基因治疗的原理与研究概况PPT课件
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2. 旁观者效应
*
*
(五)基因免疫治疗
通过将抗癌免疫增强的细胞因子或MHC基因导入肿瘤组织,以增强肿瘤微环境中的抗癌免疫反应。
*
*
二、基因转移技术
*
*
基因治疗的两种途径
载体
目的基因
in vivo
ex vivo
靶细胞
*
*
基因转移(gene transfer)技术:
1.病毒介导的基因转移 2.非病毒介导的基因转移
4.靶向性差。
1.不能整合到靶细胞的基因组DNA中。分裂增殖快的细胞,导入的重组病毒载体,随分裂而丢失的机会增多,表达时间相对较短。
(1)腺病毒产生过程中与293辅助细胞内E1区序列发生同源重组; (2)腺病毒载体与被治疗的患者体内已感染的野生型腺病毒,甚至乳头瘤病毒、巨细胞病毒发生重组。
*
*
(3)腺病毒相关病毒载体 腺病毒相关病毒(adenovirus associated virus,AAV)是一类单链线状DNA缺陷型病毒。其基因组DNA小于5 kb,无包膜,外形为裸露的20面体颗粒。AAV不能独立复制,只有在辅助病毒(如腺病毒、单纯疱疹病毒、痘苗病毒)存在时,才能进行复制和溶细胞性感染,否则只能建立溶源性潜伏感染。
③前病毒通过LTR高效整合至靶细胞基因组中,有利于外源基因在靶细胞中的永久表达。
④包装好的假病毒颗粒(携带目的基因的重组逆转录病毒载体)以出芽的方式分泌至辅助细胞培养的上清液中,易于分离制备。
*
*
逆转录病毒载体的主要缺点
随机整合,有插入突变、激活癌基因的潜在危险; 逆转录病毒载体的容量较小,只能容纳7 kb以下的外源基因。
*
*
1.病毒介导的基因转移系统
病毒载体介导的基因转移效率较高,因此它也是使用最多的基因治疗载体。据统计,有72﹪的临床实验计划和71﹪的病例使用了病毒载体,其中用得最多的是逆转录病毒载体。
*
*
Retrovirus
(1)逆转录病毒
*
*
*
*
(1)两端各有一长末端重复序列LTR。
*
*
自杀基因的作用机制
*
*
☻TK/GCV 单纯疱疹病毒(herps simplex virus, HSV)Ⅰ型胸苷激酶(thymidine kinase, tk)基因编码胸苷激酶,特异性地将无毒的核苷类似物丙氧鸟苷(ganciclovir, GCV)转变成毒性GCV三磷酸核苷,后者能抑制DNA聚合酶活性,导致细胞死亡。
基因治疗的原理与研究概况
*
基因治疗分类
体细胞(somatic cell)基因治疗 生殖细胞(germline)基因治疗
只限于某一体细胞的基因的改变 只限于某个体的当代 对缺陷的生殖细胞进行矫正 当代及子代
*
*
1. 基因治疗的策略
内容提要
2. 基因转移技术
4. 治疗基因的受控表达
3. 基因干预
*
*
基因同源重组技术又称为基因打靶(gene targeting) 定向整合的条件:转导基因的载体与基因组DNA具有相同的序列。带有目的基因的载体就能找到同源重组的位点,进行部分基因序列交换。
基因同源重组技术
*
*
要实现基因置换,需要采用同源重组技术使相应的正常基因定向导入受体细胞基因组的缺陷部位。
*
*
三、基因干预
*
*
(一)反义RNA 1. 反义RNA与基因表达调控 利用反义RNA对体外培养的细胞进行基因表达调控,通常采用的方法有两种: (1)体外合成反义RNA,直接作用于培养细胞,细胞吸收RNA后,发挥作用。 (2)构建一些能转录反义RNA的重组质粒,将这些质粒转入细胞中,转录出反义RNA而发挥作用。
*
*
3. 反义RNA的应用前景
受体介导的反义RNA基因治疗有其自身的优点,而在 一定程度上补充了转基因治疗的不足。
*
*
*
*
腺病毒的优点
1.基因导入效率高,对人类安全;
2.宿主范围广;
3.基因转导与细胞分裂无关;
4.重组腺病毒可通过口服经肠道吸收、或喷雾吸入或气管内滴注;
5.腺病毒载体容量较大,可插入7.5 kb外源基因。
*
*
腺病毒载体缺点
2.宿主的免疫反应导致腺病毒载体表达短暂。
3.有两个环节可能产生复制型腺病毒。
*
*
脂质体介导的基因转移示意图
*
*
(2)受体介导转移技术
将DNA与细胞或组织亲和性的配体偶联,可使DNA具有靶向性。这种偶联通常通过多聚阳离子(如多聚赖氨酸)来实现。多聚阳离子与配体共价连接后,又通过电荷相互作用与带负电荷的DNA结合,将DNA包围,只留下配体暴露于表面。这样形成的复合物可被带有特异性受体的靶细胞吞饮,从而将外源DNA导入靶细胞。
*
*
受体介导转移技术示意图
*
*
(3)基因直接注射技术 不需要进行基因工程的繁琐操作,直接将裸露DNA注入动物肌肉或某些器官组织内。 动物实验表明:接受注射外源DNA的小鼠能够按其基因编码合成相应的蛋白质,并能维持数月之久。 1.将促进心脏血管生长的基因直接注入实验鼠的心脏,可使其心脏壁内毛细血管增加30﹪～40﹪; 2.将胰岛素基因直接注入鼠骨骼肌细胞,能分泌糖尿病所缺少的胰岛素; 3.肌内注射凝血因子Ⅸ基因,可产生血友病所需的凝血因子Ⅸ 。
*
*
(2)腺病毒(adenovirus,AV)载体 腺病毒是一种大分子(36 kb)双链无包膜DNA病毒。它通过受体介导的内吞作用进入细胞内,然后腺病毒基因组转移至细胞核内,保持在染色体外,不整合进入宿主细胞基因组中。 腺病毒是人类呼吸道感染的病原体,但目前尚未发现与肿瘤发生有关联。宿主细胞范围广,可感染分裂和非分裂终末分化细胞,如神经元等。
*
*
基因直接注射法的优点
1.制备具有调控部件的质粒DNA重组体的技术较容易; 2.排除病毒载体可能潜在的致癌性或其他副作用; 3.导入的基因不需整合即可表达,避免了逆转录病毒载体导入整合后,一旦发生副作用不易中止或逆转的缺点; 4.基因直接注射法可反复使用,而病毒载体则可能诱导体内免疫应答,致使反复治疗效果下降。
*
*
反义RNA的关键技术问题:
☻反义RNA进入靶细胞前的降解问题
☻专一性转移问题:
*
*
2.受体介导反义RNA技转移术
①受体介导的RNA转移十分专一,而且效率高; ②被转移的RNA是被保护的,与周围环境之间存在多聚赖氨酸的保护层, 可以抵抗环境中的核酸酶的降解作用。
将脱唾液酸血清类粘蛋白(ASGP)与多聚赖氨酸(PL)共价连接,得到ASGP-PL复合物,成为运载核酸的工具。ASGP-PL反义RNA复合物可以专一性地被肝细胞表面的ASGP受体所识别,并吞噬到肝细胞中,反义RNA进入肝细胞后,可被逐渐释放出来发挥作用。
借助前述的受体介导基因转移方法,可以实现受体介导的反义RNA转移。
AAV Virus Particles
*
*
Structure of AAV Virus Genomic DNA
REP:病毒复制基因, CAP:编码衣壳蛋白的基因
ITR:反向末端重复序列
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*
AAV的特点
● 以潜伏感染为主; ● 病毒基因组与细胞共存; ● 只要宿主细胞正常,AAV基因表达被抑制而维持潜伏状态; ● 若细胞受刺激,表达应激基因,AAV基因表达从而使AAV病毒复制; ● 产生子代病毒并释放,又感染新的细胞,建立新的潜伏状态。
5. 基因治疗的应用研究
*
*
一、基因治疗的策略
*
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(一)基因置换(gene replacement)
定义:指将特定的目的基因导入特定细胞,通过定位重组,导入的正常基因,以置换基因组内原有的缺陷基因。
目的:将缺陷基因的异常序列进行桥正。 对缺陷基因的缺陷部位进行精确的原位修复,不涉及基因组的任何改变。
定向导入的发生率约1/100万,采用胚胎干细胞培养的方法,同源重组的检出率最高可达1/10。
*
*
(二) 基因添加
基因添加(gene augmentation): 通过导入外源基因使靶细胞表达其本身不表达的基因。
类型: 在有缺陷基因的细胞中导入相应的正常基因,而细胞内的缺陷基因并未除去,通过导入正常基因的表达产物,补偿缺陷基因的功能; 向靶细胞中导入靶细胞本来不表达的基因,利用其表达产物达到治疗疾病的目的。
AAV载体容量小，目前最多只能容纳5 kb外源DNA片段；
感染效率比逆转录病毒载体低。 在40%-80%的成人中存在过感染，
可能会引起免疫排斥。
*
*
常用基因治疗载体
整合
致病性
感染细胞
克隆容量
逆转录病毒 载体
随机整合，效率高
可能致病
分裂细胞
<7kb
腺病毒载体
不整合，可能丢失
逆转录病毒前病毒的结构特点
(2)LTR由U3、R和U5三部分组成。
(3)病毒有三个结构基因
(4)5ˊ端LTR下游有一段病毒包装所必需的序列(ψ)及剪接供体位点(SD)和剪接受体位点(SA)。
(5)含有负链DNA转录的引物结合位点(PBS)和正链DNA转录的引物结合位点。
(1)在U3内有增强子和启动子; (2)U3和U5两端分别有病毒整合序列(IS) ; (3)在R内还有poly(A)加尾信号。
不致病
分裂细胞、非分裂细胞
腺相关病毒载体
定点整合(19号染色体特定区域)
不致病
分裂细胞、非分裂细胞
<5kb
<7.5kb
*
*
2.非病毒载体介导的基因转移系统 (1)脂质体介导的基因转移技术 基本原理:利用阳离子脂质体单体与DNA混合后,可以自动形成包埋外源DNA的脂质体,然后与细胞一起孵育,即可通过细胞内吞作用将外源DNA(即目的基因)转移至细胞内,并进行表达。
☻CD/5-FC 大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶(cytosine deaminase, CD)基因,在细胞内将无毒性5-氟胞嘧啶(5-FC)转变成毒性产物5-氟尿嘧啶(5-FU)。
1.自杀基因系统
*
*
旁观者效应:“自杀基因”导入后,不仅使转导了“自杀基因”的肿瘤细胞在用药后被杀死,而且与其相邻的未转导“自杀基因”的肿瘤细胞也被杀死。
(1)gag基因,编码核心蛋白和属特异性抗原; (2)pol基因,编码逆转录酶; (3)env基因,编码病毒外壳或包膜糖蛋白(包括外膜糖蛋白和穿膜蛋白)。
*
*
逆转录病毒介导的基因转移系统 ──由两部分组成:
(1) 逆转录病毒载体
(2) 辅助细胞株(如PA317)
*
*
*
*
(三)基因干预 基因干预(gene interference): 采用特定的方式抑制某个基因的表达,或者通过破坏某个基因的结构而使之不能表达,以达到治疗疾病的目的。
*
*
(四)自杀基因治疗 自杀基因治疗:恶性肿瘤基因治疗的主要方法之一。 原理:将“自杀”基因导入宿主细胞中,这种基因编码的酶能使无毒性的药物前体转化为细胞毒性代谢物,诱导靶细胞产生“自杀”效应,从而达到清除肿瘤细胞的目的。
Retroviral packaging system
*
*
逆转录病毒载体的特点
①逆转录病毒包膜上env编码的糖蛋白,能够被许多哺乳动物细胞膜上的特异性受体识别,从而使逆转录病毒携带的遗传物质高效地进入靶细胞。
②逆转录病毒结构基因gag、env和pol的缺失不影响其他部分的活性。
*
*
AAV载体是目前正在研究的一类新型安全载体,它对人类无致病性。 AAV可以高效定点整合至人19号染色体的特定区域19q13.4中,并能较稳定地存在。可以持续稳定表达,并可受到周围基因的调控,兼具逆转录病毒载体和腺病毒载体两者的优点。
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AAV载体的缺陷:
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(五)基因免疫治疗
通过将抗癌免疫增强的细胞因子或MHC基因导入肿瘤组织,以增强肿瘤微环境中的抗癌免疫反应。
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二、基因转移技术
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基因治疗的两种途径
载体
目的基因
in vivo
ex vivo
靶细胞
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基因转移(gene transfer)技术:
1.病毒介导的基因转移 2.非病毒介导的基因转移
4.靶向性差。
1.不能整合到靶细胞的基因组DNA中。分裂增殖快的细胞,导入的重组病毒载体,随分裂而丢失的机会增多,表达时间相对较短。
(1)腺病毒产生过程中与293辅助细胞内E1区序列发生同源重组; (2)腺病毒载体与被治疗的患者体内已感染的野生型腺病毒,甚至乳头瘤病毒、巨细胞病毒发生重组。
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(3)腺病毒相关病毒载体 腺病毒相关病毒(adenovirus associated virus,AAV)是一类单链线状DNA缺陷型病毒。其基因组DNA小于5 kb,无包膜,外形为裸露的20面体颗粒。AAV不能独立复制,只有在辅助病毒(如腺病毒、单纯疱疹病毒、痘苗病毒)存在时,才能进行复制和溶细胞性感染,否则只能建立溶源性潜伏感染。
③前病毒通过LTR高效整合至靶细胞基因组中,有利于外源基因在靶细胞中的永久表达。
④包装好的假病毒颗粒(携带目的基因的重组逆转录病毒载体)以出芽的方式分泌至辅助细胞培养的上清液中,易于分离制备。
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逆转录病毒载体的主要缺点
随机整合,有插入突变、激活癌基因的潜在危险; 逆转录病毒载体的容量较小,只能容纳7 kb以下的外源基因。
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1.病毒介导的基因转移系统
病毒载体介导的基因转移效率较高,因此它也是使用最多的基因治疗载体。据统计,有72﹪的临床实验计划和71﹪的病例使用了病毒载体,其中用得最多的是逆转录病毒载体。
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Retrovirus
(1)逆转录病毒
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(1)两端各有一长末端重复序列LTR。
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自杀基因的作用机制
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☻TK/GCV 单纯疱疹病毒(herps simplex virus, HSV)Ⅰ型胸苷激酶(thymidine kinase, tk)基因编码胸苷激酶,特异性地将无毒的核苷类似物丙氧鸟苷(ganciclovir, GCV)转变成毒性GCV三磷酸核苷,后者能抑制DNA聚合酶活性,导致细胞死亡。
基因治疗的原理与研究概况
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基因治疗分类
体细胞(somatic cell)基因治疗 生殖细胞(germline)基因治疗
只限于某一体细胞的基因的改变 只限于某个体的当代 对缺陷的生殖细胞进行矫正 当代及子代
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1. 基因治疗的策略
内容提要
2. 基因转移技术
4. 治疗基因的受控表达
3. 基因干预
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基因同源重组技术又称为基因打靶(gene targeting) 定向整合的条件:转导基因的载体与基因组DNA具有相同的序列。带有目的基因的载体就能找到同源重组的位点,进行部分基因序列交换。
基因同源重组技术
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要实现基因置换,需要采用同源重组技术使相应的正常基因定向导入受体细胞基因组的缺陷部位。
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三、基因干预
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(一)反义RNA 1. 反义RNA与基因表达调控 利用反义RNA对体外培养的细胞进行基因表达调控,通常采用的方法有两种: (1)体外合成反义RNA,直接作用于培养细胞,细胞吸收RNA后,发挥作用。 (2)构建一些能转录反义RNA的重组质粒,将这些质粒转入细胞中,转录出反义RNA而发挥作用。
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3. 反义RNA的应用前景
受体介导的反义RNA基因治疗有其自身的优点,而在 一定程度上补充了转基因治疗的不足。
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腺病毒的优点
1.基因导入效率高,对人类安全;
2.宿主范围广;
3.基因转导与细胞分裂无关;
4.重组腺病毒可通过口服经肠道吸收、或喷雾吸入或气管内滴注;
5.腺病毒载体容量较大,可插入7.5 kb外源基因。
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腺病毒载体缺点
2.宿主的免疫反应导致腺病毒载体表达短暂。
3.有两个环节可能产生复制型腺病毒。
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脂质体介导的基因转移示意图
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(2)受体介导转移技术
将DNA与细胞或组织亲和性的配体偶联,可使DNA具有靶向性。这种偶联通常通过多聚阳离子(如多聚赖氨酸)来实现。多聚阳离子与配体共价连接后,又通过电荷相互作用与带负电荷的DNA结合,将DNA包围,只留下配体暴露于表面。这样形成的复合物可被带有特异性受体的靶细胞吞饮,从而将外源DNA导入靶细胞。
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受体介导转移技术示意图
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(3)基因直接注射技术 不需要进行基因工程的繁琐操作,直接将裸露DNA注入动物肌肉或某些器官组织内。 动物实验表明:接受注射外源DNA的小鼠能够按其基因编码合成相应的蛋白质,并能维持数月之久。 1.将促进心脏血管生长的基因直接注入实验鼠的心脏,可使其心脏壁内毛细血管增加30﹪～40﹪; 2.将胰岛素基因直接注入鼠骨骼肌细胞,能分泌糖尿病所缺少的胰岛素; 3.肌内注射凝血因子Ⅸ基因,可产生血友病所需的凝血因子Ⅸ 。
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(2)腺病毒(adenovirus,AV)载体 腺病毒是一种大分子(36 kb)双链无包膜DNA病毒。它通过受体介导的内吞作用进入细胞内,然后腺病毒基因组转移至细胞核内,保持在染色体外,不整合进入宿主细胞基因组中。 腺病毒是人类呼吸道感染的病原体,但目前尚未发现与肿瘤发生有关联。宿主细胞范围广,可感染分裂和非分裂终末分化细胞,如神经元等。
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基因直接注射法的优点
1.制备具有调控部件的质粒DNA重组体的技术较容易; 2.排除病毒载体可能潜在的致癌性或其他副作用; 3.导入的基因不需整合即可表达,避免了逆转录病毒载体导入整合后,一旦发生副作用不易中止或逆转的缺点; 4.基因直接注射法可反复使用,而病毒载体则可能诱导体内免疫应答,致使反复治疗效果下降。
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反义RNA的关键技术问题:
☻反义RNA进入靶细胞前的降解问题
☻专一性转移问题:
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2.受体介导反义RNA技转移术
①受体介导的RNA转移十分专一,而且效率高; ②被转移的RNA是被保护的,与周围环境之间存在多聚赖氨酸的保护层, 可以抵抗环境中的核酸酶的降解作用。
将脱唾液酸血清类粘蛋白(ASGP)与多聚赖氨酸(PL)共价连接,得到ASGP-PL复合物,成为运载核酸的工具。ASGP-PL反义RNA复合物可以专一性地被肝细胞表面的ASGP受体所识别,并吞噬到肝细胞中,反义RNA进入肝细胞后,可被逐渐释放出来发挥作用。
借助前述的受体介导基因转移方法,可以实现受体介导的反义RNA转移。
AAV Virus Particles
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Structure of AAV Virus Genomic DNA
REP:病毒复制基因, CAP:编码衣壳蛋白的基因
ITR:反向末端重复序列
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AAV的特点
● 以潜伏感染为主; ● 病毒基因组与细胞共存; ● 只要宿主细胞正常,AAV基因表达被抑制而维持潜伏状态; ● 若细胞受刺激,表达应激基因,AAV基因表达从而使AAV病毒复制; ● 产生子代病毒并释放,又感染新的细胞,建立新的潜伏状态。
5. 基因治疗的应用研究
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一、基因治疗的策略
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(一)基因置换(gene replacement)
定义:指将特定的目的基因导入特定细胞,通过定位重组,导入的正常基因,以置换基因组内原有的缺陷基因。
目的:将缺陷基因的异常序列进行桥正。 对缺陷基因的缺陷部位进行精确的原位修复,不涉及基因组的任何改变。
定向导入的发生率约1/100万,采用胚胎干细胞培养的方法,同源重组的检出率最高可达1/10。
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(二) 基因添加
基因添加(gene augmentation): 通过导入外源基因使靶细胞表达其本身不表达的基因。
类型: 在有缺陷基因的细胞中导入相应的正常基因,而细胞内的缺陷基因并未除去,通过导入正常基因的表达产物,补偿缺陷基因的功能; 向靶细胞中导入靶细胞本来不表达的基因,利用其表达产物达到治疗疾病的目的。
AAV载体容量小，目前最多只能容纳5 kb外源DNA片段；
感染效率比逆转录病毒载体低。 在40%-80%的成人中存在过感染，
可能会引起免疫排斥。
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常用基因治疗载体
整合
致病性
感染细胞
克隆容量
逆转录病毒 载体
随机整合，效率高
可能致病
分裂细胞
<7kb
腺病毒载体
不整合，可能丢失
逆转录病毒前病毒的结构特点
(2)LTR由U3、R和U5三部分组成。
(3)病毒有三个结构基因
(4)5ˊ端LTR下游有一段病毒包装所必需的序列(ψ)及剪接供体位点(SD)和剪接受体位点(SA)。
(5)含有负链DNA转录的引物结合位点(PBS)和正链DNA转录的引物结合位点。
(1)在U3内有增强子和启动子; (2)U3和U5两端分别有病毒整合序列(IS) ; (3)在R内还有poly(A)加尾信号。
不致病
分裂细胞、非分裂细胞
腺相关病毒载体
定点整合(19号染色体特定区域)
不致病
分裂细胞、非分裂细胞
<5kb
<7.5kb
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2.非病毒载体介导的基因转移系统 (1)脂质体介导的基因转移技术 基本原理:利用阳离子脂质体单体与DNA混合后,可以自动形成包埋外源DNA的脂质体,然后与细胞一起孵育,即可通过细胞内吞作用将外源DNA(即目的基因)转移至细胞内,并进行表达。
☻CD/5-FC 大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶(cytosine deaminase, CD)基因,在细胞内将无毒性5-氟胞嘧啶(5-FC)转变成毒性产物5-氟尿嘧啶(5-FU)。
1.自杀基因系统
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旁观者效应:“自杀基因”导入后,不仅使转导了“自杀基因”的肿瘤细胞在用药后被杀死,而且与其相邻的未转导“自杀基因”的肿瘤细胞也被杀死。
(1)gag基因,编码核心蛋白和属特异性抗原; (2)pol基因,编码逆转录酶; (3)env基因,编码病毒外壳或包膜糖蛋白(包括外膜糖蛋白和穿膜蛋白)。
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逆转录病毒介导的基因转移系统 ──由两部分组成:
(1) 逆转录病毒载体
(2) 辅助细胞株(如PA317)
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(三)基因干预 基因干预(gene interference): 采用特定的方式抑制某个基因的表达,或者通过破坏某个基因的结构而使之不能表达,以达到治疗疾病的目的。
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(四)自杀基因治疗 自杀基因治疗:恶性肿瘤基因治疗的主要方法之一。 原理:将“自杀”基因导入宿主细胞中,这种基因编码的酶能使无毒性的药物前体转化为细胞毒性代谢物,诱导靶细胞产生“自杀”效应,从而达到清除肿瘤细胞的目的。
Retroviral packaging system
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逆转录病毒载体的特点
①逆转录病毒包膜上env编码的糖蛋白,能够被许多哺乳动物细胞膜上的特异性受体识别,从而使逆转录病毒携带的遗传物质高效地进入靶细胞。
②逆转录病毒结构基因gag、env和pol的缺失不影响其他部分的活性。
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AAV载体是目前正在研究的一类新型安全载体,它对人类无致病性。 AAV可以高效定点整合至人19号染色体的特定区域19q13.4中,并能较稳定地存在。可以持续稳定表达,并可受到周围基因的调控,兼具逆转录病毒载体和腺病毒载体两者的优点。
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AAV载体的缺陷: