分子发光光谱法

内转换
内转换：同多重度电子能级中，等能级间的无辐 射能级交换。 通过内转换和振动弛豫，高激发单重态的电子 跃回第一激发单重态的最低振动能级。
外转换 外转换：激发分子与溶剂或其他 分子之间产生相互作用而转移能 量的非辐射跃迁； 外转换使荧光或磷光减弱或“ 猝灭”。
系间跨越 系间跨越：不同多重态,有重叠的转动能级间的非 辐射跃迁。 改变电子自旋，禁阻跃迁，通过自旋—轨道 耦合进行。
荧光强度对温度变化敏感。
一般地，随温度降低，溶液中荧光物质的量子效率和荧光强
度将增大，并伴随光谱的蓝移。温度增加，碰撞频率增加， 使外转换的去激发几率增加。
(3) pH的影响
对酸碱化合物，溶液pH的影响较大，需要严格控制； 如苯胺：在pH 5-12溶液中，以分子形式存在，有荧光。
pH< 5时以苯胺阳离子形式存在，无荧光
ex em
（3）可变波长同步扫描荧光法：使两单色器在扫描过程中以 不同的速率同时进行扫描，即波长可变。
同步扫描荧光法的特点：
优点：
（1）使光谱简化； （2）使谱带窄化；
（3）减小光谱的重叠现象；
（4）减小散射光的影响。
例如：采用同步扫描技 术检测如图萘、蒽、菲 、芘混合物，可简化光 谱，减少光谱重叠，提 高分辨率。 缺点： 因为同步扫描荧光损失了 其它光谱带所含的信息， 对光谱学的研究不利。
比较法：
在线性范围内，测定标样和试样的荧光强度，直接
比较。
三、荧光分析法的应用
可采用直接测定法或间接测定（荧光猝灭）法
1、无机化合物的分析
与有机试剂配合物后测量；可测量约60多种元素。 铍、铝、硼、镓、硒、镁、稀土常采用荧光分析法； 氟、硫、铁、银、钴、镍采用荧光熄灭法测定； 铜、铍、铁、钴、锇及过氧化氢采用催化荧光法测定； 铬、铌、铀、碲采用低温荧光法测定； 铈、铕、锑、钒、铀采用固体荧光法测定
一、特点
（1）灵敏度高、检测限低 灵敏度比紫外-可见分光光度法高2～4个数量级； （2）选择性强 既可依据特征发射光谱，又可根据特征吸收光谱； （3）尤其适合于生物大分子分析和研究
二、定量依据与方法
1、定量依据
荧光强度 If正比于吸收的光强Ia和荧光量子效率 ： If = Ia = （ I0 - I） 由朗伯-比耳定律： Ia = I0(1-10- l c ) If = I0(1-10- l c ) = I0(1-e-2.3 l c )
Electron donater Heavy atom effect
Electron accepter
2.影响荧光强度的因素—环境因素
(1)溶剂的影响
除一般溶剂效应外， 溶剂的极性、氢键、 配位键的形成都将使 化合物的荧光发生变 化；极性溶剂使 → * 跃迁能量减小 ，所以Em红移。
(2)温度的影响
螯合作用 Chelation
N
OH
8-hydroquinoline
Strong fluorescence
螯合作用往往会增加分子结构的刚性，而增强荧光，利用此 可用荧光法测定金属离子。
（4）简单杂环结构不发射荧光：因其单重态 n- * 很快转 变为三重态 n- *。
（5）取代基效应：芳环上有供电基团，使荧光增强，吸电 子基团使荧光减弱。
分子对光的吸收和发射能级变化情况可用著名的 Jablonski能级图描述
Jablonski
Professor Aleksander Jabłoński (born in 1898, died in 1980) was a Polish physicist. Fluorescence is schematically illustrated with the classical Jablonski diagram, first proposed by Jablonski in 1935 to describe absorption and emission of light.
将上式Taylor展开，浓度很低时，近似处理得：
If = 2.303 I0 l c = kc
定量依据
因为If正比于I0，可通过调节光源强度增加荧光强度。
2、定量方法
标准曲线法： 配制一系列标准浓度试样测定荧光强度，绘制标准 曲线，再在相同条件下测量未知试样的荧光强度，在
标准曲线上求出浓度。
通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形
状一样）成镜像对称关系。
荧光激发光谱
荧光发射光谱
200
ห้องสมุดไป่ตู้
250
300 350 400 450 蒽的激发光谱和荧光光谱
500 nm
镜像规则的机理
基态上的各振动能级分布与 第一激发态上的各振动能级 分布类似； 若基态上的 0 振动能级与第一 激发态的2振动能级之间的跃迁 几率最大，相反跃迁也然。
分子发光光谱法
(Molecular Luminescence Spectroscopy)
分子发光光谱法包括：
光致发光 (Photoluminescence) 分子荧光（Molecular Fluorescence）
分子磷光（Molecular Phosphorescence） 化学发光（Chemiluminescence） 生物发光（Bioluminescence） 电致发光（Electroluminescence）
§1 分子荧光与磷光的基本原理
Principle of molecular fluorescence and phosphorescence
一、分子荧光与磷光的产生
物质分子在一定条件下吸收辐射能而被激发到较高电子能态后， 再返回基态的过程中将以不同的方式释放能量。 荧光和磷光是以发射辐射的形式释放能量，属于光致发光。
1.分子产生荧光必须具备的条件
（1）具有合适的结构； （2）具有一定的荧光量子产率。 荧光量子产率（）：
发射的光量子数 吸收的光量子数
Kf：荧光发射过程的速率常数；

Kf K f Ki
ΣKi ：无辐射跃迁过程速率常数总和
荧光量子产率与激发态能量释放各过程的速率常数K有关， 如外转换过程速度快，不出现荧光发射.
主要组成部分：
单色器Monochromator：选择激发光波长的第一单色器
和选择发射光(测量)波长的第二单色器；
光源Sources ：氙灯（300—1200nm)、高压汞灯、染料激
光器(可见与紫外区)；
检测器Detectors ：光电倍增管、CCD
仪器光路图
§3 分子荧光光谱法的应用
Application of the molecular fluorescence
Aleksander Jabłoński
1. Jablonski能级图
内转换 S2 振动弛豫 内转换 系间跨越
S1 能 量 T1
T2
吸 收
发 射 荧 光
外转换
发 射 磷 光
振动弛豫
S0
λ1
λ2
λ 2
λ3
S单重态
Jablonski diagram
T三重态
电子激发态的多重性：M=2S+1 （S为总自旋量子数）； M=1（S=0）单重态用S表示； M=3（S=1）三重态用T表示； 电子自旋状态：平行自旋比成对自旋稳定(洪特规则)； 三重态能级（平行自旋）比相应单重态（成对自旋）能级低。
延迟荧光
延迟荧光（delayed fluorescence)也被称为缓发荧光，它来源 于从第一激发三重态（T1）重新生成的S1态的辐射跃迁。 单重态的寿命一般为10-8秒， 最长可达10-6秒，但有时却可以 观察到单重态寿命长达10-3秒， 这种长寿命的荧光被称为延迟 荧光。其寿命与该物质的分子 磷光相当。 延迟荧光在激发光源熄灭后， 可拖后一段时间，但和磷光 又有本质区别，同一物质的 磷光总比发射荧光长。
λex＝260nm
2. 荧光的激发光谱
让不同波长的激发光激发荧光物质使之发生荧光， 而让荧光以固定的发射波长照射到检测器上，然后 以激发光波长为横坐标，以荧光强度为纵坐标所绘 制的图，即为荧光激发光谱。 激发光谱曲线的最高 处，处于激发态的分子 最多，荧光强度最大.
λem＝370nm
3. 同步荧光光谱
二、激发光谱与荧光光谱
Excitation spectrum and Emission spectrum 测量荧光的仪器结构
1.荧光发射光谱
固定激发光的波长和强度保持不变，而让荧光物质 所发出的荧光通过发射单色器照射于检测器上，亦 即进行扫描，以荧光波长为横坐标，以荧光强度为 纵坐标作图，即为荧光光谱，又称荧光发射光谱。 发射光谱曲线的 最高处，发射荧光 强度最大，选择此 波长进行定量分析 最灵敏。
S0→T1 禁阻跃迁； 几率小
2．分子的去激过程
电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过辐射跃 迁(发光)和无辐射跃迁等途径和方式失去能量:
传递途径 辐射跃迁 无辐射跃迁
荧光
延迟荧光
磷光
系间跨越 内转移
外转移
振动弛豫
（1）非辐射能量传递过程 振动弛豫 振动弛豫：同一电子能级内以热能量交换形式由高 振动能级至低相邻振动能级间的跃迁。发生振动弛豫 的时间10 -12 s。
pH> 12时以苯胺阴离子形式存在，无荧光
(4)荧光猝灭 Fluorescence Quenching
荧光分子与溶剂或其它溶质分子之间相互作用，使荧光强度 减弱的作用称为荧光猝灭。 能引起荧光强度降低的物质称为猝灭剂。 荧光猝灭包括： 动态猝灭是被激发的荧光分子与猝灭剂发生碰撞，从而使荧 光分子以无辐射形式跃迁回到基态而使荧光猝灭。如：溶解 氧是常见碰撞猝灭剂； 静态猝灭是荧光分子与猝灭剂形成不发荧光的基态配合物从 而使荧光猝灭； 浓度猝灭（自猝灭）； 能量转移。
2.影响荧光强度的因素—分子结构
（1）跃迁类型：*→的荧光效率高（高于*→n），且系间 跨越过程的速率常数小，有利于荧光的产生； （2）共轭效应：提高共轭度有利于增加荧光效率并产生红移. （3）刚性平面结构： 可降低分子振动，减少 与溶剂的相互作用，故 具有很强的荧光。如荧 光素和酚酞有相似结构， 荧光素有很强的荧光， 酚酞却没有。
（2）辐射能量传递过程 荧光发射：电子由第一激
荧光发射
发单重态的最低振动能级
→基态（ 多为 S1→ S0跃 迁），发射波长为 ’2的 荧光； 10-7～10 -9 s 。 发射荧光的能量比分子
， 2
吸收的能量小， ’2 > 2
> 1；
磷光发射
磷光发射：电子由第一激发三重
态的最低振动能级→基态（ T1 → S0跃迁）； 电子由S0进入T1的可能过程： （ S0 → T1禁阻跃迁） S0 →激发→振动弛豫→内转移→ 系间跨越→振动弛豫→ T1 发光速度很慢： 10-4～10 s 。 光照停止后，可持续一段时间。
在同时扫描激发和发射单色器波长的条件下，测绘光谱图， 所得到的荧光强度—激发波长（或发射波长）曲线为同步荧 光光谱。 测定同步荧光光谱有三种方法： （1）固定波长同步扫描荧光法：在扫描过程中，激发波长和 发射波长有一个固定的波长差，即△λ＝λem-λex＝常数； （2）固定能量同步扫描荧光法：使发射单色器与激发单色器 之间保持一个恒定的波数差，即 ( 1 1 ) 107 v 常数
4. 三维荧光光谱
以荧光强度为激发波长和发射波长的函数得到的光谱图为三 维荧光光谱，也称总发光光谱，等高线光谱。
（1）三维曲线光谱图； （2）平面显示的等强度线光谱图
5、荧光光谱的特征
（1）Stokes位移 由于振动弛豫及溶剂分 子弛豫作用消耗了部分
能量，使发射光谱的波
长比激发光谱的长。
（2） 镜像对称规则
（3）发射光谱的形状与激发波长无关
电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量(如能级图 2 ,1)，产生不同吸收带，但均回到第一激发单重态的最低振 动能级再跃迁回到基态，产生波长一定的荧光(如’2 )。
三、影响荧光强度的因素
Variables that affect fluorescence & phosphorescence
(5)内滤作用和自吸现象
内滤作用：溶液中含有能吸收激发光或荧光物质发
射的荧光，如色胺酸中的重铬酸钾； 自吸现象：化合物的荧光发射光谱的短波长端与其 吸收光谱的长波长端重叠，产生自吸收。
§2 分子荧光光谱仪
Molecular fluorescence spectrometer
一、仪器结构
测量荧光的仪器主要组成部分：激发光源、激发单色器、样 品池、发射单色器、检测器。 特殊点：有两个单色器，光源与检测器通常成直角。