真菌药敏试验简介

真菌药敏试验简介
真菌体外药物敏感试验简介
刘根焰，赵旺胜
南京医科大学第一附属医院医学检验科/南京医科大学检验系, 南京210029 随着移植、肿瘤和免疫缺陷患者的增多，侵袭性真菌感染（Invasive fungal infections ，IFI）病例也明显增加；随着临床真菌耐药性的出现，经验性抗真菌治疗越来越困难；随着新的抗真菌药物不断投入临床，传统的抗真菌药物敏感试验标准已难以覆盖。

诸多因素都要求临床微生物室真菌药物敏感试验能够与时俱进。

然而，当前国内临床微生物室真菌药物敏感试验开展的情况却不容乐观，首先表现在开展这项临床服务的实验室少，多局限于少数教学医院；其次，各个实验室采用的方法参差不齐，相互之间的结果可比性差。

为此，本文将介绍临床真菌药物敏感试验的标准参考方法和市场上关于真菌药物敏感试验的仪器和试剂，希望有助于各级医院临床真菌药物敏感试验的规范化开展。

1.真菌体外药物敏感试验的基本概念
1.1 常见抗真菌药物介绍
开展真菌药物敏感试验前提是了解抗真菌药物的基本知识，包括分类、作用机制及抗真菌特性，见表1[1]。

对于不能从上述特性中推断出药物敏感性结果的部分进行体外药物敏感试验。

表1 常见抗真菌药物简介
分类代表药物作用机制抗真菌作用
多烯类两性霉素B 直接和细胞膜上的麦角固
醇结合，导致细胞膜对单
价和二价阳离子的通透性
增加而导致细胞死亡。

对念珠菌、隐球菌、球孢子菌、孢子丝菌、芽生菌、毛霉菌和大部分曲霉敏感，对土曲霉、构巢曲霉、Aspergillus fumigateaffinis 和Aspergillus lentulus天然耐药。

三唑类酮康唑
氟康唑
伊曲康唑
伏立康唑通过抑制真菌细胞色素
P450 依赖的-羊毛甾醇14α
-去甲基化酶作用，导致麦
角固醇合成受阻
氟康唑抗菌谱窄,对大多数念珠
菌、隐球菌有效，对曲霉无抑制
活性,对克柔念珠菌天然耐药；伊
曲康唑较氟康唑抗菌谱宽,并对曲
1
泊沙康唑舍他康唑霉有抑制作用；伏立康唑较氟康唑抗菌谱宽,并对曲霉、镰刀菌和其它透明丝孢霉有抑制作用；泊沙康唑抗菌谱最宽,对念珠菌,曲霉、镰刀菌、接合菌和其它透明丝孢有效；舍他康唑主要对皮肤癣菌和念珠菌抗菌活性较强
烯丙胺类特比萘芬
萘替芬抑制角鲨烯环氧化酶而干
扰麦角固醇的生物合成。

对皮肤癣菌如发癣菌（红色发癣
菌、须疮癣菌、断发癣菌、堇色
发癣菌）、犬小孢子菌和絮状表
皮癣菌有杀菌活性，对念珠菌有
抑菌活性。

氟胞嘧啶5-氟胞嘧啶通过真菌细胞的渗透酶系
统进入细胞内，转换为氟
尿嘧啶，替代尿嘧啶进入
真菌的脱氧核糖核酸中，
从而阻断核酸的合成。

抗真菌谱窄，仅对酵母菌(新型隐球菌)和酵母样菌(念珠菌属)有较高的活性。

棘白菌素卡泊芬净
米卡芬净
安尼芬净抑制真菌细胞壁β-(1,3)-
D-葡聚糖的合成而干扰细
胞壁合成
棘白菌素类抗真菌药对于念珠
菌，曲霉等均有良好的抑制活
性，对于一些双相真菌如组织胞
浆菌、粗球孢子菌、皮炎芽生菌
等也有抑制作用，但是对于新生
隐球菌、镰刀菌、接合菌和白吉
利毛孢子菌等无抑制活性。

1.2 MIC：最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）是指按照标准操作规程进行真菌药物敏感试验时，在特定培养时间内，能完全或显著抑制真菌生长的最低药物浓度。

真菌药敏试验的MIC不同于细菌之处在于与无药对照组比较，有些药物MIC要求完全抑制，有部分药物只要求部分抑制即可。

如CLSI M27-A3中规定酵母菌稀释法药物敏感试验结果判读时，唑类药物MIC值判读标准为宏量法达到80%生长抑制，微量法达到50%抑制的最低药物浓度，而对于两性霉素B，则要求达到100%生长抑制。

1.3 MFC: 最低杀真菌浓度（minimum fungicidal concentration，MFC) 是指与无药对照组比较，抗真菌药物能杀死99%到99.5% 受试菌量的最低药物浓度；MFC测定通常以培养72小时后，从微量试验孔和无药对照孔中各吸取20 μl 菌悬液，倾注沙保罗葡萄糖琼脂平2
板，培养48h 后进行活菌计数，小于3 CFU的最低药物浓度即MFC。

更多研究认为，MFC相比较MIC更能准确反映抗真菌药物的体内疗效。

1.4 MEC: 最低有效浓度（minimum effective concentration，MEC) 是指曲霉菌在含系列浓度的棘白菌素类抗真菌药物的培养基中培养时，显微镜下开始观察到菌丝变短、变粗和高度分叉改变的最低药物浓度。

现有研究认为由于拖尾生长现象，曲霉菌对棘白菌素类药物
MIC值波动很大，MEC比MIC更能反映药物的体内疗效，建议体外药物敏感试验以MEC取代MIC，CLSI M38-A2文件首次定义了MEC 的基本概念并附有棘白菌素类药物MIC和MEC结果判读的比较和指控菌株的MEC范围[2]。

1.4 S-DD：剂量依赖性敏感（Susceptible-Dose Dependent ，S-DD）是指提高给药剂量后，血液及组织中的药物浓度仍可高于MIC 浓度，即体内敏感；S-DD反映药物剂量和生物利用度的最大化对治疗成功至关重要。

其次，S-DD也是一个浓度缓冲区间，尤其是对于毒副作用大的药物，可以避免因实验误差导致的小的乃至失控性的损伤。

1.5 拖尾现象：拖尾现象（trailing endpoints phenomenon）是指氟胞嘧啶和唑类药物对酵母菌体外药物敏感试验时，因为部分生长受抑制现象，使得该类药物（尤其是氟康唑）48 h判读MIC结果受到影响，即24 h无拖尾现象时MIC低，而48 h因为拖尾生长，MIC值显著升高[3]。

这种拖尾生长导致的MIC升高经体内研究证实其实际仍属敏感，探讨拖尾现象的原因及影响因素的研究也不断出现，包括培养基pH值、葡萄糖含量、微孔板底的形状及培养基中添加美兰等均可改变拖尾现象[4-5]。

2 真菌体外药物敏感试验标准化溯源
自上世纪80年代NCCLS成立真菌药敏试验专业委员会，到1997年，NCCLS发布第一个真菌药物敏感试验的标准化文件M27-A，真菌药物敏感试验开始朝专业化、标准化发展，目前，国内外广泛认可的真菌药物敏感试验标准化方法主要有美国临床实验室标准化协会（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）发布的最新方法和欧洲抗生素
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药物敏感试验委员会（The European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing，EUCAST）发布的最新真菌药物敏感试验方法（见表2）[6-9]。

表2 真菌药物敏感试验的标准化文件溯源
时间简称中文全名
CLSI有关真菌药物敏感试验的标准化文件：
2008 M27-A3酵母菌稀释法药物敏感试验的参考方法-第三版
2008 M27-S3酵母菌稀释法药物敏感试验的参考方法-第三版信息补充
2009 M44-A2 酵母菌纸片扩散法药物敏感试验-第二版
2009 M44-S3 酵母菌纸片扩散法药物敏感试验判读标准和质量控制-信息补充
2008 M38-A2 丝状真菌稀释法药物敏感试验的参考方法-第二版2010 M51-A 非皮肤来源的丝状真菌纸片扩散法药物敏感试验方法
2010 M51-S1 丝状真菌纸片扩散法药物敏感试验判读标准和质量控制-信息补充EUCAST有关真菌药物敏感试验的标准化文件：2008 E.DEF.7.1糖发酵型酵母菌稀释法MIC检测参考方法
2008 E.DEF.9.1 丝状真菌稀释法药物敏感试验的参考方法
3 真菌体外药物敏感试验方法
真菌体外药物敏感试验方法主要有稀释法、琼脂扩散法和这些参考方法衍生出来的真菌药物敏感试验的仪器和相应试剂。

3.1 稀释法
稀释法分为酵母菌稀释法和丝状真菌稀释法药物敏感试验，酵母菌稀释法药物敏感试验的基本步骤和参数见表3，主要溯源于CLSI M27-A3和CLSI M27-S3文件。

表 3 酵母菌稀释法药物敏感试验
主要参数详细内容
培养基培养基：含谷氨酰胺和酸碱指示剂的RPMI-1640溶液。

缓冲液：0.164 M (34.53 g/l)浓度的丙磺酸吗啉缓冲液
（morpholinepropanesulfouic acid, MOPS)。

pH值范围：6.9–7.1。

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配制方法：10.4g RPMI-1640+18g葡萄糖+34.53g MOPS 溶解于
900ml无菌水，定容到1000ml，然后用0.22μm的滤膜过滤，
4 ℃贮存备用。

适应症念珠菌属和隐球菌属
药物贮存液一般用无菌水或相应溶剂将原料药配成100倍初始应用浓度的溶液。

稀释方案用RPMI 1640培养基进行2倍系列稀释，水溶性药物采用1:5稀释到初始浓度，非水溶性药物采用1:50稀释到初始应用浓度。

氟康
唑和氟胞嘧啶的浓度范围： 64–0.06 μg/ml；两性霉素B、安尼
芬净、卡泊芬净、米卡芬净、伊曲康唑、泊沙康唑、伏立康
唑、雷夫康唑和酮康唑的浓度范围: 16–0.03 μg/ml。

加药方案宏量稀释法采用12×75 mm的试管，每管加0.1ml；微量法采用U 型底的96孔培养板，每孔加0.1ml，加好药的试管或培养板－
80℃可保存6个月，－20℃可保存2个月。

培养物准备取新鲜培养的沙氏培养基上的酵母菌（培养24h）或新生隐球菌（培养48h）的菌落3-5个，无菌生理盐水调节菌悬液浊度为0.5
麦氏浊度。

受试菌浓度0.5 麦氏浊度相当于1×106 到5×106 CFU/ml的数量。

宏量稀释法用RPMI-1640培养基将菌悬液进行1:2000倍稀释，微量稀释法用
RPMI-1640培养基将菌悬液进行1:1000倍稀释。

宏量法每管加0.9
ml菌液（最终体积为1ml），微量法每孔加0.1 ml菌液（最终体积为0.2ml），相当于受试菌终浓度为0.5×103到2.5×103 CFU/ml
之间；如果是新生隐球菌，受试菌终浓度应调节为1×104
CFU/ml。

孵育温度35℃普通培养
孵育时间念珠菌属对棘白菌素类药物培养24h，其他药物培养48h
新生隐球菌对于唑类、氟胞嘧啶和两性霉素B均培养72h
结果判读唑类和5-氟胞嘧啶，MIC值判读采用和培养48h后的无药对照管（孔）比较，宏量法达到80%生长抑制，微量法达到50%抑制的
最低药物浓度；对于两性霉素B，培养48h后，要求达到100%
生长抑制，即肉眼澄清的标准；对于棘白菌素类药物，培养24h
后至少达到50%生长抑制。

敏感折点(mg ? L)氟康唑: S ≤ 8, SDD = 16–32; R ≥ 64
伊曲康唑: S ≤ 0.125, SDD = 0.25–0.5; R ≥ 1 (只适用于粘膜感染) 伏立康唑: S ≤ 1, S DD = 2; R ≥ 4
氟胞嘧啶: S ≤ 4; I = 8–16; R ≥ 32
棘白菌素类: S ≤ 2 (只有敏感折点)
质控菌株克柔念珠菌（Candida krusei ATCC 6258）
近平滑念珠菌（Candida parapsilosis ATCC 22019）
质控范围ATCC 6258 ATCC 22019
5
(mg ? L) 两性霉素B 0.12–1.0 0.12–1.0
氟胞嘧啶 1.0–4.0 0.12–0.5
氟康唑16.0–64.0 0.5–2.0
伊曲康唑0.03–0.12 0.03–0.12
伏立康唑0.03–0.25 0.015–0.06
泊沙康唑0.015–0.06 0.015–0.06
欧洲抗生素药物敏感试验委员会真菌专业委员会（EUCAST-AFST）文件EUCAST-EDEF7.1所描述的酵母菌稀释法药物敏感试验的主要操作步骤和CLSI的M27-A3文件相同，略有不同之处见表4。

表4 CLSI M27-A3和 EUCAST-EDEF.7.1不同点参数CLSI M27-A3EUCAST-E. EDEF7.1
适应症
接种菌培养基微孔板孵育温度孵育时间判读方法判读标准念珠菌属，隐球菌属
0.5-2.5×103 CFU/ml
RPMI 1640添加 0.2%葡萄糖
U型底
35℃
24-48h
肉眼判读
两性霉素B：100%抑制；唑类对
念珠菌：50%抑制
发酵糖的酵母菌，不适用于隐球菌
属和双向性真菌
0.5-2.5×105 CFU/ml
RPMI 1640添加 2%葡萄糖
平底
35-37℃
24h
分光光度计测量
5氟胞嘧啶和唑类对念珠菌：50%
抑制；两性霉素B：90%抑制
丝状真菌稀释法药物敏感试验基本步骤和酵母菌相同，不同之处在于接种物的浓度、培养的时间和结果判读的标准。

目前，标准参考方法主要溯源于CLSI M38-A2和EUCAST E.DEF 9.1两个文件，详细步骤和参数见表5[10]。

表5 丝状真菌稀释法药物敏感试验
参数CLSI M38-A2 EUCAST E.DEF 9.1
适应症产孢子丝状真菌曲霉菌和毛霉菌
接种物0.4 ~5 × 104 CFU/ml 2 ~ 5 × 105 CFU/ml
接种物计数分光光度计血细胞计数器
培养基RPMI 1640 RPMI 1640添加2% 葡萄糖
缓冲液MOPS, pH 7.0 ± 0.1 MOPS, pH 7.0 ± 0.1
6
微孔板U 型底平底
模式微量稀释法微量稀释法
孵育温度35°C 35 ± 2°C
孵育时间48 h 48 h
终点判读直视法无生长直视法无生长
3.2纸片扩散法真菌药物敏感试验
真菌稀释法药物敏感试验费时费力，难以在临床实验室广泛开展。

为此，CLSI 推出了纸片扩散法药敏试验，包括M44-A2规定的酵母菌纸片扩散法和M51-A非皮肤来源丝状真菌纸片扩散法药物敏感试验标准。

纸片扩散法具有方便、经济和快速的优点，适合在临床微生物实验室广泛开展。

结果准确性而言，酵母菌优于丝状真菌，丝状真菌纸片扩散法结果和标准MIC检测结果变异较大，还有许多有待进一步优化。

有关纸片扩散法的具体操作及要求见表6和表7。

表6 酵母菌纸片扩散法药物敏感试验
主要参数详细内容
培养基MH琼脂添加2%葡萄糖和0.5 mg/L的美兰（MH+GMB），葡萄
糖有利于真菌生长，美兰增加抑菌圈的清晰度。

pH 值7.2 ~7.4
适用范围目前只用于念珠菌属
接种物准备经血琼脂或沙保罗琼脂次代培养的新鲜菌落，采用直接菌落悬液
法，挑取1mm大小菌落5个左右，于5ml生理盐水中调节菌液浊
度为0.5麦氏浊度，约1~5 × 106 CFU/ml
涂布平板调好浊度的菌悬液要求15min内均匀涂布MH+GMB平板
贴药敏纸片平板涂好菌液后，放置3~5min，不超过15min，无
菌镊子贴相应
的真菌药敏纸片，保持纸片间间距大于24mm。

孵育温度35 °C (± 2 °C)
孵育时间20~24 h, 但光滑念珠菌、克柔念珠菌和近平滑念珠菌常需要培养
48 h。

结果判读（mm） S S-DD R
氟康唑（25μg）≥19 15 - 18 ≤14
伏立康唑（1 μg）≥17 14 - 16 ≤13
卡泊芬净（5μg）≥11（只有敏感标准）
注：结果判读时抑菌圈内允许有薄层真菌生长和零星菌落存在。

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质控菌株Candida albicans ATCC 90028；Candida parapsilosis ATCC
22019;Candida tropicalis ATCC 750；Candida krusei ATCC 6258
质控范围（mm）
ATCC 90028 ATCC 22019 ATCC 750 ATCC 6258 氟康唑（25 μg）28 – 39 22 - 33 26 - 37 —
伏立康唑（1 μg） 31 - 42 28 – 37 — 16 - 25 表7 丝状真菌纸片扩散法药物敏感试验
主要参数详细内容
培养基普通MH琼脂
pH 7.2–7.4
接种物准备马铃薯葡萄糖琼脂上生长7天的菌落，洗脱孢子，调节孢子浓度为
0.09~0.30吸光度（λ=530 nm），相当于0.4–5.5 × 106 CFU/ml
孵育温度和时间烟曲霉、黄曲霉和黑曲霉35°C培养24 h；接合菌培养16–24 h；其他霉菌培养 24–72 h不等。

可选药物两性霉素B 10 μg ；卡泊芬净5 μg；伊曲康唑10 μg；泊沙康唑5 μg；
伏立康唑1 μg
抑菌圈测量达到80%抑制时的抑菌圈直径，对于卡泊芬净，应该忽略抑菌圈内微小克隆生长；对于三唑类药物，允许一定的拖尾现象存在。

折点范围唑类和卡泊芬净: R ≤ 13 mm (MIC或MEC ≥ 4 mg/L);
I = 14–16 mm
(MIC 或MEC = 2 mg/L); S ≥ 17 mm (MIC 或MEC ≤ 1 mg/L)
两性霉素B: R ≤ 12 mm; I = 13–14 m m; S ≥ 15 m m
质控菌株宛氏拟青霉ATCC MYA-3630, 克柔念珠菌ATCC MYA-6258
质控范围药敏纸片ATCC MYA-3630 ATCC 6258
伊曲康唑10 μg 25–31 21–30
伏立康唑1 μg 40–53 29–38
泊沙康唑5 μg 35–46 31–43
卡泊芬净(BBL) 5 μg 23–29 14–24
两性霉素B 10 μg 13–22 19–27
3.3真菌药物敏感试验相关仪器及产品介绍
基于UECAST和CLSI文件的真菌药物敏感试验参考方法相对准确、有利于实验室之间的结果比较和和合作研究，但是上述方法费钱费力，很难在常规临床实验室开展。

因此，目前市场陆续推出了一些用于真菌药敏试验的仪器和试剂，如AB BIODISK公司
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的E-test纸条、梅里埃公司的ATB? Fungus 3、ROSCO公司的Neo-Sensitabs TM药敏片、美国Trek公司的Yeast One等等，这些仪器或试剂能否满足临床需要，关键要看其是否准确、经济和方便，表8列出了目前国内外真菌药物敏感试验有关的商业化仪器和试剂[11]。

表8 用于真菌药物敏感试验的仪器和试剂
Sensititre? YeastOne?比色法真菌药敏板
生产商Trek Diagnostics,美国
原理属肉汤稀释法的改良，产品利用Alamar Blue指示剂，侦测培养基中真菌生长引起的氧化还原电势的改变，表现为指示剂的颜色从红色到蓝紫色的改
变，从粉红色变为蓝紫色的孔中的药物浓度即判读为MIC值。

适用范围酵母菌、隐球菌和曲霉菌
检测药物包括两性霉素B、氟康唑、伊曲康唑、酮康唑、5-氟胞嘧啶和新上市的伏立康唑、泊沙康唑、卡泊芬净、米卡芬净和安尼芬净。

评价该方法可选择的药物多，每种药物均含多个梯度浓度，且操作方便，大部分结果和M27-A3参考方法一致性高于90%，氟康唑（82%）和伏立康唑
（85%）一致性略差；从病原角度看，光滑和热带念珠菌的结果和标准方
法比较，一致性较差，但24h判读结果优于48h。

ATB Fungus 真菌药敏试条
生产商bioMe′rieux，法国
原理属微量稀释法的改良产品，多个梯度浓度的抗真菌药物定量固定在培养孔中，然后加入一定浓度和一定量的菌液，过夜培养（隐球菌要求培养
48h），判读结果。

适用范围酵母菌（念珠菌和隐球菌）
检测药物包含5-氟胞嘧啶、两性霉素B、氟康唑、伊曲康唑和伏立康唑
评价操作方便，可机器判读结果，也可人工判读，该方法结果和CLSI标准方法比较准确率为97.5%，和EUCAST方法比较准确率为94.3%，结果重复性
99%。

；缺点是只适用于酵母菌，可选择的药物品种少，唑类药物的结果
判读困难，结果变异性大。

E-test真菌药敏试条
生产商AB BIODISK，瑞典
原理属琼脂扩散法的改良，培养基采用RPMI 1640加2%的葡萄糖和1.5%的琼脂糖，用MOPs调节pH到7.0。

药敏纸片采用包被梯度浓度抗真菌药物的试
纸条。

适用范围念珠菌、隐球菌和丝状真菌
检测药物包括两性霉素B、5-氟胞嘧啶、氟康唑、伊曲康唑和酮康唑
评价该方法的优点是方便、准确，可同时用于酵母菌、隐球菌和丝状真菌的体外药敏试验，而且研究认为其大部分结果和CLSI标准方法一致性好[12]；该
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方法的缺点是价格昂贵，对光滑念珠菌和热带念珠菌结果不够准确，对曲
霉菌的结果不容易判读，也不够稳定。

Neo-Sensitabs? 抗真菌药敏片
生产商Rosco，丹麦
原理与纸片琼脂扩散法原理相同，不同的是以9mm的抗真菌药物的药片取代6mm的药敏纸片；培养基选用MH琼脂+ 2% 葡萄糖+0.5 μg/ml美兰；接种
菌量为0.5麦氏浊度；35 °C ±1°C培养20~24h；抑菌圈及结果判读采用产
品推荐的经验性标准。

适用范围酵母菌（包括念珠菌和隐球菌）
检测药物两性霉素B，环己吡酮乙醇胺，克霉唑，益康唑，氟康唑，5-氟胞嘧啶，异康唑，伊曲康唑，酮康唑，咪康唑，游霉素，制霉菌素，特比萘芬，伏
立康唑，卡泊芬净，泊沙康唑
评价适用范围广，操作方便，价格经济，可选药物品种全，药片
相比纸片更稳定，可室温保存；缺点是部分药物抑菌圈小，难以鉴别敏感和耐药，和标
准稀释法结果比较，变异系数大，因此，耐药结果应该用标准方法确认。

4. 小结
真菌药物敏感试验仍在不断发展和完善过程中，现有的标准化方法费时费力、对工作人员的专业技术要求高，各种商业化的仪器和产品是真菌药敏试验的有益补充，更适合在临床开展和应用。

当前，真菌药物敏感试验的合理开展，关键是要求专业人员严格执行标准化操作，熟悉各种方法的优缺点，必要时和标准参考方法进行结果比对。

最后值得注意的是，体外药敏试验结果和临床治疗有效性之间的关系，既往经验认为，体外敏感的药物90%体内有效，体外不敏感的药物，60%体内仍然有效。

因此，体外药物敏感试验真正有效指导临床抗真菌治疗，还必须有机结合患者的免疫状态、药物的体内代谢情况和病原性真菌敏感与耐药的监测数据。

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