实验五 微生物的分离、接种及培养法

实验五微生物的分离、接种及培养法
一目的要求
1.掌握倒平板的方法、划线分离法、稀释平板分离法和菌落（活菌）计数法。

2.熟练掌握微生物的接种技术，学会微生物的一般培养方法和无菌操作技术。

二实验原理
从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。

常用的分离方法有： 1) 平板划线分离法；2）稀释平板分离法。

在食品发酵工业中，通过微生物的分离、纯化，选育优良的微生物菌种，以提高产品的质量和产量；在食品卫生管理方面，需要进行微生物检测，必须将微生物单一分离出来，加以鉴别和研究。

土壤是微生物生活的大本营，它所含微生物无论是数量还是种类都是极其丰富的。

因此土壤是微生物多样性的重要场所，可以从中分离、纯化得到许多有价值的菌株。

微生物的分离和接种是微生物学中重要的技术之一，需要严格的无菌操作，否则使得微生物实验毫无意义。

三实验材料
1.菌种：葡萄球菌、枯草杆菌、大肠杆菌、酵母菌、毛霉、曲霉、青霉等含菌样品。

2.培养基：肉汤蛋白胨培养基（斜面、平板）、肉汤蛋白胨液体培养基、蔡氏琼脂培养基（斜面、平板）。

3.土壤（自带）或其他物品；无菌水，无菌培养基，无菌吸管，无菌三角瓶等。

四实验内容与步骤
（一）微生物的分离技术
1. 平板划线分离法借助划线使混杂的微生物在平板的表面分散开，以获得单个菌落，从而达到分离的目的。

具体方法如下：
倒制平板→制备含菌样品稀释液→划线→倒置适温培养→观察记录
（1)倒制平板：将固体培养基熔化→冷却至 50-55℃→注入培养皿内 15ml（无菌操作）→旋匀→静置凝固→即成平板→在皿盖边贴标。

（2)含菌样液制备：样品少许（1-10g），加入盛有无菌水的试管内，摇匀，制成菌悬液即可，能直接划线的样品（如体液、黏液、污水等），可省去这操作。

（3)划线：左手持平板，接种环经灼烧灭菌后，以无菌操作取样，迅速将接种环伸入培养皿，轻轻划线（切勿把平板表面划破）。

然后将培养皿倒置放入恒温培养箱37℃，培养24-48 小时，观察平板上出现的现象，注意菌落的形状，并做记录。

2.稀释平板分离法：采用稀释手段，使样品分散到最低限度，然后吸取一定量注入平皿内，倒入培养基，摇匀静置凝固后培养，这样被分离的细菌被固定在原处而形成菌落，可作为一种计数方法。

（1)制备土壤稀释液：（细菌的分离）以无菌操作，称取样品 10g，加入装有 90ml 无菌水的锥形瓶中，振荡 10-20 分钟，使土样与水充分混合，即成 10 -1 土壤稀释液，然后在酒精灯火焰旁，用无菌移液管吸取 1ml10 -1 的稀释液注入 9ml 无菌水的试管内，制成10 -2 的稀释液。

用同样方法再制成10 -3 ，10 -4，10 -5，10 -6 的稀释液。

稀释完毕后，可用原来的移液管，从菌液浓度最小的 10 -6的稀释液开始吸取 1ml 的 10 -6稀释液，加到相应编号 10 -6的无菌培养皿内，以相同方法分别吸取 1ml 的 10 -5、10 -4的稀释液加到相应编号为 10 -5、10 -4的无菌培养皿内。

注意：①每稀释一个浓度，必须更换一支无菌吸管。

②用稀释平板计数时，待测菌稀释度的
选择应根据样品确定。

样品中所含待测菌的数量多时，稀释度应高，反之则低。

测定土壤细菌数量时，采用 10 -4、10 -5、10 -6稀释度，测定放线菌数量时，采用 l0 -3、10 -4、10 -5 稀释度，测定真菌数量时，采用 10 -2、10 -3、10 -4稀释度。

（2)平板的制作：将固体培养基融化，待冷却至 45-50℃左右，分别倾入已盛有 10 -4、10 -5、10 -6稀释液的无菌培养皿内，轻轻摇匀，静置凝固。

凝固后将平板倒置于37℃恒温箱中，培养24-48 小时，细菌即在所固定的位置长成肉眼能见的菌落。

（二）微生物的接种方法
将有菌的材料或纯粹的菌种转移到另一无菌的培养基上，这个过程就称为接种。

常用的接种方法如下：
1.斜面接种：从已长好微生物的菌种管移接到另一斜面管的方法。

左手持菌种管和斜面管，使斜面向上，并尽量放平。

用右手先将棉塞拧转松动，再拿接种环，灭菌后，接种。

此法用于好气性微生物的接种。

2.液体接种：由斜面菌接种到液体培养基（如试管或三角瓶等）中的方法。

在将接种环送入液体培养基中时，使环在液体与管壁接触的地方轻轻磨擦，使菌体分散，然后塞上棉塞，再轻轻摇动均匀，即可培养。

如果菌种是培养在液体培养基中时，一般用移液管或滴管接种。

3.穿刺接种：用接种针挑取菌种后，插入深层固体培养基内，（不要刺到底部），再沿原路拔出，此法用于厌气性细菌接种、检查细菌的运动能力。

4.平板接种：将菌种接至培养皿的方法，平板接种的目的是观察菌落形态、分离纯化菌种，活菌计数以及在平板上进行各种试验时采用的一种接种方法，可分为下面几种：
不同微生物在特定培养基上形成的菌落
（1)斜面接平板
a.划线法：见平板划线分离法。

b.点种法：一般用于观察霉菌和酵母细胞，轻轻点在平板的表面（根霉点一点，曲霉、酵母可点 3-4 点）即可。

（2)平板接斜面：一般是将经平板分散培养得到的单菌落接种到斜面，以便作鉴定或扩大培养、保存之用。

[注意事项] 不同种类的微生物，其培养温度、培养时间有所不同。

五实验报告
1．观察划线分离的菌落形态。

2．稀释分离时，为何要将融化的培养基冷却到50℃左右，才倒入装有菌液的培养皿内？。