液相色谱柱的清洗(借鉴内容)
液相色谱柱子使用及保养
专用色谱柱∶样品及溶剂的要求
记 住 ∶ 拿 到 一 根 从 未 用 过 的 色 谱 柱 时 一 定 要 先 看 其 使 用 说 明 ！
色谱柱的保养（一）
样品方面 除去微粒及杂质 了解样品在流动相中的溶解度
如样品的溶剂不是流动相，一定要用流动相试溶解度，防止 其在流动相中析出
了解样品与色谱柱的基质/填料是否相互作用
硅 胶 的 溶 解 曲 线
填料新的键合技术 - PH范围 2-12
- 稳定性好，使用寿命长
1 2 3 4 5 6 7 8 9 p H
良好的色谱实验习惯
拿到一根新色谱柱时，先测柱效 保留在新色谱柱上测得的色谱图，并记录条件 定期检测柱效
色谱柱的使用及操作
流动相的转换 特别是GPC柱 流速(压力)的变化幅度 温度的变化幅度
色谱柱的保养（二）
流动相方面 除去微粒 纯度的要求
超纯水，梯度实验时水中有机杂质含量要低（建议走空白检验） 缓冲液的pH值，在填料的允许范围内 缓冲液（盐）的浓度 溶剂：色谱纯，并与填料相匹配 溶剂中的杂质含量 注意溶剂的相容性，避免使用不相容的溶剂
流动相对样品的溶解度
有机溶剂或水的比例
2）如果柱头塌陷较深（小于1cm）可逐渐减低流速至零，
再次拆下柱子，用填料修补直到塌陷填满为止。
色谱柱的存放
存放前的处理 除去杂质、盐等，防止细菌生长 合适的存放溶剂 两端密封保存，避免色谱柱床干枯
液相色谱柱清洗活化再生
1.色谱柱的活化30个柱体积，然后用甲醇/乙腈：水（50:50）冲洗10个柱体积，然后再用流动相平衡30柱体积。
=9：1冲洗30倍柱体积，再流动相平衡30个柱体积。
100%甲醇或乙腈冲洗30个柱体积，然后转换到流动相平衡。
用于反相色谱时，先用异丙醇或乙醇冲洗色谱柱50-100个柱体积，然后用甲醇/乙腈：水（50:50）冲洗10个柱体积，然后再用流动相平衡30柱体积。
50倍柱体积50/50乙腈/水活化平衡，然后再用流动相平衡30柱体积。
2.色谱柱的清洗保存和再生清洗：如使用缓冲盐，先用高比例水相冲洗30个柱体积，然后再转换到80%有机相冲洗30个柱体积。
再生：用95%水，甲醇，异丙醇，甲醇，95%水分别冲洗30个柱体积，在第一次用95%水时，进样10次100 μL DMSO。
清洗：100%乙醇0.3ml/min 3h，再用正己烷：异丙醇=9：1冲洗30倍柱体积并保存。
再生：根据不同类型正相柱选择。
[常规正己烷/异丙醇的柱子，乙醇（0.1%三氟乙酸）0.3ml/min 3h，乙醇0.3ml/min 3h，乙醇（0.1%二乙胺）0.3ml/min 3h，乙醇0.3ml/min 3h，正己烷：异丙醇=9：1冲洗30倍柱体积]清洗：用100%水冲洗30个柱体积去除盐，然后用100%甲醇或乙腈冲洗30个柱体积后保存在50%甲醇或乙腈中。
再生：先用高浓度盐的缓冲液清洗（浓度可以是5-10倍，不超过1M），然后再用100%水洗，50%乙腈或甲醇保存。
清洗：反相使用时同反相C18色谱柱，如短期不用，可用95%甲醇或乙腈保存;长期不用时需用异丙醇置换，最后用正己烷保存。
再生: NH2柱用于反相条件时，NH2键会水解，先用含1.0%NH3的乙腈-水(50:50)溶液冲洗30个柱体积，乙腈-水(50:50)冲洗30个柱体积，95%水/5%乙腈冲洗30个柱体积，异丙醇冲洗30个柱体积，95%乙腈/5%水冲洗30个柱体积并保存。
色谱柱冲洗方法
色谱柱冲洗方法（最新版4篇）篇1 目录1.色谱柱冲洗的必要性2.色谱柱冲洗的方法2.1 水冲洗法2.2 有机溶剂冲洗法2.3 缓冲盐冲洗法2.4 反冲法3.色谱柱冲洗的注意事项篇1正文色谱柱是液相色谱系统中的核心部件，它在样品分离过程中起着至关重要的作用。
然而，在色谱柱使用过程中，柱内可能会积累一些脏物或盐析物，影响色谱柱的分离效果。
因此，对色谱柱进行定期冲洗是非常必要的。
下面我们将介绍几种常见的色谱柱冲洗方法。
首先，水冲洗法是最常用的色谱柱冲洗方法。
此方法操作简便，只需将色谱柱连接到水流系统上，使用纯水进行冲洗。
篇2 目录一、色谱柱冲洗的必要性二、色谱柱冲洗的方法1.水冲洗法2.纯有机相冲洗法3.缓冲盐冲洗法4.反冲法5.专用清洗剂冲洗法三、不同类型色谱柱的冲洗方法1.反相色谱柱2.正相色谱柱3.离子交换色谱柱4.凝胶渗透色谱柱四、色谱柱冲洗的注意事项篇2正文色谱柱是高效液相色谱系统中的核心部件，其在样品分离过程中起到关键作用。
然而，在长时间的使用过程中，色谱柱内部可能会积累一些脏物，影响色谱柱的分离效果。
因此，对色谱柱进行定期冲洗是非常必要的。
色谱柱冲洗的方法有很多种，下面我们分别进行介绍：1.水冲洗法：这是一种最常用的色谱柱冲洗方法。
使用纯水或含有少量缓冲盐的水进行冲洗，可以有效去除色谱柱内部的脏物。
对于反相色谱柱，可以使用纯水或甲醇/水混合溶液进行冲洗。
2.纯有机相冲洗法：在冲洗色谱柱时，可以使用纯有机溶剂（如乙腈、甲醇等）来代替水相。
这种方法适用于具有疏水性的色谱柱，如 C18、C8 等。
3.缓冲盐冲洗法：在冲洗过程中，可以加入一定浓度的缓冲盐，以保持色谱柱内部的离子强度。
这种方法适用于离子交换色谱柱和凝胶渗透色谱柱。
4.反冲法：这是一种比较彻底的冲洗方法，可以有效去除色谱柱内部的沉淀物。
在反冲过程中，需要将色谱柱的流动相改为反向，并提高流速。
然而，反冲过程可能会对色谱柱造成一定程度的损伤，因此需要谨慎操作。
液相色谱实用技术(二)液相色谱柱的使用及保养
液相色谱实用技术（二）色谱柱的使用及保养色谱柱与仪器的联接❀不同公司的色谱柱接头不同。
处理不当时,会造成：✎色谱峰展宽(死体积)致使柱效下降或渗漏❀解决办法∶✎自制相应的转换接头✎使用“通用”型接头（锥箍及螺母）➠这种锥箍在不锈钢管上是活动的，即stop-depth的长度可调。
因此可以换接不同的色谱系统及色谱柱。
从WatersPhase Separations公司能得到一些PEEK工程塑料的接头,可用在各种类型的色谱柱上。
色谱柱的联接❀各种锥箍和管路接头长度示意图:色谱柱的联接❀Stop_depth长度不合适造成柱前死体积色谱柱的联接❀锥箍锥度不合适造成渗漏:Waters色谱柱的联接❀Waters及Phase Separations锥箍及螺母相同，但锥箍前露出的不锈钢管长度不同✎其长度被称为：“stop-depth”❀Waters除Spherisorb以外的各种品牌的色谱柱用的是“Waters”标准，其stop-depth的长度为0.130英吋❀Spherisorb品牌的色谱柱及Phase Separations 公司的其他品牌色谱柱用的是“Parker-style”标准，其stop-depth为0.090英吋测柱效-良好的色谱实验习惯❀拿到一根新色谱柱时，先测柱效❀保留在新色谱柱上测得的色谱图，并记录色谱测试条件❀定期检测柱效❀定期检测仪器的谱带展宽测柱效的方法❀色谱柱种类繁多,性能各异,测定方法亦各不相同❀Waters的色谱柱均附有Use and Care说明书,可按说明书所述方法测定❀以下是Waters反相C18柱的测定方法:✎流动相:乙腈/水=60:40;流速:1ml/min✎样品:50mg Acenaphthene(二氢苊)溶于100ml乙腈,加入600μl丙酮✎进样量5μl✎检测波长:254nm计算色谱柱的柱效 N理论塔板数计算公式：W σ 方法W tan 16切线法W h 5.54半峰高W 3σ9 3σW 4σ16 4σW 5σ255σ21÷øöçèæ=W V N σ18.70RV =plates8742 20.8018.7016 4N =úûùêëé=σ0.80W =I n j e c tI n j e c t0.68W =16.63RV =plates9569 268.063.16164N =úûùêëé=σ用“切线切线””法计算柱效不好的色谱柱的柱效反而比好色谱柱的要高，因为其拖尾部分测不出来7018.=R V plates8240 1.0318.7025N 25=úûùêëé= 1.03W =height 4.4%height 4.4%plates3334 N 5=úûùêëé=σ2441631625..6316.=R V 1.44W =Good ColumnI n j e c t I n j e c t 用“5σ”法计算柱效色谱柱的正确使用及操作❀流动相的转换✎特别是GPC柱❀流速(压力)的变化幅度❀温度的变化幅度❀专用色谱柱∶样品及溶剂的要求记住∶拿到一根从未用过的色谱柱时一定要先看其使用说明！正确使用色谱柱（一）❀样品方面✎除去微粒及杂质✎了解样品在流动相中的溶解度➠如样品的溶剂不是流动相，一定要用流动相试溶解度，防止其在流动相中析出✎了解样品与色谱柱的基质/填料是否相互作用正确使用色谱柱（二）❀流动相方面✎除去微粒✎纯度的要求➠超纯水，梯度实验时水中有机杂质含量要低➠缓冲液的pH值，在填料的允许范围内➠缓冲液（盐）的浓度➠溶剂：色谱纯，并与填料相匹配➠溶剂中的杂质含量✎流动相对样品的溶解度➠有机溶剂或水的比例色谱柱的在线保护装置❀给色谱柱提供物理的保护✎除去样品及流动相中的颗粒❀给色谱柱提供化学的保护✎防止分析柱被化学污染❀装置✎在线过滤器✎自装填料保护柱✎预装保护柱在线过滤器❀In-Line Filter，部件号 WAT084560✎防止颗粒在色谱柱头累积✎优点：基本不影响柱效✎在需要高柱效的分析时中常用（如：氨基酸分析）❀可更换的消耗品✎更换滤芯，部件号 WAT005139 (5/pkgs)✎更换垫圈，部件号 WAT084567 (10/pkgs)保护柱❀可避免化学污染。
液相色谱柱的清洗和再生
用25℃的20:80的乙腈
水溶液以0.1ml/min的
流速反向冲冼4小时
用25℃的20:80的乙腈
水溶液以0.1ml/min的
流速反向冲冼4小时
钠离子型
用85℃的0.1mol/L 的
NaNO3溶液以0.1ml/min
的流速反向冲冼4—16小
时
用水冲冼至平衡。
正相再生
适合于主要使用正相流动相的多孔石墨化碳柱。
用50ml二氯甲烷以1ml/min流速冲洗。
用50ml甲醇以1ml/min流速冲洗。
用50ml水以1ml/min流速冲洗。
用50ml 0.1mol/L盐酸以1ml/min流速冲洗。
用50ml水以流速1ml/min冲洗。
用25℃的20:80的乙腈
水溶液以0.1ml/min的
流速反向冲冼4小时
用65℃的20:80的
ACN:0.01NH2SO4溶液
以0.1ml/min的流速反
向冲冼4小时
钙离子型
用25℃的0.1mol/L pH6.3
的Ca(NO3)2溶液以
0.1ml/min的流速反向冲
用95%甲醇水溶液冲洗重新平衡。
将色谱柱改为正向。
作者：英国的R.Plumb-Glaxo
强有机溶剂再生
适合于水相分析极性或离子类分析物。
用50ml丙酮以1ml/min流速冲洗。
用120ml二丁醚以1ml/min流速冲洗。
用50ml丙酮以1ml/min流速冲洗。
7 带金属抗衡离子的聚合物填料
基质是带金属抗衡离子的聚合物色谱柱，有三种再生方法，每种方法详细列于下表：
液相色谱柱的清洗
新柱使用前的冲洗
新柱在使用前应先认真阅读说明书及性能测试报告, 了解柱子的性能指标。分析用的流动相往往与柱子 的保存试剂不同,故在分析样品之前,应使用合适的 试剂将柱子中的保存试剂清洗出来。要注意清洗用 的流动相与保存溶剂的相溶性。
1、反相柱如岛津C18、C8等柱保存在70%甲醇中,可
用10～20倍柱体积的甲醇或乙腈来平衡色谱柱。流 速应缓慢提高,如开始0.3mL/min,10～15min后可慢 慢加快。
色谱柱常见问题的成因
3、缓冲液中盐的析出：当流动相中含有缓冲 盐溶液，而且分析结束后,如果没有先用水进 行冲洗,而是直接用纯有机相冲洗,瞬间柱子 中的微环境是高有机相、低水相。这时流动 相中的缓冲盐溶液极易析出盐份,将柱子堵塞 ,使柱压升高,柱效下降。 4、色谱柱变干：如果对色谱柱保存不当,使 色谱柱中的保存液全部挥发,柱子内部变干, 造成色谱柱的损伤,会影响分离效果。
对色谱柱进行适当清洗的意义
以上提到的部分故障可以通过适时、适当的 清洗得到解决，恢复色谱柱的功能，延长色 谱柱的使用寿命。 下面对比较常见的几种型号的色谱柱的清洗 方法进行讨论，具体的冲洗方法要根据实际 情况作适当的选择和调整。当然，不同的用 户和色谱产品厂商对自己的色谱柱会有不尽 相同的处理方法。
色谱柱常见问题的成因
1、硅羟基的死吸附 ：硅胶粒子表面存在硅 羟基，这些硅羟基会吸附样品和流动相中的 很多物质，当吸附达到饱和时就会出现柱效 下降、峰形劣化的现象。有些吸附是可逆的， 可以通过清洗解决。 2、重金属离子：重金属以金属氧化物的形式 残存在硅胶粒子的表面,这些金属氧化物很容 易与其它化合物形成螯合物,使其被氧化,造 成峰形劣化。
反相柱日常清洗
关于纯水的问题：纯水极性很强,ODS等填料的硅烷 键是非极性的,在纯水中各键合基团会因疏水作用而 改变空间构型, 使柱效很快降低。很多公司推出可 以使用100%纯水进行冲洗的柱子,原理是键合基团互 相之间有排斥力,这类柱子一般键合相比较丰富，游 离硅羟基比较少，从而阻止了键合基团性能的改变。 能否用纯水冲洗要参考该色谱柱的说明书。
液相色谱柱的使用注意事项流动相和样品处理 液相色谱操作规程
液相色谱柱的使用注意事项流动相和样品处理液相色谱操作规程液相色谱柱的使用注意事项：流动相和样品处理 1. 色谱柱使用前注意事项：色谱柱的储存液无特别说明，均为评价报告所示的流动相。
在使用前，确定要注意色谱柱的储存液与要分析样品的流动相是液相色谱柱的使用注意事项：流动相和样品处理 1. 色谱柱使用前注意事项：色谱柱的储存液无特别说明，均为评价报告所示的流动相。
在使用前，确定要注意色谱柱的储存液与要分析样品的流动相是否互溶。
在反相色谱中，如用高浓度的盐或缓冲液作洗脱剂，应先用10％左右的低浓度的有机相洗脱剂过渡一下，否则缓冲液中的盐在高浓度的有机相中很简单析出，堵塞色谱柱。
2. 流动相：1）在进行样品检测前，至少使用20倍柱体积流动相使色谱柱充分平衡。
流动相确定要使用色谱级别的溶剂。
如使用水相的缓冲液应当天配制以保持新鲜避开细菌产生。
2）流动相使用前需用微孔滤膜过滤,除去流动相中颗粒对色谱系统和色谱柱的损坏。
缓冲液与其他流动相混合后应重新过滤避开溶解度变化造成产生新的沉淀。
不应使用纯水作为流动相冲洗C18色谱柱，以免柱性能损坏（添加5％的有机溶剂冲洗色谱柱，同时可以达到对缓冲盐清洗的作用。
还可以使色谱柱更简单平衡）。
3）流动相需脱气后使用，可避开因气泡导致的泵和检测器的工作不正常。
假如测试时使用的流动相与色谱柱保存使用的流动相有较大区分，应当使用过度分布的形式进行平衡。
避开由于流动相的蓦地变化造成柱压加添过大或流动相缓冲盐结晶造成对色谱柱和仪器系统的损坏。
正相色谱柱比反相色谱柱需要更长的平衡时间。
4）流动相中所使用的各种有机溶剂要尽可能使用色谱纯，配流动相的水*好是超纯水或全玻璃器皿的双蒸水。
假如将所配得流动相再经过0.45μm的滤膜过滤一次则更好，尤其是含盐的流动相。
另外，装流动相的容器和色谱系统中的在线过滤器等装置应当定期清洗或更换。
5）以常规硅胶为基质的键合相填料通常的PH值适用范围是2.0—8.0，BDSC18适合于碱性化合物，PH值适用范围为2.0—10.0、当必需要在PH值适用范围的边界条件下使用色谱柱时，每次使用结束后立刻用适合于色谱柱储存并与所使用的流动相互溶的溶剂清洗，并完全置换掉原来所使用的流动相。
高效液相色谱柱注意事项
高效液相色谱柱注意事项高效液相色谱柱的系统由储液器、泵、进样器、色谱柱、检测器、记录仪等几部分构成。
储液器中的流动相被高压泵打入系统，样品溶液经进样器进入流动相，被流动相载入色谱柱（固定相）内，由于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的调配系数,在两相中作相对运动时，经过反复多次的吸附—解吸的调配过程，各组分在移动速度上产生较大的差别，被分别成单个组分依次从柱内流出，通过检测器时，样品浓度被转换成电信号传送到记录仪，数据以图谱形式打印出来。
高效液相色谱柱注意事项：1、柱效和保护柱拿到一根新柱时，肯定要先看其使说明，然后测柱效，定期检测柱效，保存在新色谱柱上得到的色谱图，并记录条件，定期检测仪器的谱带展宽。
若应用于在线监测，应对色谱柱供应在线的物理保护和化学保护，例如采取安装在线过滤器，自装填料保护柱和预装保护柱等。
在线过滤器的作用是防止颗粒在柱头累计，优点是基本不影响柱效，在需要高柱效的时候常用，常更换的消耗品是滤芯和垫圈保护柱的作用是防止柱子被化学污染。
缺点是多数保护柱影响色谱柱的柱效，特别是在用微柱时，常用的是普通自装填料的保护柱。
近新出的一些保护柱例如Sentry—guard保护柱，它的特点是高质量、高效填料、加添分析柱效、对脏样品载荷本领大，能延长保护柱的寿命，手可拧紧接头，安装时不需要工具，省时省，可换芯式设计，能采用各种不同的填料，重要适用于特别脏特别多而杂的样品本底，例如生化样品，环境样品和食品等，或者不想做太多的圃相萃取，不想降低柱效果等情况。
2、清洗对所做的样品要有充分的了解，用对该样品洗脱本领强的流动相清洗，对于硅胶柱，先用甲醇洗去极性杂质，然后用干燥的二氯甲烷和正庚烷100—20OraL依次活化，对于键和相柱，一般用甲醇一氯仿一甲醇一水依次冲洗，每种色谱柱有特定的清洗方法，肯定要看其使用说明。
3、存放存放前除掉杂质和盐，采用合适的存放溶剂，避开色谱柱床的干枯，避开机械振动，防止细菌生长，注意存放的温度。
常用液相色谱柱的规范化使用与保养标准操作规程
目的：规范液相色谱柱的使用与管理；液相色谱柱标准化老化与再生；剖析液相色谱柱常见问题与解决办法。
延长色谱柱使用寿命，降低色谱柱使用成本。
提高分析人员液相色谱柱使用与维护水平。
范围：适用于使用高效液相色谱仪的仪器分析操作人员及相关管理人员。
责任：设备员、液相操作人员、质控主管、质量管理部经理、质量受权人。
内容：1.定义1.1 液相色谱柱：指用于液相色谱分离的柱形固定相，由柱管、压帽/卡套、筛板（滤片）、填料、接头等组合而成，可用于液相色谱分析与制备。
1.2 色谱柱再生：指色谱柱在非正常情况下，针对异常现象及原因采取的一系列修复补救措施，以提高色谱柱柱效和延长其使用寿命的处理过程。
1.3 运载溶剂：指色谱柱生产厂商在柱出厂测试合格后饱和于色谱柱内的合适溶剂，以利于运输保存，多与保存溶剂相同。
1.4 保存条件：指色谱柱生产厂商根据不同柱类型及其色谱柱填料的制备、键合、装填、高压定型、净化干燥等工艺条件的不同要求而特别制定的色谱柱保存前净化饱和的处理程序与储存条件，包括净化程序、净化溶剂和保存溶剂、保存条件。
1.5 保存溶剂：用于保存色谱柱并指定了溶剂组成与比例的溶液。
1.6 反相色谱柱：以键合非极性基团的载体为填充剂填充而成的色谱柱。
常见的载体有硅胶、聚合物复合硅胶和聚合物等。
常用的填充剂有十八烷基硅烷键合硅胶、辛基硅烷键合硅胶和苯基键合硅胶等。
1.7正相色谱柱：用硅胶填充剂，或键合极性基团的硅胶填充而成的色谱柱，常见的填充剂有硅胶、氨基键合硅胶和氰基键合硅胶等。
1.8氨基柱（-NH2）：可以同时用于正相条件和反相条件，但多用于正相色谱条件。
使用时需注意，正相反相交替使用时必需用异丙醇过度，保证柱保存溶剂与流动相互溶。
[氨基柱出厂保存溶剂多用正相溶剂，例如：正己烷-乙腈（99：1）]。
2.液相色谱柱的使用及保养2.1普通C8及C8反相色谱柱的老化处理与使用保养程序新购色谱柱出厂前均采用适合的运载溶剂饱和，密封，由于运输过程周期较长，柱床容易干涸，所以新柱使用前需重新饱和与老化。
液相色谱的维护保养
液相色谱的维护保养
液相色谱是一种常见的分离和分析技术，广泛应用于化学、生物、医药等领域。
要保证液相色谱的精度和稳定性，需要进行维护保养。
一、常规维护
1. 每天使用前应检查仪器的电源插头是否牢固，仪器内部是否有异物。
2. 每次开机前应清洗进样器、柱和检测器，避免样品残留和杂质附着。
3. 每天结束工作后应清洗所有部件，包括进样器、柱、检测器和泵，避免化学物质残留引起的腐蚀和堵塞。
二、柱的维护
1. 液相色谱柱在使用过程中会出现色谱效率下降、分离效果变差等情况。
此时可以进行反向冲洗或正向冲洗，以清除柱中的杂质和残留物质。
2. 液相色谱柱的使用寿命有限，一般为几个月到一年不等，需要及时更换。
同时，存储柱时应避免极端温度和湿度。
三、检测器的维护
1. 液相色谱检测器的光源和检测器需要定期清洗，避免灰尘和污垢影响检测精度。
2. 液相色谱检测器需要进行定期校准和标定，以确保检测结果的准确性和可靠性。
四、泵的维护
1. 液相色谱泵需要定期更换密封圈和活塞，以确保泵的密封性和稳定性。
2. 液相色谱泵需要定期进行排气操作，以排除气泡和空气，避免影响流量稳定。
总之，液相色谱的维护保养是保证仪器正常运行和分析结果准确可靠的重要措施。
需要科学合理地制定维护计划和操作规程，定期检查仪器性能和部件状况，及时发现和解决问题。
液相色谱仪系统清洗方案
《体积排阻色谱（SEC）使用维护指南》中的三种液相系统清洁/冲洗方案要清洗使用100%水性的SEC方法的仪器系统，应将清洗方案所使用的100%异丙醇（IPA）替换为具有杀菌功能的70%异丙醇或70%乙醇（EtOH）。
100%IPA或EtOH无法穿透细菌的细胞壁，因此并不是有效的杀菌剂，含甲醇的溶液同样如此。
有三种液相系统清洁/冲洗方案可供选择，分别适用于不同情况。
1、对于使用无菌过滤流动相连续运行的系统：在常规应用中，是用缓冲液的最佳方法首先是使用新的流动相瓶来盛放新制流动相（切勿直接添加）配置好心流动相之后，若前一天使用过系统，只需湿灌注缓冲液管路4分钟。
如果前一天未使用过系统，则湿灌注所有管路6-10分钟。
2、对于已经空闲2-3天以上的系统：如果系统已在有（或无）流速的缓冲液系统环境中放置2-5天，按以下方法湿灌注所有缓冲液管路将对色谱柱使用寿命有益：用水灌注4分钟，然后使用70%IPA灌注6-10分钟，接下来继续用水灌注4分钟，开始其他分析之前在用缓冲液灌注4分钟。
此外，建议在不适用系统时，（用灌注缓冲液管路后）以70%IPA充满系统。
重新启用时，请使用70%IPA湿灌注系统3-4分钟，然后先用水灌注4分钟，再用目标缓冲液湿灌注系统。
3、作为预防性维护措施或系统被污染后的常规清洗方案（可定期（3-6个月）执行此清洗方案作为预防性维护措施）：a.断开色谱柱并在色谱柱入口和出口处管路安装两通接头。
b.执行清洗方案的各个步骤时请监测系统压力，使其保持1000psi以下，以防检测器流通池被破坏。
如有必要，可将背压装置更换为大口径废液管路。
c.如果系统近期使用过流动相缓冲液或含盐溶液，则应先试用100%高纯度水彻底冲洗系统，再引入有机溶剂。
d.将A、B、C、D、密封清洗液和进样针清洗液放入盛有70%IPA的洁净溶剂瓶中。
e.Prime溶剂管路A、B、C和D各5分钟。
f.Prime密封清洗液。
g. Prime洗针溶剂。
液相色谱柱维护保养及仪器冲洗
液相色谱柱维护保养及仪器冲洗注意：每个色谱柱使用之前都要阅读一下使用说明书色谱柱维护保养是很重要的，关系到色谱柱的使用寿命和检测结果的准确性，所以任何人用过色谱柱之后，一定要对色谱柱进行保养，管理人员和使用者互相监督。
总的原则是色谱柱要轻拿轻放，避免损坏填料；另外没有使用的情况下，一定要保证两端的堵头封好。
对于具体的色谱柱，下面列出常用色谱柱维护保养的具体方法和注意事项，以便使用者参考。
对于未启用的新的色谱柱，先用甲醇或乙腈以小流速（0.2ml/min缓慢升高到0.5ml/min ）不接检测器冲洗色谱柱30分钟后，将色谱柱与检测器连上，流速调为1.0 ml/min冲洗色谱柱60分钟，然后不断降低有机相的比例（如80%、50%、 10%甲醇或乙腈）各冲洗至少 30分钟。
若色谱柱暂时不用，则将色谱柱保存在高比例有机相中（如80%甲醇或乙腈，或者参考该色谱柱使用说明书中建议的溶剂中）；色谱柱使用时应用与分析流动相相同比例的有机溶剂（将缓冲盐溶液换成水）冲洗色谱柱15分钟，然后再换成流动相进行样品分析。
样品分析完后，色谱柱维护与保养方法：流动相中若含酸、碱、盐类物质，则要先用10%甲醇或乙腈冲洗，1.0ml/min 的流速冲洗至少30min,再用80%甲醇或乙腈冲洗至少30min,柱子保存在80% 甲醇或乙腈里（具体问题具体分析，洗脱程序可以是梯度洗脱程序，注意如果最后色谱柱保存的是高有机相，第二天用之前一定要用高水相过渡一下，再换成流动相）。
如柱子长时间未用，则柱子保存在 100%的甲醇或乙腈里。
对于含有离子对试剂的流动相如庚烷磺酸钠和十二烷基磺酸钠等，柱子应采用梯度洗脱，一般用乙腈-水系统（水：90-10；乙腈：10-90）冲洗时间要稍长些，然后保存于90%乙腈。
需要特别强调的是，目前所有的C18柱均不能用纯水进行长时间（1小时以上）冲洗，除非有专门耐水的专用柱，否则，用纯水长时间冲洗色谱柱，会导致色谱柱的固定相流失和相塌陷，损坏色谱柱。
高效液相色谱管柱清洗流程
高效液相色谱管柱清洗流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
文档下载后可定制随意修改，请根据实际需要进行相应的调整和使用，谢谢!并且，本店铺为大家提供各种各样类型的实用资料，如教育随笔、日记赏析、句子摘抄、古诗大全、经典美文、话题作文、工作总结、词语解析、文案摘录、其他资料等等，如想了解不同资料格式和写法，敬请关注!Download tips: This document is carefully compiled by theeditor. I hope that after you download them,they can help yousolve practical problems. The document can be customized andmodified after downloading,please adjust and use it according toactual needs, thank you!In addition, our shop provides you with various types ofpractical materials,such as educational essays, diaryappreciation,sentence excerpts,ancient poems,classic articles,topic composition,work summary,word parsing,copy excerpts,other materials and so on,want to know different data formats andwriting methods,please pay attention!高效液相色谱（HPLC）是一种常用的分析技术，但在长期使用过程中，色谱柱会因为样品残留、吸附作用等原因导致柱效下降，因此需要定期对色谱柱进行清洗，以恢复其性能。
液相色谱柱维护保养及仪器冲洗
液相色谱柱维护保养及仪器冲洗注意:每个色谱柱使用之前都要阅读一下使用说明书、色谱柱维护保养就是很重要得,关系到色谱柱得使用寿命与检测结果得准确性,所以任何人用过色谱柱之后,一定要对色谱柱进行保养,管理人员与使用者互相监督。
总得原则就是色谱柱要轻拿轻放,避免损坏填料;另外没有使用得情况下,一定要保证两端得堵头封好、对于具体得色谱柱,下面列出常用色谱柱维护保养得具体方法与注意事项,以便使用者参考。
(0.2mｌ/min缓慢升高到0.5ml/miｎ)不接检测器冲洗色谱柱30分钟后,将色谱柱与检测器连上,流速调为1。
0ml/min冲洗色谱柱60分钟,然后不断降低有机相得比例(如80%、5０％、1０%甲醇或乙腈)各冲洗至少３0分钟。
若色谱柱暂时不用,则将色谱柱保存在高比例有机相中(如８0%甲醇或乙腈,或者参考该色谱柱使用说明书中建议得溶剂中);色谱柱使用时应用与分析流动相相同比例得有机溶剂(将缓冲盐溶液换成水)冲洗色谱柱１5分钟,然后再换成流动相进行样品分析。
样品分析完后,色谱柱维护与保养方法:流动相中若含酸、碱、盐类物质,则要先用10%甲醇或乙腈冲洗,1、０ｍl/ｍin得流速冲洗至少30min,再用8０％甲醇或乙腈冲洗至少30ｍin,柱子保存在80％甲醇或乙腈里(具体问题具体分析,洗脱程序可以就是梯度洗脱程序,注意如果最后色谱柱保存得就是高有机相,第二天用之前一定要用高水相过渡一下,再换成流动相)。
如柱子长时间未用,则柱子保存在1０0％得甲醇或乙腈里。
对于含有离子对试剂得流动相如庚烷磺酸钠与十二烷基磺酸钠等,柱子应采用梯度洗脱,一般用乙腈-水系统(水:９0-１0;乙腈:10－90)冲洗时间要稍长些,然后保存于90％乙腈。
需要特别强调得就是,目前所有得C18柱均不能用纯水进行长时间(1小时以上)冲洗,除非有专门耐水得专用柱,否则,用纯水长时间冲洗色谱柱,会导致色谱柱得固定相流失与相塌陷,损坏色谱柱。
大多数反相色谱柱得pH稳定范围就是２～8,有得ｐＨ稳定范围会宽,具体pH稳定范围参照色谱柱说明书,当分析条件得pH值偏小或偏大时,可选择pH稳定范围宽得柱子进行分析,否则,会损坏色谱柱。
如何清洗和保存反相色谱柱
如何清洗和保存反相色谱柱？如何清洗和保存反相色谱柱？怎样处理新买来的色谱柱？用水来冲洗色谱柱有什么后果？分析结束后如何冲洗？这些问题是HPLC分析人员常常面对的。
本文就这些问题介绍一些色谱柱的维护和保养经验。
新色谱柱的处理对于新购买的色谱柱，首先应该做些什么呢？几乎所有的色谱柱在出厂时都保存在它们测试时的溶剂中，通常是60-80%的甲醇/水，这与在反相色谱中使用的流动相是兼容的，所以可以直接转换到所要使用的流动相。
另外，也可以先用20-30ml流动相中的强溶剂甲醇、乙腈或者四氢呋喃冲洗色谱柱，然后再转换到所需流动相。
需注意的是，在冲洗或平衡色谱柱时，重要的是溶剂的体积而不是冲洗时间。
提高流速可以缩短冲洗平衡时间。
如果使用有机溶剂和水或缓冲溶液，10倍柱体积的流动相可以使色谱柱达到冲洗平衡。
如果流动相使用离子对试剂，则需20-50倍柱体积的流动相。
对于直径4.6mm的色谱柱，其柱体积可以按下式估算：Vm=0.1L其中，Vm为柱体积（ml），L为色谱柱的长度（cm）。
故一个15cm x 4.6mm色谱柱大概的柱体积为1.5ml。
直径2.1mm的色谱柱的柱体积大约为4.6mm的20%，所以5cm x 2.1mm 的色谱柱含溶剂为100uL。
对于B型高纯硅胶基质填料的色谱柱，色谱柱的再现性很规范，这与15年前普遍使用的、不是很纯的A型硅胶基质填料的色谱柱形成鲜明对比，但很多用来分析产品和原料的“流传”下来的HPLC方法仍沿用这种色谱柱。
有的时候，新的色谱柱需要运行几针分析样品才能使保留时间和峰面积保持稳定。
这种情况对于新型的色谱柱比较好一些，但仍需一段时间的磨合。
有时可以通过运行高浓度的样品或对照品来加速最初的色谱柱平衡。
例如，如果你看到运行了几针50ng的对照品，其保留时间和峰面积有所飘移，试一试运行1ug的对照品。
这种方法常常可以加速柱平衡的时间。
用水冲洗色谱柱我们常常会被问到这样一些问题：“我的样品是水溶性的，流动相中含有缓冲盐和甲醇，我不能用水来冲洗所有水溶性的污染物吗？”回答是：“不可以”。
高效液相色谱柱清洗与再生方法
第16卷第2期2010年06月分析测试技术与仪器ANALYS IS AND TEST I NG T EC HNOLOGY AND I N S TRUM ENTSV o l ume16N u mber2June2010专论(71~77)高效液相色谱柱清洗与再生方法刘 翻,熊志超,张凌怡,张维冰(华东理工大学化学与分子工程学院,上海 200237)摘 要:分别对反相、正相、离子交换、体积排阻及亲和等色谱柱的清洗与再生方法加以系统综述.使用适当的方法对受污染的色谱柱进行清洗与再生,可恢复其部分分离能力,延长使用寿命.对硅胶基质反相色谱柱,可选择一系列溶剂,按洗脱能力逐渐增强的顺序依次冲洗,或者使用二甲基甲酰胺、乙酰丙酮、S D S及盐酸胍等强洗脱试剂清洗;硅胶基质正相色谱柱用极性逐渐增强的溶剂系统冲洗;有机聚合物、石墨碳及氧化锆固定相色谱柱,用稀酸、稀碱和有机溶剂结合清洗,可将受污染的色谱柱柱效提高50%以上.关键词:高效液相色谱;色谱柱;清洗;再生中图分类号:O657.32文献标识码:A文章编号:1006 3757(2010)02 0071 07色谱作为一种高效的分离手段,自1906年Ts w ett创立至今百余年来得到了长足发展.高效液相色谱(H PLC)是20世纪60年代后期发展起来的一种色谱方法,已成为现代分离测定的重要手段,广泛运用于石油、化工、食品科学、环境及生物等几乎所有研究领域[1].色谱柱是色谱分离系统的"心脏",由于被分析样品种类繁多,加之样品基质复杂,色谱柱极易被污染,是导致柱压升高、分离能力下降的原因之一[2].通常,样品中含有一些对分析不利的物质,这些非目标物能被检测器检测到而形成色谱峰、气泡、基线漂移或负峰.其中保留值较弱的物质,一般能快速从色谱柱冲洗出来,对分析不产生干扰.中等保留强度的杂质能被缓慢冲洗出来,但对分析产生一定的干扰.强保留杂质通常难以被洗脱,多次上样后,聚集在柱头或色谱柱中.有的分析物甚至可能在使用时与填料发生相互作用.这些被吸附的杂质累积到一定程度后会形成新的伪固定相,从而改变色谱柱的性能.对于基质复杂的样品,一根色谱柱的使用寿命可能只有百余次.而且每种色谱柱适用的样品有限,一次错误进样甚至可能导致色谱柱失效.中国市场调查研究中心在中国反相色谱柱市场调查及投资策略分析报告中估计,中国每年消耗的分析型反相色谱柱达5万支[3].这些被污染的色谱柱有一部分经简单的方法进行清洗后,可恢复部分甚至大部分离能力,不仅节省资源,还能大大降低分离分析的成本.色谱柱的清洗与再生方面的研究具有十分重要的现实意义,也一直是色谱工作者和仪器厂商关注的热点.很多色谱专著介绍过色谱柱清洗与再生,并提出许多简单有效的方法,各色谱柱厂商也推荐对应其商品色谱柱的经验性方法.本文对液相色谱柱清洗和再生方法加以系统综述,并在此基础上对各种色谱柱的清洗和再生提出建议.1 反相色谱柱的清洗和再生反相色谱法是当今液相色谱法中应用最广泛的一种技术,它能分析非极性、可离子化和离子化样品,应用比例超过90%.随着HPLC技术的发展,色谱柱的种类也越来越多,除经典的键合硅胶固定相填充柱,还有如聚合物填充柱、聚合物整体柱及以氧化锆基质固定相为代表的其它无机基质固定相色谱柱.这些色谱柱因其固定相基质差异,具有不同的物收稿日期:2010-01-25; 修订日期:2010-03-25.基金项目:国家自然科学基金资助项目(20675083);国家重点基础研究发展规划(973)资助项目(o1CB5m202);科技部 十一五国家科技支撑计划重大项目资助(2006BAF07B03).作者简介:刘翻(1983-),男,博士研究生,主要从事色谱研究工作.通讯联系人:张维冰,教授.E-m a i:l w e i bi ngzhang@理和化学性质及应用范围,其清洗与再生方式也存在一定差别.1.1 硅胶基质反相色谱柱的清洗与再生在反相色谱中,硅胶基质色谱柱使用比例达70%,被应用于各种样品的分析.清洗硅胶基质反相色谱柱,关键是弄清楚污染物的性质,并且能找到合适的溶剂将其洗脱.对于被不同样品污染的色谱柱,如常规样品污染、蛋白质污染及金属离子污染的色谱柱,具有对应的清洗和再生方法.1.1.1 常规样品污染色谱柱清洗与再生方法被常规样品污染的硅胶基质反相色谱柱,已有各种清洗与再生方法.其中最常用的是用20倍柱体积(这里柱体积指色谱柱内空腔体积,表1列出了常用规格分析柱柱体积[4])的乙腈!二氯甲烷!正己烷!二氯甲烷!乙腈冲洗色谱柱[5],或者用强度更弱的溶剂系统清洗,即:水!乙腈!氯仿(或异丙醇)!乙腈!水冲洗,其中水冲洗步骤可以省略[6].艾杰尔公司使用乙腈∀水(5∀95,V/V)!四氢呋喃!乙腈∀水(5∀95,V/V)冲洗10倍柱体积,此方法达到较为理想的结果,同时能大大节省时间.强酸和强碱溶液会导致硅胶基质填料溶解,但是在某些条件下使用稀酸可以将有机溶剂不能洗脱的污染物去除,如用甲醇!氯仿!甲醇冲洗20倍柱体积达不到清洗效果,可依次用20倍柱体积水、0.05m o l/L的硫酸和流动相溶液冲洗色谱柱,可取得良好效果.经过多次进样的色谱柱,用90%~100%的溶剂B(强洗脱溶剂)冲洗20倍体积即可清除污染物[7-9].当强洗脱溶剂无法洗脱时,则有必要用更强的一种或一系列溶剂清洗,即:100%甲醇!100%乙腈!乙腈∀异丙醇(75∀25,V/V)!100%异丙醇!100%二氯甲烷或100%正己烷.根据色谱柱具体使用情况,在清洗过程中可省略一个或多个有机溶剂[4].表1 不同柱长的H PLC色谱柱柱内死体积Table1 Colu m n volu m es of analytical col umn s柱尺寸/mm 柱内死体积/mL柱尺寸/mm柱内死体积/mL4.6#2502.54.6#1001.04.6#2002.04.6#500.54.6#1501.5除了以上这些方法之外,还有一些使用更强溶剂、耗费时间较短的方法.依利特公司用20倍柱体积的二氯甲烷∀甲醇(96∀4,V/V),加1%氢氧化铵冲洗,其中加入的氢氧化铵对聚集在柱头的污染物具有良好的清洗效果.二氯甲砜也被The m o公司用于色谱柱的清洗,具体方法是:在用水冲洗色谱柱同时进4等份的200 L二氯甲砜,然后依次用甲醇、氯仿和甲醇冲洗.用N,N-二甲基甲酰胺、丙酮依次冲洗色谱柱,可将色谱柱柱效提高约50%[10].这些方法耗时短,但使用的特殊溶剂,如氢氧化铵、二氯甲砜、N,N-二甲基甲酰胺等,均对色谱固定相有一定损伤.当色谱柱被严重污染,可在低于0.5mL/m i n的流速下用二甲基亚砜(D M SO)或50%二甲基甲酰胺-水冲洗色谱柱[4].实验证明在线清洗与再生的方法对非严重污染色谱柱非常有效,对污染特别严重的色谱柱不能达到理想效果,需将固定相从色谱柱内取出,进行清洗再生后重新装填.具体操作是:将色谱固定相从色谱柱内打出后,用甲醇浮选,去除其中细小的破碎颗粒;然后用二甲基甲酰胺、丙酮、甲醇超声清洗;最后70∃水浴蒸干固定相,重新装填色谱柱.经该方法处理的色谱柱,性能可得到显著提高[10].由上述方法可以看出,一般清洗方法所用的溶剂系统,溶剂洗脱强度均逐渐增加,使用强疏水性溶剂(如氯仿和正己烷)溶解非极性物质如类脂和油类,这类物质往往是色谱柱污染的最主要原因.正如正相与反相系统替换时,必须使用过渡溶剂冲洗系统,在色谱柱清洗与再生过程中,也必须保证一系列溶剂中每种溶剂都均与下一个溶剂互混.异丙醇能与正己烷或二氯甲烷互溶,又与水相溶剂互溶,常在清洗过程中用作过渡溶剂.但是异丙醇粘度非常大,需使用较低的流速以免导致泵压过高.而使用过渡溶剂,清洗步骤繁琐,正如M ajors所说:这是一个繁杂而又非常耗时的过程[4].此时利用梯度系统进行过夜操作是最好的选择,但梯度操作的系统要求更高,对一个复杂的清洗方法往往需要四元甚至五元梯度系统.1.1.2 金属离子污染色谱柱的清洗当色谱柱被金属离子污染后,一般的清洗方法无法生效,需使用特殊的清洗方法.磷酸和0.1m ol/L柠檬酸对色谱柱上吸附的金属离子具有较好的清洗效果,因此常被人们用来清洗被金属离子污染的色谱柱[7].乙二胺四乙酸(EDTA)能同许多金属离子形成配合物,0.05m o l/L的EDTA水溶第2期刘翻,等:高效液相色谱柱清洗与再生方法液也可用来去除色谱柱中金属离子污染物[4].这些试剂虽然能去除金属污染物,但也存在一些缺陷,如水溶液对固定相的浸润性较差,清洗效果不太理想;磷酸对固定相上键合相有一定的破坏作用;EDTA 带入钠离子,对固定相性能产生影响.以乙酰丙酮-甲醇冲洗色谱柱,可以有效去除金属离子污染物,同时可避免上述不利影响.该方法操作步骤是:将固定相用乙酰丙酮超声清洗1~3m i n,然后以甲醇萃取出乙酰丙酮[10].对于键合色谱固定相,如果确认了填料表面官能团配基断裂流失,可将合适的硅烷化试剂通入色谱柱,在一定温度下使之与表面暴露的-OH活性基团反应,使硅烷分子中的烷基重新键合在失效的填料颗粒表面.这种原位重新键合的再生方法仅能恢复部分柱效,且对5 m填料再生后柱压力容易偏高[11].1.1.3 蛋白质污染色谱柱的清洗随着蛋白质组学的发展,反相色谱柱也被广泛运用于蛋白质和多肽的分离,蛋白质对反相色谱柱的污染已成为常见问题.蛋白质分子量大,同时具有亲水和疏水特性,对很多物理和化学因素敏感.一般情况下,纯有机溶剂如乙腈或甲醇不能很好溶解多肽和蛋白质,不能有效地清洗色谱柱,因而需要一些特殊的清洗方法.现常用方法是用不含缓冲盐的流动相!0.1% TFA(三氟乙酸)水溶液!乙腈∀异丙醇(1∀2,V/V,含0.1%TFA)!流动相冲洗20倍柱体积[12].或先用去除缓冲盐的流动相运行一个梯度洗脱程序(A: 0.1%的三氟乙酸水溶液;B:乙腈∀异丙醇=1∀2, V/V,内含0.1%三氟乙酸,30m i n内B由25%到100%);然后用0.1%稀硝酸∀异丙醇(1∀4,V/V)冲洗40倍柱体积,最后用10倍柱体积的水∀异丙醇(1∀4,V/V)冲洗色谱柱[13].当上述方法无效时,可使用一些苛刻的试剂,如盐酸胍、二甲基甲酰胺及表面活性剂等.如用50%异丙醇水溶液冲洗时,将6 m o l/L盐酸胍水溶液与异丙醇按1:l混合,进样250 L;或者用30%二甲基甲酰胺水溶液清洗,时间不超过30m i n,处理后反复用水、甲醇冲洗.在常规流动相冲洗色谱柱时注射500 L的1%十二烷基硫酸钠(SDS),然后用5%~95%乙腈/水(含0.1% TFA)梯度冲洗,去除蛋白污染物效果也较好[14]. W aters公司研究发现,反复注射200 L二甲亚砜可以有效去除蛋白类物质.甚至在一些特殊的情况下,若已确定蛋白质污染物种类,可将对应蛋白水解酶(如1%胰蛋白酶或木瓜蛋白酶)注入色谱柱,将蛋白质水解为肽,再用盐溶液洗脱.当确定色谱柱被蛋白质污染后,应首先尝试用含高比例强溶剂的流动相进行冲洗(溶剂B),或重复用三氟乙酸水溶液-三氟乙酸丙醇溶液的上升-下降梯度清洗和注射三氟乙酸清洗.如这些方法不能得到理想结果,可用表2中的溶剂从上往下进行冲洗(根据具体情况,可以省略其中几步).其中尿素和胍是为洗脱非特异性吸附的蛋白[14],使用后至少需用40-50倍柱体积的水冲洗色谱柱[4].表2 蛋白污染反相色谱柱常用清洗溶剂组成Tab le2 W ashing solvents for re m oving prote i naceous m ater i a l fro m HPLC reversed-phase co l umn s清洗溶剂溶剂配比乙酸1%水溶液三氟乙酸(T FA)1%水溶液0.1%T FA∀异丙醇40∀60(V/V)(黏度较大,需调整流速)三乙胺(TEA)∀异丙醇40∀60(V/V)(混合前用磷酸将三乙胺调至p H=2.5)尿素或胍水溶液5~8m o l/L(调节p H=6~8)氯化钠、磷酸钠或硫酸钠水溶液0.5~1.0m ol/L二甲亚砜(DM S O)∀水或二甲基甲酰胺∀水50∀50(V/V)总之,被污染的硅胶基质色谱柱,应根据污染物类型和污染程度选择合适的清洗与再生方法.被常规样品污染的反相硅胶键合色谱柱,现有常规清洗与再生方式大致相同,从极性溶剂清洗至非极性溶剂,然后恢复至极性溶剂状态.这些方法,一方面耗时长,另一方消耗溶剂量大,同时再生效果不一定好.使用一些特殊的强溶剂清洗,又对色谱柱填料造成损害.因此,清洗与再生色谱柱时应根据实际情况而定,对污染程度较轻的,用甲醇!二氯甲烷!甲醇分别冲洗20倍柱体积;污染较严重的色谱柱,使用甲醇!二氯甲烷!甲醇!0.05m o l/L硫酸各冲洗20倍柱体积,或者用甲醇!50%二甲基甲酰胺水溶液!丙酮!甲醇分别冲洗10倍柱体积,能取得较好效果同时耗费时间较短.对严重污染的色谱柱,可先依次用二甲基甲酰胺、丙酮、乙酰丙酮、甲醇冲洗20倍柱体积.如效果不理想,可将色谱填料从色谱柱中73分析测试技术与仪器第16卷取出,然后用甲醇浮选,去除填料中细小破碎颗粒;再用二甲基甲酰胺!丙酮!乙酰丙酮!甲醇超声清洗;最后重新装填.同时该方法还可去除金属离子污染物.蛋白质污染色谱柱,不论是用高浓度的磷酸盐溶液,还是用尿素或胍来清洗色谱柱,对色谱柱都会产生较大损伤,同时损害色谱仪器.使用注射1% SDS法清洗色谱柱,不仅节省时间,还能得到较好的效果,是现有清洗方法中较优的选择.1.2 有机高分子类反相色谱柱的清洗与再生有机高分子色谱柱,如其中最普通的聚苯乙烯-二乙烯基苯(PS-DVB)颗粒或整体材料装填的色谱柱,可在很宽的pH范围内使用(通常为p H= 1~13,有的可达p H=0~14),在反相色谱中被广泛应用,特别是生物样品分析[15].对被普通生物样品污染的有机高分子类反相色谱柱,The m o、依利特及艾杰尔等厂商推荐用1.0m ol/L的硝酸或氢氧化钠清洗.被难溶性蛋白(如膜蛋白、结构蛋白和病毒膜蛋白)污染的有机高分子色谱柱,需要苛刻的清洗条件,如用含3m o l/L盐酸胍的50%异丙醇水溶液在60∃下冲洗,或者依次用3~5倍柱体积100%的异丙醇、二氯甲烷、异丙醇、原始流动相冲洗,可取得良好效果[4].在淋洗液中添加浓度为6~ 8m ol/L的尿素或0.2%~0.3%的表面活性剂冲洗色谱柱,可去除其中强保留生物污染物.用0.5~ 1 0m o l/L氢氧化钠水溶液在室温下冲洗1h以上,可使色谱柱中微生物失活或将其洗脱.根据聚合物上键合的功能团不同,使用不同的清洗方法效果更佳(Shodex公司):没有键合功能团的有机高分子色谱柱用50m L二氧六环!乙腈或甲醇冲洗,或用含有0.1%TFA的异丙醇!100%流动相B!100%流动相A以一半工作流速冲洗5~10倍柱体积;键合磺酸基的有机高分子色谱柱,可用50mL乙腈和50mm o l/L氢氧化钠冲洗,或者注射20~50 L的0.5m o l/L氢氧化钠或2m o l/L硝酸清洗;键合苯基的有机高分子疏水性色谱柱,用洗脱溶剂在0.5mL/m in流速下反冲,并注射几次1~2 mL的0.1m ol/L氢氧化钠或30%硝酸;含丁基或乙基的甲基丙烯酸脂整体柱,可以在反流向情况下分别用10倍柱体积的1.0m o l/L氢氧化钠!水! 20%乙醇!工作缓冲液冲洗.应注意,虽然高交联聚合物具有好的机械稳定性,在水及有机溶剂中只发生极小的溶胀,在某些特殊的溶剂中其会溶解或发生大的收缩或膨胀,在使用一系列有机溶剂清洗聚合物柱前,最好先查阅说明书或咨询厂家.一般来说,受污染的有机高分子反相色谱柱可用50mL乙腈反冲,并辅以注射几次20~50 L1m o l/L氢氧化钠溶液或硝酸清洗.对强保留的蛋白质污染物,使用50%异丙醇并注射少量SDS清洗,然后用甲醇冲洗,可得到较好结果.1.3 石墨化碳和金属氧化物基质填料色谱柱清洗与再生氧化锆较硅胶惰性更强,涂敷了氧化锆的色谱填料,能够经受住苛刻的操作环境,如高的p H值和操作温度.由于其特殊的表面特性,碳酸、氟化物、磷酸根等离子会强烈地吸附于氧化锆色谱填料上.为将它们从色谱柱中清除,可以用酸、碱和有机溶剂结合清洗:50倍柱体积的20%乙腈!0.1m o l/L氢氧化钠水溶液或0.1m ol/L四甲基氢氧化铵水溶液! 10倍柱体积水!10倍柱体积的20%乙睛-0.1m o l/L硝酸!10倍柱体积水!20倍柱体积有机溶剂依次冲洗(Z ir Chr om公司).石墨化碳也被用作反相色谱柱填料,这种填料的性质不同于硅胶基质烷基键合相,其表面即是保留的基础,不再需其它表面改性.该类填料一般比烷基键合硅胶及多孔聚合物填料保留能力更强,常用于分析强亲水性物质.对受污染的石墨化碳色谱柱,在聚合物色谱柱清洗溶剂中加入20%的四氢呋喃,即可达到清洗与再生目的[4].不同的分析样品中具有不同的污染物,而这些污染在色谱柱上保留行为也不一致,对被分析不同样品的色谱柱,使用对应的清洗与再生方法具有更佳的效果.根据The m o公司介绍,对于分析不同样品的受污染石墨化碳反相色谱柱以下方法分别进行清洗,可显著提高被污染色谱柱的柱效:(1)离子类分析物:酸碱再生.将色谱柱反接,依次用50mL含0.1%三氟乙酸的四氢呋喃∀水(1∀1,V/V)溶液、含0.1%三乙胺或氢氧化钠的四氢呋喃∀水(1∀1,V/V)溶液、含0.1%三氟乙酸的四氢呋喃∀水(1∀1,V/V)溶液冲冼,然后用70倍柱体积的四氢呋喃冲洗,最后用95%甲醇水溶液重新平衡.(2)极性或离子型分析物:强有机溶剂再生.依次以50mL丙酮、120mL二丁醚、50mL丙酮冲洗色谱柱,最后用流动相平衡.(3)三氟乙酸的去除:用70倍柱体积四氢呋喃冲洗.74第2期刘翻,等:高效液相色谱柱清洗与再生方法(4)二乙胺的去除:用乙腈在75∃下冲洗120倍柱体积.2 正相色谱柱的清洗与再生通常正相色谱柱的清洗与再生方法与反相色谱柱用极性逐渐减弱的溶剂系统冲洗相反,其用极性逐渐增强的溶剂系统冲洗[16].根据The m o公司研究,硅胶、氧化铝、极性键合相色谱柱按以下方法冲洗:3-甲基戊烷或己烷!三氯乙烷!乙酸乙脂!丙酮!乙醇!水,然后以这些溶剂逆序冲洗,最后以流动相平衡.该方法从非极性溶剂缓慢过渡至极性溶剂水,然后逆序冲洗至非极性溶剂,对色谱柱损伤小,且具有良好的再生效果.然而该方法耗时长,消耗溶剂多,在很多时候应用较少,因此在具体应用过程中可省略其中一种或几种溶剂.Ag ilent公司使用的方法更简洁,用甲醇∀氯仿(50∀50,V/V)!乙酸乙酯反冲色谱柱,然后再按正方向用流动相平衡.常规硅胶或硅胶基质正相色谱柱,也可依次以四氢呋喃、甲醇、四氢呋喃、二氯甲烷和无苯正己烷冲洗40 ~60倍柱体积[15],或用5%~95%乙腈水溶液的60 m in梯度清洗,然后用30mL含2.5%二甲氧基丙烷和2.5%冰醋酸的正己烷溶液冲洗色谱柱,除去硅胶上吸附的水(艾杰尔公司).对强惰性的石墨化碳和有机聚合物正相柱,可以使用一些强酸或强碱清洗.Shodex及The m o公司用的稀酸和稀碱结合清洗法,可将有机聚合物正相柱上大部分污染物洗脱:5mL水!60mL的0 1 m o l/LH C l O4水溶液!5mL水!60m L的0.1mo l/L N a OH水溶液!5mL H2O在0.5mL/m i n流速下反向冲洗.使用0.1m o l/L盐酸与有机溶剂结合清洗石墨化碳柱,也具有良好的再生效果:二氯甲烷、甲醇、水、0.1mo l/L盐酸、水、甲醇、二氯甲烷,最后用流动相冲冼至平衡.3 离子交换色谱柱的清洗与再生离子交换色谱柱在极端pH范围和高盐浓度条件下长时间使用,或者分析蛋白等生物类样品后,盐离子及蛋白质会吸附于固定相表面,导致色谱柱分离能力下降,柱压升高,峰形变差.常用离子交换色谱柱的清洗与再生一般首先用纯水除去柱中盐,然后以有机溶剂(如甲醇)除去基于分配作用吸附在填料上的杂质,再用纯水冲洗色谱柱;或者用0.1m o l/L柠檬酸洗涤,然后用水洗去柠檬酸[4].阴、阳离子交换色谱柱性质存在一定差异,使用不同清洗方法可能会取得更好效果.如阴离子交换柱用水、3%的H2BO3或N a OH(非硅胶基质)冲洗,阳离子交换柱用水和酸冲洗.依利特及The m o公司均推荐用水!甲醇!氯仿冲洗阴离子交换色谱柱;阳离子交换色谱首先以水冲洗,并在冲洗过程中注射4等份200 L二甲基亚砜,再用四氢呋喃冲洗.硅胶基质离子交换色谱柱,限于硅胶的性质不能使用强酸或强碱清洗,树脂离子交换色谱柱则无此限制.对树脂离子交换色谱柱,高浓度的盐溶液(1~2m o l/L的N a C l溶液)即可恢复其大部分分离能力,油脂等少数与树脂紧密结合的物质可用低浓度酸或碱溶液(如0.1~0.2m o l/L的N a OH水溶液,20%~40%乙酸水溶液)冲洗除去.硅胶柱可用一定程序的水溶液清洗,亦可达到再生的目的: 0.5~1.0m ol/L的盐缓冲溶液!pH为2~3的缓冲溶液!添加水溶性有机溶剂(如10%~20%浓度的甲醇、乙腈、乙醇等)的缓冲溶液!添加8m o l/L尿素或非离子型表面活性剂的缓冲溶液[17].对于分析生物样品的离子交换色谱柱,可以使用一些特殊的方法进行清洗和再生.四氢呋喃-乙腈或甲醇冲洗可去除脂类;乙腈!丙醇!1%三氯乙酸进行梯度冲洗可去除蛋白质;在乙腈或甲醇冲洗同时反复注入四氢呋喃(100~200 L)可去除某些高疏水性化合物[18].通常吸附在固定相表面的酸性有机物用低p H缓冲液冲洗,碱性有机物用高p H缓冲液冲洗,然后依次用蒸馏水、甲醇、二氯甲烷、甲醇、水冲洗[16].离子交换柱中强吸附的蛋白质可使用蛋白酶去除:将2%的酶溶液700~800 L用高压泵注入色谱柱中,37∃反应24h,再先后用0.025 m ol/L磷酸盐缓冲溶液(p H7.1)和含0.5m o l/L NaC l的0.025m o l/L磷酸盐缓冲溶液(pH7.1,流量0.5m L/m in)进行充分淋洗.该方法对已知被蛋白质污染十分严重的色谱柱,能取得非常好的效果,且重复性良好[18].对受污染的离子交换色谱柱,可根据色谱柱性质及具体污染情况,选择强酸性或强碱性溶液、高盐溶液、含有机溶剂的缓冲溶液、含尿素等溶剂或表面活性剂(非离子型表面活性剂)的缓冲溶液、某些蛋白质变性剂(如盐酸胍和尿素等)以及蛋白酶中一种或几种组合进行清洗和再生.4 体积排阻色谱柱的清洗与再生体积排阻色谱是基于分子尺寸大小将物质分离75的一种色谱模式,其使用的色谱固定相包括有机凝胶和无机凝胶固定相两大类.硅胶凝胶色谱柱在酸性条件下官能团会发生脱落,碱性条件下硅胶基质会发生溶解,故清洗时注意清洗液p H值,以免损坏色谱柱.有机聚合物凝胶柱耐受p H范围宽,可以用较极端p H的清洗液进行清洗:用稀氢氧化钠或非离子型去垢剂去除大部分的结合物质,如果污染物是一些难洗脱的蛋白质,则需要使用特殊清洗方法,用90%的乙醇、30%的乙腈或30%异丙醇在低流速下冲洗过夜除去疏水蛋白质.对亲水性蛋白质和肽,可用提取液、去污剂或1m ol/L乙酸低流速冲洗色谱柱过夜,甚至可将溶于0.1m o l/L乙酸和0.5 m o l/L N a C l中的1m g/mL胃蛋白酶注入色谱柱,在37∃孵育1h,再用平衡液冲洗色谱柱除去亲水蛋白质,然后以蛋白水解酶处理分解凝胶中剩余的痕量胃蛋白酶,再用水!甲醇!水冲洗[17,19].清洗与再生体积排阻色谱柱过程中,流速需低于50%最大推荐流速,每种溶液冲洗10~15倍柱体积即可,更换清洗溶剂时需用3~5倍柱体积去离子水将色谱柱冲洗干净.通常体积排阻色谱柱上离子性吸附的碱性杂质可用高浓度中性盐溶液(如0 5m o l/L硫酸钠溶液)去除;含有机溶剂(如10~ 20%的甲醇、乙腈、乙醇等)的缓冲溶液(如50 mmo l/L磷酸盐缓冲液,pH=7.0)可洗脱吸附的疏水性杂质;吸附最强的杂质,可在清洗溶剂中添加尿素、中性表面活性剂(6~8m o l/L的尿素或0.2~ 0 3%的中性表面活性剂)进行洗脱[20-21].5 其他色谱柱的清洗与再生高效液相色谱测定糖醇等物质的含量时,使用特殊的糖醇色谱柱,其价格及其昂贵.对受污染的糖醇色谱柱用0.2m ol/L硝酸钙溶液作为流动相,在85∃下,流速为0.2mL/m i n,反相冲洗色谱柱24h,然后在相同条件下用10~20倍柱体积水冲洗,可取得较好的再生效果,延长色谱柱使用寿命,降低分析成本[22].基于特异性吸附作用将物质分离的亲和色谱柱和手性色谱柱,可依据具体色谱柱的特性,选择合适的强洗脱液,在0.5mL/m i n流速下反向冲洗色谱柱.其它如亲水作用色谱柱和疏水作用色谱柱,根据其使用条件,参照对应色谱模式选择合适清洗与再生方法[23-24].6 结论被污染的色谱柱,根据其具体情况,应选择合适的清洗与再生方法进行清洗,一般可将其柱效提高50%以上.对硅胶基质反相柱,污染情况较轻时可选择一系列溶剂,按洗脱能力逐渐增强的顺序依次冲洗,如甲醇!二氯甲烷!甲醇!0.05m ol/L硫酸各冲洗20倍柱体积;当其被严重污染时,可依次用二甲基甲酰胺、丙酮、乙酰丙酮、甲醇冲洗20倍柱体积,或将色谱固定相从色谱柱中取出,用二甲基甲酰胺!丙酮!乙酰丙酮!甲醇超声清洗;被强吸附蛋白质污染,使用注射1%SDS法清洗,能得到较好的效果.硅胶基质正相色谱柱用极性逐渐增强的溶剂系统冲洗;有机聚合物、石墨化碳及氧化锆固定相色谱柱(正相或反相均可),用稀酸、稀碱和有机溶剂结合清洗.离子交换色谱柱和体积排阻色谱柱可用高浓度中性盐溶液、含有机溶剂的缓冲溶液及加有尿素、中性表面活性剂的缓冲液进行洗脱;严重污染时可使用强酸性或强碱性溶液(非硅胶基质色谱柱)、蛋白质变性剂以及蛋白酶进行清洗和再生.随着H PLC的发展,新型色谱柱层出不穷,用于分析特殊样品的专用色谱柱被大量应用与生产生活之中.鉴于现有色谱柱清洗与再生方法的局限性和繁杂性、各种专用色谱柱价格昂贵以及新型色谱柱多样性,预计未来色谱柱的清洗与再生方面研究在以下方面会成为热点:%开发使用溶剂少,较现有方法更简单有效的色谱柱清洗与再生方法;&针对各种专用色谱柱的清洗与再生方法;∋适用于新型及CEC等其它类型色谱柱的清洗与再生方法.参考文献:[1] 孙元社,李彤,张玉奎.色谱技术的现状及与人们日常生活的关系[J].科学仪器仪表,2007,9:69-73. [2] Snyde r L R,K irkland J J,G lajch J L.实用高效液相色谱法的建立[M].第2版.张玉奎,王杰,张维冰,译.北京:华文出版社,2001:237-239.[3] 中国市场调查研究中心.中国反相色谱柱市场发展及投资价值分析报告[EB/OL].[2009-12-04].htt p://www.c m rn.co /y jl y/content2-3988.sh t m.l[4] M a j o rs R E.The clean i ng and regeneration o f reversed-phase HPLC co l u m ns[J].LC-G C Europe,2003,16(7):404-409.[5] M a j o rs R E.W ash i ng R eversed-P hase Silica-Based。
液相仪器的清洁与保养
高效液相色谱仪的清洁与保养1.溶剂瓶①使用新鲜配制的流动相，特别是水溶剂或盐缓冲液（建议不超过两天）。
②由于乙腈分子容易发生聚合，溶剂瓶子里会出现一些絮状的沉淀物，这就是为了防止聚合的出现，建议使用棕色瓶盛放乙腈，避免阳光直射，添加乙腈的时候一定把瓶底剩下的倒掉。
③在仪器正常使用过程中为防止有机溶剂挥发减小实验室污染和防止灰尘进入溶剂瓶建议使用0.45μm过滤头堵住瓶盖上未使用小孔（如果这些个小孔被彻底堵住，瓶盖拧的很紧的情况下，可能会出现泵吸液不畅的情况）；当仪器长时间不使用时，可以使用封口膜将瓶盖彻底密封，使用时取开密封保证仪器正常工作。
2.流动相含缓冲盐如果流动相中含有酸、碱或盐，先用90％的水进行冲洗30分钟（视色谱柱型号选择冲洗时间，完全置换柱内缓冲盐需要冲洗20倍柱体积）至基线平稳，然后梯度洗脱至60分钟时，有机相（甲醇、乙腈均可，长时间不使用建议色谱柱内充满甲醇）比例为100％，保持30分钟，卸下色谱柱使用两通连接，纯水冲洗10分钟，然后换为10%甲醇冲洗10分钟充满仪器管路。
长期使用水相或缓冲盐的通路，使用纯水冲洗后，再使用甲醇冲洗，可以打开Purge阀，使用5ml/min的流速。
污染比较严重时，可以使用IPA清洗。
3.柱塞密封清洗当泵头安装有清洗附件时，由于该附件中也有密封垫，这样就会增加活塞杆运动时的阻力。
所以开泵前一定先用密封清洗液冲洗柱塞密封垫，湿润柱塞杆。
Agilent、thermo Fisher、shimadzu、Waters液相都可使用10%异丙醇水作为密封清洗液，Waters液相建议使用10%甲醇水作为密封清洗液。
10％异丙醇或甲醇有助于降低水的表面张力，并有抑菌作用。
如果流动相用缓冲盐，容易结晶，固体盐对柱塞杆磨损严重，在运行过程中需要开启柱塞密封清洗功能，此时流出的液体当做废液，不循环使用；如果所用的流动相不含缓冲盐，则可用10％的异丙醇（甲醇）循环使用一个月再进行更换。
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液相色谱柱的清洗
一、液相色谱柱按基体成分的分类
1、硅胶基体：不键合任何化学基团的为硅胶柱，键合的化学基团有C18、C8、C4、氨基、氰基、苯基等。
2、聚合物基体：常见的聚合物基体为聚苯乙烯、聚丙烯酸酯、聚乙烯醇。
聚合物上再键合化学基团。
根据填料基体的成分不同可以分为：
二、色谱柱常见问题的成因
1、硅羟基的死吸附：硅胶粒子表面存在硅羟基，这些硅羟基会吸附样品和流动相中的很多物质，当吸附达到饱和时就会出现柱效下降、峰形劣化的现象。
有些吸附是可逆的，可以通过清洗解决。
2、重金属离子：重金属以金属氧化物的形式残存在硅胶粒子的表面,这些金属氧化物很容易与其它化合物形成螯合物,使其被氧化,造成峰形劣化。
3、缓冲液中盐的析出：当流动相中含有缓冲盐溶液，而且分析结束后,如果没有先用水进行冲洗,而是直接用纯有机相冲洗,瞬间柱子中的微环境是高有机相、低水相。
这时流动相中的缓冲盐溶液极易析出盐份,将柱子堵塞,使柱压升高,柱效下降。
4、色谱柱变干：如果对色谱柱保存不当,使色谱柱中的保存液全部挥发,柱子内部变干,造成色谱柱的损伤,会影响分离效果。
三、对色谱柱进行适当清洗的意义
以上提到的部分故障可以通过适时、适当的清洗得到解决，恢复色谱柱的功能，延长色谱柱的使用寿命。
下面对比较常见的几种型号的色谱柱的清洗方法进行讨论，具体的冲洗方法要根据实际情况作适当的选择和调整。
当然，不同的用户和色谱产品厂商对自己的色谱柱会有不尽相同的处理方法。
四、新柱使用前的冲洗
新柱在使用前应先认真阅读说明书及性能测试报告,了解柱子的性能指标。
分析用的流动相往往与柱子的保存试剂不同,故在分析样品之前,应使用合适的试剂将柱子中的保存试剂清洗出来。
要注意清洗用的流动相与保存溶剂的相溶性。
1、反相柱如岛津C18、C8等柱保存在70%甲醇中,可用10～20倍柱体积的甲醇或乙腈来平衡色谱柱。
流速应缓慢提高,如开始0.3mL/min,10～15min后可慢慢加快。
2、正相柱或称极性色谱柱一般保存在正庚烷或正己烷中。
如果分析时的流动相含有极性溶剂,应使用乙醇或异丙醇冲洗,流速0.1～0.3mL/min ,将保存液冲洗干净后,再用流动相平衡。
3、钙柱等糖柱只能用纯水作流动相进行冲洗，有机溶剂会造成色谱柱损坏，尤其要注意。
冲洗后可以记录色谱柱的一些性能指标,如柱效、柱压等,供今后参考。
分析样品前,要用流动相对色谱柱进行平衡,待基线平稳后再进样分析。
一般用流动相平衡的时间为30min,若系统中有盐或水,平衡时间应延长。
五、反相柱日常清洗
色谱柱清洗是日常的重要维护工作。
分析工作结束后,要用适当的溶剂清洗系统中残留的样品。
在反相系统中, 若流动相中无酸、碱、盐类物质, 可用甲醇冲洗30～60min ；若含酸、碱、盐类物质,应先用10 %甲醇,或用与分析用流动相相同比例的不含酸、碱、盐的溶液,冲洗30～60min , 再用甲醇冲洗。
直接用纯甲醇冲洗,会导致缓冲盐沉淀于柱子或检测池中。
关于纯水的问题：纯水极性很强,ODS等填料的硅烷键是非极性的,在纯水中各键合基团会因疏水作用而改变空间构型, 使柱效很快降低。
很多公司推出可以使用100%纯水进行冲洗的柱子,原理是键合基团互相之间有排斥力,这类柱子一般键合相比较丰富，游离硅羟基比较少，从而阻止了键合基团性能的改变。
能否用纯水冲洗要参考该色谱柱的说明书。
关于离子对试剂：常用的离子对试剂有烷基磺酸钠等, 这时通常采用
pH3～5的缓冲盐体系。
对于酸性样品一般使用常用四丁基铵盐，这时采用碱性体系。
容易出问题的是前一种情况。
分析结束后,柱子应先用有机溶剂-水体系冲洗,再用水冲洗,最后用有机溶剂冲洗。
这是因为烷基磺酸钠都是表面活性剂,可以洗掉脂肪油(如烷烃及其衍生物)。
在水的环境下烷基磺酸钠会将键合的烷烃基洗脱下来,造成固定相的流失。
所以应该先用有机溶剂-水体系冲洗柱子,表面活性剂会溶解在有机相中逐渐被冲洗出来,从而减少表面活性剂对键合相的洗脱。
六、反相柱的修洗复清
1、如果柱子污染严重可以使用以下方法清洗：
2、以水、甲醇、乙腈、氯仿依次清洗，再以相反的顺序清洗。
3、氯仿的作用是洗去残留的非极性杂质。
4、在用甲醇冲洗时可以将四氢呋喃作为样品注射，有助于去除强疏水性杂质。
5、四氢呋喃和甲醇的混合溶液可以去除类脂类污染物，也可同时注射二甲亚砜。
6、乙腈、丙酮、三氟乙酸（0.1%）的混合溶液有助于去除蛋白类污染物。
七、正相柱的清洗
1、硅胶柱可以用以下方法清洗：
2、正己烷（正庚烷）、二氯甲烷、甲醇依次清洗，再按照相反顺序冲洗。
3、甲醇的作用是洗去残留的强极性杂质。
4、正己烷可以使硅胶表面重新活化。
5、注意试剂的脱水处理，尤其是甲醇容易与水混溶，所用试剂应现用现开，试剂瓶加盖。