Q2：引物合成的纯化方式和修饰要求？ A2：脱盐处理即可，较长引物可以PAGE纯化。 3’-OH，而5’无需磷酸化处理。
Q4：引物 除了15 bp的同源序列和目的基因的特异 性序列，还可以包含其它的序列？
A4：可以，在15 bp同源序列之后引入其它适当序 列，用于酶切位点构建、读码框的完整性和融合标 签。15 bp+其它序列+GSP序列。
规格
10 rxns 50 rxns 100rxns 10 rxns 50 rxns 100rxns
Cloning Enhancer
Nucleo -Spin
Stellar Competent Cells
CloneAMP HiFiPCR Premix
Lyophilized
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推荐5:1或者10:1；插入片段50-100 bp时，推荐10:1或者 50:1。
A5：50 bp-15 kb，8-15 kb的克隆效率可能会 下降。
Q7：PCR产物如何纯化？
A7：如果PCR产物电泳检测显示单一条带，可以采用Cloning Enhancer（639613）处理； 小于350 bp的PCR产物，建议采用Cloning Enhancer（639613）处理； 如果PCR产物含有非特异性背景，请采用切胶方式分离目的片段回收纯化，推荐NucleoSpin Gel and PCR Clean-up（740609）。
/CN/Products/Cloning_and_Competent_Cells/Cloning_Resources/P rimer_Design_Tutorial/Primer_Design_Overview?sitex=10022:22372:US
A7：阅读框由引物序列决定，可以在15 bp同源序列之后，特异性序列之前添加1-2个碱基来保证读码 框完整性。
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In-Fusion HD Cloning FAQs
Primer Design
Q1：同源序列必须是15 bp吗？ A1：推荐同源序列碱基为15 bp，小于12或者大 于20 bp的克隆效率会降低。根据经验，多片段 克隆，20 bp的同源性序列，效率会更好一些。 Q3：15 bp同源序列必须与载体末端完全契合吗？ A3：是的，必须与载体末端的15 bp完全契合， 如果不完全相同或者错开几个碱基，In-Fusion反 应可能无法进行，克隆效率也无法保证。 Q5：引物设计的基本原则？ A5：1.目的片段特异性序列设计在3’端，长度18-25 nt，Tm值58-65℃，上下游的∣Tm∣≤4℃，GC 含量40-60%，3’端最后5个碱基不要超过2个G or C。 2.15 nt同源性序列设计在5’端，与线性化载体末端同源。 载体为酶切获得，同源序列包含载体末端的5’端悬挂序列，而不是3’端悬挂序列。 载体为高保真酶PCR扩增获得，同源序列与线性载体末端同源。 3.OligoAnalyzer 3.1（IDT：/calc/analyzer）分析Tm值，默认的Na+ （50 mM），Mg2+（0 mM）和dNTP（0 mM）浓度。
In-Fusion® HD Cloning Kit w/NucleoSpin
In-Fusion® HD Cloning Kit w/Cloning Enhancer In-Fusion® HD Cloning System In-Fusion® HD Cloning System CE In-Fusion® HD Cloning Plus In-Fusion® HD Cloning Plus CE In-Fusion® HD EcoDry™ Cloning Plus
In-Fusion Cloning
宝生物工程（大连）有限公司 营销部 2015.8
主要内容
1 2
3 4 5
In-Fusion原理
In-Fusion特点
In-Fusion应用
In-Fusion FAQ & Tips
In-Fusion实验例
2
In-Fusion原理
50 ℃，15 min单管反应
In-Fusion酶
由于E.coli 的低水平重组功能，背景白斑大概不 到5%。
A5：采用转化效率超过108 cfu/μg的高效感受态细胞，推荐Stellar Competent Cells（636763）；扩增获得的 PCR产物必须纯化除去剩余dNTP；最好使用商品化纯化试剂盒；合成高质量引物确保同源序列正确性。
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In-Fusion HD Cloning FAQs
电转化，1 μl反应液的稀释液（1:5）+50 μl 细胞.
Q2：单次In-Fusion反应中，阴性对照有多少克隆？ A2：Negative Control：1
μl pUC19 Control Vector （Linearized）+ 2 μl 5×In-Fusion HD Enzyme + 7 μl dH2O，
高效：阳性克隆率最高95%以上
方便性：多片段克隆，单管操作，一次反应 优化套装组合：各种套装，自由选择
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In-Fusion应用
多片段克隆 插入突变位点
应用
构建载体模型 高通量克隆
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In-Fusion HD Cloning FAQs
General Questions
Q1：如何选择PCR聚合酶？ Q2：In-Fusion Enzyme稳定性如何？
In-Fusion HD Cloning Tips
载体线性化
酶切处理
In-Fusion引物设计
1.单酶切或者双酶切。双酶切效果好于单酶切，请按照限制酶的供应商说明书操作酶切；线性 载体末端的完整性很重要，建议使用高质量的限制性内切酶，建议时间控制在几个小时以内。
目的基因片段扩增
2.不必去磷酸处理。
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In-Fusion HD Cloning Tips
试剂选择指南，各种套装组合
产品名称 In-Fusion® HD Cloning Kit In-Fusion® HD Cloning Kit w/Competent Cells Cat No.
639648 639649 639650 639642 639643 639644
In-Fusion HD Cloning FAQs
Transformation
Q1：采用超过说明书推荐的In-Fusion反应液转化 感受态细胞，会获得更多的克隆吗？ A1：回答是否定的。过多的In-Fusion反应液对 于某些大肠杆菌是有毒性的，50 μl感受态加入 反应液量不要超过5 μl。 标准转化体系如下：化学转化，2.5 μl反应液+50 μl 细胞；
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In-Fusion HD Cloning Tips
载体线性化 1.手动设计，请遵循引物设计原则。 2.使用在线工具：
/US/Support/xxclt_onlineToolsLoad.jsp?citemId=https://www.takar a-bio.co.jp/infusion_primer/infusion_primer_form.php§ion=16260&xxheight=1800
A2：升级后的产品（639648）可以在-20℃稳定 保存，而EcoDry（638912）可以室温稳定保存。 Q4：任何载体都适用In-Fusion吗？
A4：是的，最大做过的cosmid为46 kb，不过对 于超过10 kb的载体克隆效率会降低。 Q6：In-Fusion会引入序列错误吗？ A6：不会。目前没有发现采用In-Fusion而产生碱 基滑动、碱基添加和碱基缺失现象。超过4,000个 克隆测序结果显示克隆位点处几乎无任何错误。 大多数错误是由于引物合成错误导致。
10 rxns 50 rxns 100rxns 10 rxns 50 rxns 100rxns 10 rxns 50 rxns 100rxns 10 rxns 50 rxns 100rxns 10 rxns 50 rxns 100rxns 96 rxns 8 rxns 24rxns
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平板应该有很少的克隆。通常情况下，蓝斑数量 ≤5个，白斑数量根据菌株不同而不同。
Q3：不建议使用的感受态细胞有哪些？ A3：In-Fusion反应产物可能存在不稳定性，因此 不适用于不稳定DNA克隆的感受态细胞不推荐使 用，例如TOP10或者衍生类细胞（ccdB Survival 2T1R E.coli）及其它相关菌株（DH10B，MC1061）。 Q5：如何转化效率和整体克隆效率？
In-Fusion Enzyme mix具有3’外切酶活性，可以在克隆片段和载体的5’末端产生大约15 nt单链 悬挂末端。单链悬挂末端在同源处退火，重组环状链在E.coli中得到重组。
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In-Fusion特点
选择In-Fusion的理由
第四代 产品
开放性：任何载体，任何酶切位点，任何位置 无缝克隆：无任何附加冗余序列 快速：15分钟反应
A1：任何PCR聚合酶均可，最好使用高保真聚合 酶。
Q3：载体和插入DNA片段的末端结构有何限制？ A3：没有特殊的限制，粘性末端、平滑末端、有无 “A”尾末端，磷酸化及非磷酸化末端都可以。 Q5：是否可以单次反应中克隆多重片段？ A5：可以通过单次反应对多个片段进行克隆，这是 多片段克隆的有效方法。多片段克隆，经过成功验 证最多插入5个片段，阳性克隆效率比单片段克隆 效率低，需要筛选更多的克隆来获得目标产物。 Q7：In-Fusion克隆方法会导致阅读框改变吗？
Vector & Insert Preparation
Q1：线性化载体是否需要去磷酸化处理？ A1：不需要，去磷酸化处理并不利于克隆反应， 而且对DNA末端有损伤，因此不推荐。 Q3：线性载体如何获得？ A3：单酶切或者双酶切后回收纯化；高保真聚合 酶反向PCR扩增后纯化。 Q5：插入片段大小范围是多少？ Q2：In-Fusion系统可以克隆的最大载体为多少？ A2：适合任何载体，载体最大为46 kb，但是超过 10 kb克隆效率会下降。 Q4：由Taq酶导入的A尾PCR产物，是否有影响？ A4：没有影响，也不会影响读码框。为了保证 PCR产物的正确性，推荐使用高保真酶。 Q6：载体与插入片段摩尔比例关系是多少？ A6：推荐插入片段：载体=2:1；插入片段100-300 bp时，
639639 639640 639641
639633 639634 639635 639645 639646 639647 639636 639637 639638 638909 638910 638911 638916 638917 638918 638919 638912 638913
10 rxns 50 rxns 100rxns
In-Fusion引物设计
2.片段/载体的六种组合方式：
• • • • • •
目的基因片段扩增
建立In-Fusion应体系
使用操作方法，请见：
单片段与限制酶酶切的线性化载体 单片段与反向PCR的线性化载体 单片段与已经线性化处理的载体 多片段与限制酶酶切的线性化载体 多片段与反向PCR的线性化载体 多片段与已经线性化处理的载体
Q4：单次In-Fusion反应中，阳性对照有多少克隆？ A4：Possitive Control：2
μl 2 kb Control Insert + 1 μl pUC19 Control Vector（Linearized）+ 2 μl 5×In-Fusion
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
HD Enzyme + 5 μl dH2O，平板上通常生长几百个白斑，