植物总RNA的提取与电泳

RNA的检测： RNA的检测： 的检测
RNA的检测主要用琼脂糖凝胶电泳 ， 分为 RNA 的检测主要用琼脂糖凝胶电泳， 的检测主要用琼脂糖凝胶电泳 非变性电泳和变性电泳。 非变性电泳和变性电泳 。 一般变性电泳用 的 最 多 是 甲 醛 变 性 电 泳 （ 如 Northern 实验过程中） blot 实验过程中）。
3. 实验材料与试剂
材料： 水稻） 材料： 新鲜植物组织 （水稻） 试剂：Qiagen RNeasy植物试剂盒， 植物试剂盒， 试剂： 植物试剂盒 甲醛， 甲醛，琼脂糖电泳系统 ，凝胶成象系 统等。 统等。
4. 实验方法和步骤
每一步均要求无RNase污染） RNase污染 实验步骤 （每一步均要求无RNase污染） 称取新鲜材料100 mg，液氮速冻； ① 称取新鲜材料100 mg，液氮速冻； ② 在预冷的研钵中并在液氮中将材料 研磨成细粉末，转移到2ml或 研磨成细粉末，转移到2ml或1.5ml 离心管中； 离心管中； 待液氮挥发（但不能解冻） ③ 待液氮挥发（但不能解冻）后，加入 μl提取缓冲液RLT， 提取缓冲液RLT 450 μl提取缓冲液RLT，混匀后在 56℃下温育1 min； 56℃下温育1～3min；
将裂解液加到离心柱（淡紫色） ④ 将裂解液加到离心柱（淡紫色）上 下接一个2ml收集管，最大转速离心 收集管， 下接一个 收集管 2min。裂解液通过柱子时被均质化 。 小心吸取上清液， 小心吸取上清液，转移到另一新离 心管； 心管； 加入0.5倍体积 倍体积（ ⑤ 加入 倍体积（225 µl）96～100% ） ～ 乙醇，混合均匀。加入乙醇后， 乙醇，混合均匀。加入乙醇后，可能 会出现沉淀，无影响； 会出现沉淀，无影响；
步骤： 步骤：
1. 凝胶制备（1.2％）：用1ⅹ凝胶缓冲液配制1.2 凝胶制备（1.2％）：用1ⅹ凝胶缓冲液配制1.2 ％）： 凝胶缓冲液配制 的凝胶，至少使其凝固30分钟后进行上样； 30分钟后进行上样 ％的凝胶，至少使其凝固30分钟后进行上样； 样品制备：在离心管中， RNA样品与10ⅹ上样 样品与10ⅹ 2. 样品制备：在离心管中，将RNA样品与10ⅹ上样 缓冲液以9:1比例混匀，迅速在冰上冷浴5分钟， 9:1比例混匀 缓冲液以9:1比例混匀，迅速在冰上冷浴5分钟， 瞬时离心数秒。RNA上样量为 30µ 上样量为2 瞬时离心数秒。RNA上样量为2-30µg，本次实验 10µ 为10µg； 上样前凝胶须预电泳5min 5min， 3. 上样前凝胶须预电泳5min，随后将样品加入加 样孔， 5V/cm的电压电泳1h～1.5h； 的电压电泳1h 样孔，以5V/cm的电压电泳1h～1.5h； 待溴酚蓝迁移至凝胶长度的4/5处结束电泳。 4/5处结束电泳 4. 待溴酚蓝迁移至凝胶长度的4/5处结束电泳。将 凝胶置于溴化乙锭溶液中染色约30min 30min； 凝胶置于溴化乙锭溶液中染色约30min； 在紫外灯下观察结果(如果用于Northern 5. 在紫外灯下观察结果(如果用于Northern blot , 在凝胶转膜前应做好移动距离的标记) 在凝胶转膜前应做好移动距离的标记)。
实验、七 实验、
植物总RNA的提取与电泳 的提取与电泳 植物总
1. 实验目的和要求 掌握RNA制备以及常用鉴定方法的原 制备以及常用鉴定方法的原 掌握 操作步骤、注意事项和技术关键。 理、操作步骤、注意事项和技术关键。
2. 相关基础知识
由于RNA是基因表达过程中非常重要的生 由于RNA是基因表达过程中非常重要的生 RNA 物分子， mRNA,它携带了DNA的全部编 它携带了DNA 物分子，如mRNA,它携带了DNA的全部编 码信息。RNA的分离是研究基因功能的重 码信息。RNA的分离是研究基因功能的重 要基础之一， 要基础之一，在分子生物学中占有重要 的地位。提取的mRNA可用于Northern mRNA可用于 的地位。提取的mRNA可用于Northe 以及体外翻译等实验。 Chips以及体外翻译等实验。
而且RNA变性后有利于在转印过程中与硝 而且RNA变性后有利于在转印过程中与硝 RNA 酸纤维素膜的结合。 RNA通过甲醛变性琼 酸纤维素膜的结合。 RNA通过甲醛变性琼 脂糖凝胶电泳，可以直观快捷的分析RNA 脂糖凝胶电泳，可以直观快捷的分析RNA 质量之优劣，当有标准的“分子标尺” 质量之优劣，当有标准的“分子标尺” marker）存在时， （marker）存在时，还可相对客观的对总 RNA样品进行定性和定量 样品进行定性和定量。 RNA样品进行定性和定量。 为测定片段大小， 为测定片段大小，可在同一块胶上加标记 物一同电泳，之后将标记物胶切下，上色、 物一同电泳，之后将标记物胶切下，上色、 照像。 照像。
琼脂糖凝胶非变性电泳
所需试剂： 所需试剂： 10ⅹ凝胶缓冲液 10ⅹ凝胶缓冲液 吗啉代丙磺酸（MOPS）（ ）（pH 7.0） 吗啉代丙磺酸（MOPS）（pH 7.0） 200mmol/L NaAC 50mmol/L 8.0） EDTA （pH 8.0）10mmol/L DEPC水配制 水配制， NaOH调节pH＝7.0。 调节pH 用DEPC水配制，用NaOH调节pH＝7.0。过滤除菌 后避光保存。 后避光保存。 10ⅹ电泳上样缓冲液 10ⅹ电泳上样缓冲液 50％（V/V）甘油（ DEPC处理的水稀释 ％（V/V 处理的水稀释） 50％（V/V）甘油（用DEPC处理的水稀释） EDTA（pH8.0） 10mmol/L EDTA（pH8.0） 0.25％（m/V） ％（m/V 0.25％（m/V）溴酚蓝 0.25％（m/V）二甲苯青FF ％（m/V 0.25％（m/V）二甲苯青FF
将混合液全部（包括沉淀675 μl） ⑥ 将混合液全部（包括沉淀675 μl） 转移到吸附离心柱（粉红色）内， 下接2 ml的收集管 的收集管， rpm离心 下接 2 ml 的收集管 ， 10000 rpm 离心 15秒 弃去管内液体； 15秒。弃去管内液体； 加入700 700μl RW1 缓冲液， 10000rpm rpm转 ⑦ 加入 700μl RW1 缓冲液 ， 10000rpm 转 速下离心25 25秒 弃去收集管； 速下离心25秒，弃去收集管； ⑧ 将 离 心 柱 转 移 到 一 个 新 的 2ml 收 集 500μl 管 上 ， 加 入 500μl RPE 缓 冲 液 ， rpm离心 15秒 离心15 10000 rpm 离心 15 秒 ， 弃去管内液体 重复使用收集管； 重复使用收集管；
加入500µl RPE到离心柱内，最大转速 到离心柱内， ⑨ 加入 到离心柱内 离心2min， 干燥离心柱 ， 弃去收集管 ； 离心 ， 干燥离心柱， 弃去收集管； 把离心柱接在一个新的1.5 ml Eppen管 ⑩把离心柱接在一个新的 管 上 ， 加 入 30 ～ 50µl 无 RNase 水 处理） （ 0.1%DEPC处理 ） ， 10000 rpm离心 处理 离心 1min， 洗出 产量在20µg ， 洗出RNA。 若 RNA产量在 。 产量在 以上， 水再洗脱1 以上 ， 用 30～50 µl无 RNase水再洗脱 ～ 无 水再洗脱 样品保存于-20℃备用。 次。RNA样品保存于 ℃备用。 样品保存于
已有多种较为成熟的分离总RNA的方法， 已有多种较为成熟的分离总RNA的方法，常 RNA的方法 用的有3 用的有3种: 1.苯酚法： SDS变性蛋白并抑制RNase活性， 1. 苯酚法：用SDS变性蛋白并抑制RNase活性， 苯酚法 变性蛋白并抑制RNase活性 经多次酚/氯仿抽提除去蛋白、多糖、 经多次酚/氯仿抽提除去蛋白、多糖、色素 等后， NaAC和乙醇沉淀RNA； 和乙醇沉淀RNA 等后，用NaAC和乙醇沉淀RNA； 2.胍盐法 用异硫氰酸胍或盐酸胍和β 胍盐法： 2. 胍盐法：用异硫氰酸胍或盐酸胍和β-巯基乙 醇变性蛋白，并抑制RNase的活性， RNase的活性 醇变性蛋白，并抑制RNase的活性，经酚氯 仿抽提后再沉淀； 仿抽提后再沉淀； 3.氯化锂沉淀法 因为锂在在一定pH 氯化锂沉淀法： pH下能使 3. 氯化锂沉淀法：因为锂在在一定pH下能使 RNA相对特异地沉淀 但容易使小分子RNA 相对特异地沉淀， RNA损 RNA相对特异地沉淀，但容易使小分子RNA损 而且残留的锂离子对mRNA有抑制作用。 mRNA有抑制作用 失，而且残留的锂离子对mRNA有抑制作用。
提取植物RNA时，要注意的问题： 时 要注意的问题： 提取植物 1）一般用机械研磨的方法破碎植物 ） 组织细胞； 组织细胞； 2）要加入蛋白质变性剂，使核蛋白 ）要加入蛋白质变性剂， 分离并释放出RNA； 与RNA分离并释放出 分离并释放出 ； 3）抑制内源和外源 活性； ）抑制内源和外源RNase活性； 活性 4）Байду номын сангаасRNA与DNA、蛋白质及其它细 ） 与 、 胞成分分开。 胞成分分开。
本实验采用QIAGEN试剂盒，其原理是依据胍 试剂盒， 本实验采用 试剂盒 盐法。 盐法。即在含有强的异硫氰酸胍变性剂的提取 液中裂解植物组织粉末， 液中裂解植物组织粉末，在提取缓冲液中含有 RNase抑制剂，抑制 抑制剂， 活性， 抑制剂 抑制RNase活性，保证 活性 保证RNA的 的 完整性。 完整性。通过第一次离心柱时细胞碎片被阻留 在柱子上，溶液均质化，包括RNA在内的分子 在柱子上，溶液均质化，包括 在内的分子 物质通过离心柱。加入乙醇后， 物质通过离心柱。加入乙醇后，再过第二个离 心柱， 就结合在柱子底部有硅胶的膜上， 心柱，RN A就结合在柱子底部有硅胶的膜上， 就结合在柱子底部有硅胶的膜上 洗去其它杂质，最后用无RNase的水溶出 的水溶出RNA。 洗去其它杂质，最后用无 的水溶出 。 该柱子可结合100µg大于 大于200bp的RNA，所以应 该柱子可结合 µ 大于 的 ， 控制起始材料的用量。 控制起始材料的用量。
由于RNA分子是单链核酸分子，它不同于DNA 由于RNA分子是单链核酸分子，它不同于DNA RNA分子是单链核酸分子 的双链分子结构， 的双链分子结构，其自身可以回折形成发卡 式二级结构及更复杂的分子状态， 式二级结构及更复杂的分子状态，以至通过 一般传统的琼脂塘凝胶电泳难以得到依赖于 分子量的电泳分离条带， 分子量的电泳分离条带，为此电泳上样前将 样品于65摄氏度加热变性5分钟，使RNA分子 样品于65摄氏度加热变性5分钟， RNA分子 65摄氏度加热变性 的二级结构充分打开， 的二级结构充分打开，并且在琼脂糖凝胶中 加入适量的甲醛，可保证RNA RNA分子在电泳过程 加入适量的甲醛，可保证RNA分子在电泳过程 中持续保持单链状态，因此， RAN样品便在 中持续保持单链状态，因此，总RAN样品便在 统一构像下得到了琼脂糖凝胶上的依赖于分 子量的逐级分离条带。 子量的逐级分离条带。