液相色谱柱的清洗(借鉴内容)

液相色谱柱的清洗

一、液相色谱柱按基体成分的分类

1、硅胶基体：不键合任何化学基团的为硅胶柱，键合的化学基团有C18、C8、C4、氨基、氰基、苯基等。

2、聚合物基体：常见的聚合物基体为聚苯乙烯、聚丙烯酸酯、聚乙烯醇。聚合物上再键合化学基团。

根据填料基体的成分不同可以分为：

二、色谱柱常见问题的成因

1、硅羟基的死吸附：硅胶粒子表面存在硅羟基，这些硅羟基会吸附样品和流动相中的很多物质，当吸附达到饱和时就会出现柱效下降、峰形劣化的现象。有些吸附是可逆的，可以通过清洗解决。

2、重金属离子：重金属以金属氧化物的形式残存在硅胶粒子的表面,这些金属氧化物很容易与其它化合物形成螯合物,使其被氧化,造成峰形劣化。

3、缓冲液中盐的析出：当流动相中含有缓冲盐溶液，而且分析结束后,如果没有先用水进行冲洗,而是直接用纯有机相冲洗,瞬间柱子中的微环境是高有机相、低水相。这时流动相中的缓冲盐溶液极易析出盐份,将柱子堵塞,使柱压升高,柱效下降。

4、色谱柱变干：如果对色谱柱保存不当,使色谱柱中的保存液全部挥发,柱子内部变干,造成色谱柱的损伤,会影响分离效果。

三、对色谱柱进行适当清洗的意义

以上提到的部分故障可以通过适时、适当的清洗得到解决，恢复色谱柱的功能，延长色谱柱的使用寿命。

下面对比较常见的几种型号的色谱柱的清洗方法进行讨论，具体的冲洗方法要根据实际情况作适当的选择和调整。当然，不同的用户和色谱产品厂商对自己的色谱柱会有不尽相同的处理方法。

四、新柱使用前的冲洗

新柱在使用前应先认真阅读说明书及性能测试报告,了解柱子的性能指标。分析用的流动相往往与柱子的保存试剂不同,故在分析样品之前,应使用合适的试剂将柱子中的保存试剂清洗出来。要注意清洗用的流动相与保存溶剂的相溶性。

1、反相柱如岛津C18、C8等柱保存在70%甲醇中,可用10～20倍柱体积的甲醇或乙腈来平衡色谱柱。流速应缓慢提高,如开始0.3mL/min,10～15min后可慢慢加快。

2、正相柱或称极性色谱柱一般保存在正庚烷或正己烷中。如果分析时的流动相含有极性溶剂,应使用乙醇或异丙醇冲洗,流速0.1～0.3mL/min ,将保存液冲洗干净后,再用流动相平衡。

3、钙柱等糖柱只能用纯水作流动相进行冲洗，有机溶剂会造成色谱柱损坏，尤其要注意。

冲洗后可以记录色谱柱的一些性能指标,如柱效、柱压等,供今后参考。分析样品前,要用流动相对色谱柱进行平衡,待基线平稳后再进样分析。一般用流动相平衡的时间为30min,若系统中有盐或水,平衡时间应延长。

五、反相柱日常清洗

色谱柱清洗是日常的重要维护工作。分析工作结束后,要用适当的溶剂清洗系统中残留的样品。在反相系统中, 若流动相中无酸、碱、盐类物质, 可用甲醇冲洗30～60min ；若含酸、碱、盐类物质,应先用10 %甲醇,或用与分析用流动相相同比例的不含酸、碱、盐的溶液,冲洗30～60min , 再用甲醇冲洗。直接用纯甲醇冲洗,会导致缓冲盐沉淀于柱子或检测池中。

关于纯水的问题：纯水极性很强,ODS等填料的硅烷键是非极性的,在纯水中各键合基团会因疏水作用而改变空间构型, 使柱效很快降低。很多公司推出可以使用100%纯水进行冲洗的柱子,原理是键合基团互相之间有排斥力,这类柱子一般键合相比较丰富，游离硅羟基比较少，从而阻止了键合基团性能的改变。能否用纯水冲洗要参考该色谱柱的说明书。

关于离子对试剂：常用的离子对试剂有烷基磺酸钠等, 这时通常采用

pH3～5的缓冲盐体系。对于酸性样品一般使用常用四丁基铵盐，这时采用碱性体系。容易出问题的是前一种情况。

分析结束后,柱子应先用有机溶剂-水体系冲洗,再用水冲洗,最后用有机溶剂冲洗。

这是因为烷基磺酸钠都是表面活性剂,可以洗掉脂肪油(如烷烃及其衍生物)。在水的环境下烷基磺酸钠会将键合的烷烃基洗脱下来,造成固定相的流失。

所以应该先用有机溶剂-水体系冲洗柱子,表面活性剂会溶解在有机相中逐渐被冲洗出来,从而减少表面活性剂对键合相的洗脱。

六、反相柱的修洗复清

1、如果柱子污染严重可以使用以下方法清洗：

2、以水、甲醇、乙腈、氯仿依次清洗，再以相反的顺序清洗。

3、氯仿的作用是洗去残留的非极性杂质。

4、在用甲醇冲洗时可以将四氢呋喃作为样品注射，有助于去除强疏水性杂质。

5、四氢呋喃和甲醇的混合溶液可以去除类脂类污染物，也可同时注射二甲亚砜。

6、乙腈、丙酮、三氟乙酸（0.1%）的混合溶液有助于去除蛋白类污染物。

七、正相柱的清洗

1、硅胶柱可以用以下方法清洗：

2、正己烷（正庚烷）、二氯甲烷、甲醇依次清洗，再按照相反顺序冲洗。

3、甲醇的作用是洗去残留的强极性杂质。

4、正己烷可以使硅胶表面重新活化。

5、注意试剂的脱水处理，尤其是甲醇容易与水混溶，所用试剂应现用现开，试剂瓶加盖。