高效液相色谱法内标法测定盐酸苯环壬酯控释片的含量

高效液相色谱法内标法测定盐酸苯环壬酯控释片的含量
郑露露;曾媛;刘辉;段婷
【摘要】目的：建立测定盐酸苯环壬酯控释片含量的高效液相色谱法内标法。

方
法选择盐酸地芬尼多为内标物，采用 Diamonsil C18柱(250 mm ×4.6 mm，
5μm)为色谱柱，乙腈－水－磷酸－三乙胺(270：400：1.3：2)为流动相，检测波长为220 nm，流速为1.0 mL / min，柱温为30℃。

结果盐酸苯环壬酯质量浓度线性范围是2.0~6.0μg / mL，r =0.9992，平均回收率为101.3%，RSD 为1.63%（ n =9）。

结论该法结果准确可靠、专属性强，可用于盐酸苯环壬酯控释片的含量测定和质量控制。

%Objective To establish a HPLC - internal standard method for the content determination of Phencynonate Hydrochloride Con-trolled Release Tablets. Methods Difenidol hydrochloride was selected as the inte rnal standard by adopting the Diamonsil C18 column (250 mm × 4. 6 mm, 5 μm) with the mobile phase of acetonitrile - water - phosphoric acid - triethylamine(270 : 400 : 1. 3 : 2) . The detec-tion wavelength was 220 nm. The flow rate was 1. 0 mL / min and the column temperature was 30 ℃. Results Phencynonate hydrochlo-ride showed the good linear relation within the range of 2. 0 - 6. 0 μg / mL( r = 0. 999 2) . The average recovery rate was 101. 3% , RSD = 1. 63% ( n = 9) . Conclusion This method is highly specific, accurate and reliable in the detection results, and available for the determination and quality control of Phencynonate Hydrochloride Controlled Release Tablets.
【期刊名称】《中国药业》
【年(卷),期】2014(000)023
【总页数】3页(P47-49)
【关键词】高效液相色谱法;内标法;盐酸苯环壬酯;盐酸地芬尼多
【作者】郑露露;曾媛;刘辉;段婷
【作者单位】中国人民解放军广州军区武汉总医院药剂科，湖北武汉 430070; 湖北中医药大学药学院，湖北武汉 430065;中国人民解放军广州军区武汉总医院药
剂科，湖北武汉 430070; 湖北中医药大学药学院，湖北武汉 430065;中国人民解放军广州军区武汉总医院药剂科，湖北武汉 430070;湖北中医药大学药学院，湖
北武汉 430065
【正文语种】中文
【中图分类】R927.2;R971+.92
盐酸苯环壬酯（phencynonate hydrochloride）化学名为苯基环戊基羟基乙酸[N －甲基－3－氮杂双环(3，3，1)壬]－9α－酯盐酸盐[1]，是我国研制的新一代高
选择性中枢抗胆碱能抗晕动病Ⅰ类新药[2]，其药效强，但中枢抑制作用弱[3]，是
一种高效、安全的抗晕动病药物。

现已有盐酸苯环壬酯片（商品名飞赛乐）上市销售，但其半衰期较短（t1/2为 3～4 h）[4]，预防晕动病时需多次给药，易使血药浓度产生峰谷波动；在长程用药时，可导致嗜睡、视物模糊等不良反应。

为避免普通片的缺点，笔者采用双层渗透泵技术对现有盐酸苯环壬酯片进行制剂创新，制备了长效、低毒、日服1次的盐酸苯环壬酯控释片，特别适用于海上作业或长途乘船、乘车的晕动病患者。

盐酸苯环壬酯制剂的含量测定已有高效液相色谱（HPLC）
外标法[5－7]和溶剂萃取酸性色素比色法[8－9]报道，由于本研究中制备的盐酸苯环壬酯控释片样品前处理较复杂，对含量测定有较大的影响，采用现有方法均无法准确进行该制剂的质量控制。

笔者通过选择合适的内标物，建立了HPLC－内标法测定该制剂中盐酸苯环壬酯的含量。

与现有测定方法相比，该方法通过加入内标物，可以校准和消除由于操作条件波动或制剂中组分和制备流程重现性对检测结果的影响[10]，提高了分析的准确性和精密度。

现报道如下。

1 仪器与试药
Agilent 1200型高效液相色谱仪（DG230－4在线脱气机，G1310A IsoPump，LGC－1025M柱温箱；G1329A ALS，G1314B VWD，Agilent HP Chemsatation工作站）；BT25S型电子天平（赛多利斯科学仪器有限公司）；KQ－250E型超声仪（昆山市超声仪器有限公司）。

盐酸苯环壬酯（北京华素制
药股份有限公司，批号为1210251）；盐酸苯环壬酯对照品（中国药品生物制品
检定所，批号为100716－200501）；盐酸地芬尼多对照品（中国食品药品检定
研究院，批号为100841－201303）；氢溴酸樟柳碱对照品（中国药品生物制品
检定所，批号为100399－200601）；盐酸戊乙奎醚对照品（中国食品药品检定
研究院，批号为100931－201101）；硫酸阿托品（杭州民生药业集团有限公司，批号为030809）；硝酸毛果芸香碱（广东省医药保健品进出口公司，批号为1007133）；盐酸苯环壬酯控释片（自制，规格为每片4 mg）；乙腈（Merck KGaA，色谱纯），其他试剂均为色谱纯。

2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱：Diamonsil C18柱(250 mm × 4.6 mm，5 μm)；流动相：乙腈－水－磷酸－三乙胺(270∶400∶1.3∶2)；检测波长：220 nm；流速：1.0 mL /min；
柱温：30 ℃ ；进样量：20 μL。

在上述色谱条件下，理论板数按盐酸苯环壬酯峰
计算不低于2 000。

2.2 溶液制备
内标液：精密称取盐酸地芬尼多适量，加流动相配制成0.2 g/L内标贮备液；精密量取该贮备液1 mL，置 10 mL容量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，即得20 μg/mL盐酸地芬尼多内标液。

分别精密称取硫酸阿托品、氢溴酸樟柳碱、硝酸毛果芸香碱、盐酸戊乙奎醚对照品适量，各加流动相溶解并定量稀释，分别配制成5μg/mL的硫酸阿托品、氢溴酸樟柳碱、硝酸毛果芸香碱、盐酸戊乙奎醚，作为内标液。

供试品溶液：取自制盐酸苯环壬酯控释片20片，去除衣膜后，精密称定，研细，精密称取适量细粉（约相当于盐酸苯环壬酯4 mg），置100 mL容量瓶中，加流动相适量，室温溶胀2 h后，精密量取内标贮备液10 mL，超声处理30 min使盐酸苯环壬酯溶解，放冷，用流动相稀释至刻度，摇匀，用0.45 μm滤膜滤过。

精密量取续滤液1 mL，置10 mL容量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液。

对照品溶液：精密称取盐酸苯环壬酯对照品适量，加流动相配制成0.4 g/L的对照品贮备液，精密量取1 mL，置100 mL容量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，即得4 μg/mL的对照品溶液。

校正因子溶液：分别精密量取0.4 g/L对照品贮备液和0.2 g/L内标贮备液各1 mL，置100 mL容量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，即得。

2.3 系统适用性试验
按处方分别制备盐酸苯环壬酯控释片和不含盐酸苯环壬酯的空白片，分别按2.2项下方法制得供试品溶液，按2.1项下色谱条件，取20 μL进样测定；另取2.2项下盐酸苯环壬酯对照品溶液，同法测定。

色谱图见图1。

结果表明，在拟订的色谱条件下，其他成分不干扰盐酸苯环壬酯的测定。

2.4 内标物选择
先后考察了以硫酸阿托品、氢溴酸樟柳碱、硝酸毛果芸香碱、盐酸戊乙奎醚、盐酸地芬尼多等与盐酸苯环壬酯分子量接近的、分子结构相似的内标物，结果发现，在2.1项色谱条件下，硫酸阿托品 (t＝ 2.2 min)、氢溴酸樟柳碱 (t＝ 2.0 min)和硝酸毛果芸香碱(t＝1.7 min)均在辅料峰处出峰，盐酸戊乙奎醚(t＝4.1 min)出现双峰，均无法作为内标物；而盐酸地芬尼多的保留时间(t＝3.9 min)，峰形良好，可与盐酸苯环壬酯(t＝7.6 min)实现完全分离(分离度≥10)，且 9 min内即可完成检测。

色谱图见图1。

因此，最终选择盐酸地芬尼多作为内标物。

图1 高效液相色谱图
2.5 方法学考察
线性关系考察：精密称取盐酸苯环壬酯对照品5 mg，置100 mL容量瓶中，加流动相适量，振摇使溶解，加流动相稀释至刻度，摇匀，得50 μg/mL 的对照品溶液。

精密量取该对照品溶液 2，3，4，5，6.0 mL，分别置 50 mL容量瓶中，各
精密加入 2.2项下盐酸地芬尼多内标液5 mL，用流动相稀释至刻度，摇匀。

按上述的色谱条件，分别进样测定峰面积，重复3次，取平均值。

以对照品与内标物
的峰面积比为纵坐标（Y）、对照品质量浓度为横坐标（X）进行线性回归，得回
归方程 Y＝0.175 1 X ＋0.027 6，r＝0.999 2。

结果表明，盐酸苯环壬酯质量浓度在2～6 μg/mL范围内与峰面积呈良好线性关系。

稳定性试验：取 2.2项下校正因子溶液及供试品溶液，按2.1 项下色谱条件，于 0，4，8，12，24 h 分别测定校正因子溶液和供试品溶液的峰面积。

结果供试品溶液和校正因子溶液中盐酸苯环壬酯与内标物的平均峰面积比分别为0.82和0.71，RSD分别为 1.90% 和 1.08% （n ＝3）。

精密度试验：精密量取线性关系考察项下50 μg/mL的对照品溶液 3.2，4.0，4.8 mL，分别置 50 mL 容量瓶中，各精密加入2.2项下20 μg/mL盐酸地芬尼多内
标液5 mL，加流动相稀释至刻度，摇匀。

按拟订的色谱条件，分别进样测定峰面积，重复2次。

结果低、中、高3种不同浓度溶液的平均校正因子分别为0.59，0.72，0.87，RSD 分别为 1.21% ，0% ，0.82% （n ＝ 6），表明仪器精密度良好。

重复性试验：取盐酸苯环壬酯控释片(批号为20140312)20片，去除衣膜后，精密称定，研细，分别精密称取6份细粉样品（约相当于盐酸苯环壬酯4 mg），按2.2项下方法配制供试品溶液，按2.1项下色谱条件测定峰面积，用内标法计算。

结果样品平均标示量为 98.8%，RSD为1.40%（n＝6），表明方法重复性好。

中间精密度试验：由甲、乙、丙3人按重复性试验方法，各精密称取3份细粉样品适量（约相当于盐酸苯环壬酯4 mg），照2.2项下方法制得供试品溶液，进样测定峰面积，按内标法计算。

结果样品中盐酸苯环壬酯的标示量分别为98.4%，99.9%，100.1%，RSD 分别为 1.12% ，0.62% ，0.12% （n ＝3），表明方法复性好。

加样回收试验：精密称取100 mg盐酸苯环壬酯对照品，置100 mL容量瓶中，加流动相适量，溶解，稀释至刻度，摇匀，即得1 g/L 的盐酸苯环壬酯溶液。

精密量取该溶液 3.2，4.0，4.8 mL 各3份置100 mL容量瓶中，分别加入处方量的辅料后，加流动相适量，室温溶胀2 h后，然后精密移取2.2项下内标贮备液10 mL并加入，超声处理30 min，使盐酸苯环壬酯溶解，放冷，加流动相稀释至刻度，摇匀，用0.45 μm滤膜滤过。

精密量取续滤液1 mL，置10 mL容量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，即得低、中、高浓度的供试品溶液各3份。

按2.1项下色谱条件测定峰面积，用内标法计算回收率。

结果盐酸苯环壬酯的平均回收率为101.3%，RSD 为 1.63%（n＝9），符合检测要求。

2.6 样品含量测定
取不同批次的盐酸苯环壬酯控释片，按2.2项下方法配制供试品溶液，按 2.1项下
色谱条件测定峰面积；同法测定校正因子溶液，按内标法以峰面积比值计算含量。

结果见表 1，3个批次样品的含量均符合规定。

表1 样品含量测定结果（n＝3）批号2 0 1 4 0 3 0 4 2 0 1 4 0 3 1 2 2 0 1 4 0 4 1 0标示量（%）1 0 0.9 1 0 1.4 9 9.5
3 讨论
本研究所制备的盐酸苯环壬酯控释片处方中，含有大量的聚氧乙烯、羟丙甲纤维素等高分子材料，这些高分子材料遇水后，经水合作用发生膨胀，呈黏稠的凝胶状态。

为了使盐酸苯环壬酯完全溶解，并防止样品堵塞色谱柱和HPLC测定系统，需经
溶胀、超声、滤膜过滤等多步处理，易引起样品损失，从而导致回收率下降。

采用常规的外标法进行含量测定时，测定结果的准确度和精密度无法达到要求。

本研究所建立的HPLC内标法测定盐酸苯环壬酯控释片中主药含量，以盐酸地芬尼多为
内标物，消除了样品处理的烦琐操作对检测结果带来的影响，准确性、专属性强，可用于新药盐酸苯环壬酯控释片的含量测定和质量控制。

HPLC内标法选择内标物时，要求内标物是供试品中不存在的纯物质，且内标物的色谱峰应位于待测组分色谱峰附近，并与待测组分完全分离。

而且，应注意内标物与待测组分的物理及物理化学性质（如挥发度、化学结构、极性以及溶解度等）相近，这样即使操作条件变化时，更有利于内标物及待测组分作均匀的变化。

本研究中探索了硫酸阿托品、氢溴酸樟柳碱、硝酸毛果芸香碱、盐酸戊乙奎醚及盐酸地芬尼多等5种与盐酸苯环壬酯分子量接近的、分子结构相似的物质作为内标候选物，结果表明盐酸地芬尼多最理想，系统适用性试验（理论板数、分离度、重复性和拖尾因子）均符合要求，故最终确定以盐酸地芬尼多为内标物质建立了盐酸苯环壬酯控释片的含量测定方法。

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