引物退火温度与Tm值的关系

退火温度与Tm值

①在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。复性时间一般为30?60sec,足以使引物与模板之间完全结合。

②引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度：

Tm值(解链温度)=4(G+C)+2(A+T)复性温度=Tm值-(5?10C )

③Tm对于设定pcr退火温度是必需的。在理想状态下，退火温度足够低，以保证引物同目

的序列有效退火，同时还要足够高，以减少非特异性结合。合理的退火温度从55 C到70C。退火温度一般设定比引物的Tm低5C。

④引物退火温度

退火温度决定PCR特异性与产量；温度高特异性强，但过高则引物不能与模板牢固结合，DNA 扩增效率下降；温度低产量高，但过低可造成引物与模板错配，非特异性产物增加。一般先由37C 反应条件开始，设置一系列对照反应，以确定某一特定反应的最适退火温度。

也可根据引物的(G+C)%含量进行推测，把握试验的起始点，一般试验中退火温度

Ta(annealing temperature)比扩增引物的融解温度Tm(melting temperature) 低5°C,可按公式进

行计算：

Ta = Tm - 5 C = 4(G+C)+ 2(A+T) -5 C

其中A , T, G, C分别表示相应碱基的个数。例如，20个碱基的引物，如果(G+C)%含量为50%时，贝U Ta的起点可设在55 C。在典型的引物浓度时(如0.2卩mol/L),退火反应数秒即可完成，长时间退火没有必要。