基因诊断与基因治疗培训教程(ppt 162页)

2. 反向斑点杂交
-珠蛋白生成障碍性贫血症的反向斑点杂交分析 目录
二、血友病（Hemophilia）
甲 型 血 友 病 是 由 于 血 浆 凝 血 因 子 VIII （FVIII）缺陷造成。
甲型血友病的基因突变类型已有300余种， 其中点突变占174种；另有部分患者是由于 缺失或插入突变或内含子22的基因倒位所致。
核酸分子杂交（Nucleic acid hybridization） 聚合酶链式反应(PCR) 单链构象多态性（SSCP） 限制性片段长度多态性（RFLP） DNA序列测定（DNA sequencing） 生物芯片（biochips） Western免疫印迹（Western blotting） 免疫组织化学诊断
第二十八章
基因诊断与基因治疗
Gene Diagnosis and Gene Therapy
目录
本章内容提要
第一节 第二节 第三节 第四节 第五节 第六节
基因诊断学基础 遗传病的基因诊断 传染病的基因诊断 肿瘤的基因诊断 基因诊断在法医学上的应用 基因治疗的概念及策略
目录
第一节 基因诊断学基础
目目 录录
1. RT-PCR
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2. 荧光定量PCR
荧光标记引物
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3. 多重PCR
多重PCR示意图 A：普通PCR；B：多重PCR
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4. PCR-ASO
ASO1 ASO2
N
H
M
N：正常基因；H：杂合子基因；M：突变基因
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（三）单链构象多态性分析
（single-strand conformation polymorphism, SSCP）
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1. FVIII基因倒位的DNA印迹分析
将基因组DNA用Nco I，Dra I或Bcl I等内切酶 （酶切位点位于交换点两侧）消化，用特异探针进行 杂交分析，正常人表现为21.5 kb、14 kb和16 kb三种 类型。I型倒位患者表现为20、17.5和14 kb三种类型； Ⅱ型倒位患者表现为20、16和15.5 kb三种带型。在 一些重型甲型血友病家系中还有其他异常带型出现。
0.2kb 正常人 突变携带者 患者
镰状红细胞贫血病的限制性内切酶谱分析
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3. HBS的PCR-RFLP分析
正常人 患者 杂合体 Marker
正常人的扩增产物经 Mst Ⅱ消化可生成54bp和56bp两个片段，而镰状细
胞贫血症患者的DNA片段不被酶切，仍为110bp，杂合子可见三条带
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（二）-珠蛋白生成障碍性贫血症 1. PCR-RFLP分析
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1. Southern 印迹杂交(Southern blotting)
提取DNA→限制性内切酶消化DNA以产 生特定长度的片段→凝胶电泳分离 →变性处 理→DNA转印到膜上并使其牢固结合→将标 记的探针与膜上DNA片段杂交，分析杂交信 号。
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2. Northern印迹杂交(Northern blotting)
RNA经变性琼脂糖凝胶电泳后，转移 到固相支持物上，通过分子杂交检测特定 的mRNA分子的含量与大小。
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3. 斑点杂交（dot blotting）
将RNA或DNA变性后直接点样于硝酸纤 维素膜或尼龙膜上，用于基因组中特定基因 及其表达产物的定性及定量的研究。
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4. 反向斑点杂交 （reverse dot blotting）
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（一）核酸分子杂交 Nucleic acid hybridization
指两条单链核酸在一定条件（温度、盐离 子和有机溶剂浓度）下，按碱基互补的原则重 新配对形成双链的过程。
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核酸分子杂交流程
待测核酸制备
核酸探针制备
滤膜上核酸固化
探针标记
杂交 去除未杂交的探针
加入标记探针
检测杂交信号
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EcoR Ⅰ限制性内切酶位点的变化 GAATTC
CTTAAG
AB C
－
＋
D
D E F C B A G
E
－
＋
FG
C +D E F
B A G
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（五） DNA序列测定（DNA sequencing）
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DNA序列测定原理(双脱氧末端终止法)
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序列分析用于基因诊断研究
—3/
3/—
—5/
RFLP
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（2）无限制性酶切位点改变
5/—
—3/
3/—
—5/
斑点杂交、反向斑点杂交 AS-PCR、PCR-SSCP、 PCR-ASO、 PCR产物直接测序
目录
2. 基因重排的检测
在DNA序列上有一段较长序列的重新排布。 包括数十个碱基到数千个碱基的丢失、插入、替 换、重复和倒位等，以及染色体突变或畸变，包 括染色体的易位、缺失或染色三体（如唐氏综合 征）等。
③ SNP(single nucleotide polymorphism)
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HBS的间接基因诊断 ——RFLP标记的连锁分析
NHP
7.6kb
HapⅠ
正
常
13kb
13kb
患 者
7.6kb
Southern印迹杂交
N：正常；H：杂合子；P：患者（纯合子）；黄色区域为探针
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第二节 遗传病的基因诊断
Gene Diagnosis of Hereditary Diseases
-珠蛋白生成障碍性贫血症基因密码子17突变的检测 M：pBR322 DNA/Msp I; 1:未酶解片段； 2：bA/ bA； 3：bA/ bT； 4：bT/ bT 注：由于54 bp、114 bp、72 bp片段及分子量标准中低于200 bp的片段太小，在0.8％的琼脂糖凝胶中不易被观察到
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由于DNA 变异产生新的酶切位点或原有的酶切 位点消失，在用限制性核酸内切酶消化时产生不同 长度或不同数量的片段。
可借助核酸分子杂交或PCR进行检测。
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PCR-RFLP
设计适当的扩增引物，使扩增片段包括某 一个或数个限制性内切酶识别序列，在PCR扩 增后用该限制酶切割PCR产物，根据电泳后酶 切片段长度变化，即可作出诊断。
先将探针固定于硝酸纤维素膜或尼龙 膜上，将样品RNA或DNA标记变性后进行 杂交。改变了传统杂交方法中一次杂交只 能检测一种样品的局限，大大提高了基因 诊断的效率。
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等位基因特异性寡核苷酸
(allele specific oligonucleotide, ASO）
寡核苷酸中的碱基错配会大大影响杂交分 子的稳定性，可用人工合成的针对正常和突变 ASO探针进行反向斑点杂交，检测点突变，大 大提高检测结果的可靠性。
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5. 原位分子杂交
荧光原位杂交 (fluorescence in situ hybridization, FISH）
挂锁FISH (FISH with padlock)
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荧光原位杂交（FISH）
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6. 固相夹心杂交法 (sandwich hybridization)
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一、血红蛋白病（hemoglobinopathy）
（一）镰状细胞贫血病 （二）β-珠蛋白生成障碍性贫血症
二、血友病（Hemophilia）
甲型血友病基因诊断
三、脆性X综合征
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一、血红蛋白病
（一）镰状细胞贫血病
1.镰状红细胞贫血患者基因诊断——ASO杂交法 2.HBS的限制性内切酶谱分析 3.HBS的PCR-RFLP分析
设计合适的引物
SSCP
操作简便、检出率不高
选择合适的片段
RFLP
结果可靠但限制较多
选择合适的限制酶
DNA测序
可自动化，但不适宜广泛使用 与PCR配合使用
生物芯片
效率高，成本高，不适宜广泛 选择合适的芯片 使用
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三、 基因诊断技术路线与方法
根据对致病基因或相关基因的了解程度决 定基因诊断的技术途径选择。 直接诊断：直接分析致病基因分子结构及表
M-ASO
正常 突变
突变
纯合子 杂合子 纯合子
斑点杂交结果 N：正常；M突变
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2. HBS的限制性内切酶谱分析
(CCT GAG G) MstⅡ酶切位点（CCTNAGG）
5´
3´
1.15kb
(CCT GTG G)
×
正常基因
5´
3´
1.35kb
突变基因
镰状红细胞贫病的限制性内切酶谱分析
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1.35kb 1.15kb
左侧：正常；右侧突变
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（六）生物芯片（biochips） 基因芯片（gene chips） 蛋白质芯片(protein chip)
目目 录录
基因芯片杂交流程示意图
目目 录录
基因wk.baidu.com断中常用的分子生物学方法比较
方法
优点与问题
解决方案
核酸分子杂交 结果可靠但操作繁琐
选择合适的探针
PCR
灵敏度、特异性高
DNA 的突变造成DNA片段中碱基序列不 同，变性为单链后在中性聚丙烯酰胺凝胶中的 构象不同（单链构象多态性），利用迁移率的 差别可使各种序列不同的单链分离开来。
目目 录录
PCR-SSCP分析原理示意
目录
PCR-SSCP分析 －
+
正常人
纯合突变 杂合突变
目录
（四）限制性片段长度多态性分析
（restriction fragment length polymorphism, RFLP）
核酸分子探针杂交与PCR
目录
-珠蛋白生成障碍性贫血的直接基因诊断
BamHI
α2
BamHI
α1
14 kb
α2
10 kb
probe
-珠蛋白基因不同程度的缺失可引起 不同类型的-珠蛋白生成障碍性贫血
目录
等位基因特异PCR AS-PCR（allele specific PCR） 根据引物3´端的互补与否，设计一对与正 常或突变模板配对的特异引物
目目 录录
（二） 聚合酶链式反应 (polymerase chain reaction, PCR）
变性
延伸
模板 引物
dNTP Mg2+ Taq DNA聚合酶
退火
目录
PCR在基因诊断中的应用
RT-PCR 荧光定量PCR 多重-PCR PCR-ASO AS-PCR PCR-SSCP PCR-RFLP
Basis of Gene Diagnostics
目录
基因诊断之父—简悦威
1976年加州大学华裔科学家 Kan YW 用核酸分子杂交技术首次对一例α地中海贫 血进行诊断。
目录
一、基因诊断的概念、特点及临床意义
定义：
利用分子生物学技术，通过检测基因及基 因表达产物的存在状态，对人体疾病作出诊断 的 方 法 。 基 因 诊 断 检 测 的 目 标 分 子 是 DNA 、 RNA，也可以是蛋白质或者多肽。
待测靶基因序列上两个相邻但不重叠的DNA 片段（A、B片段），分别作为捕捉探针（不标记 的A片段）和检测探针（标记的B片段），同时与 靶基因杂交。先将捕捉探针吸附于固相支持物上， 与靶基因序列A部分杂交，再加入标记的检测探针， 检测探针与靶基因序列B部分杂交，检测杂交信号。
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固相夹心杂交法示意图
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诊断依据(遗传物质改变)
DNA、RNA或蛋白质水平变化，如病毒基因及 其转录产物在体内从无到有、癌基因表达水平 从低到高；
基因结构变化，如点突变引起基因失活、染色 体转位引起基因异常激活或灭活。
目录
基因诊断的特点
高特异性 高灵敏性 早期诊断性 应用广泛性
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二、基因诊断中常用的分子生物学技术
目目 录录
3. 基因表达异常的检测
mRNA的相对定量分析 mRNA的绝对定量分析 mRNA长度分析
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（二）间接诊断途径
1.采用原因
① 致病基因未知或基因结构不确定 ② 致病突变机制不清 ③ 致病位点不便检测
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2. 遗传标记
DNA多态性：指群体中的DNA分子存 在至少两种不同的类型，即个体间同一染色 体的相同位置上核苷酸序列存在一定的差异 或变异。
达是否异常 间接诊断：利用多态性遗传标志与致病基因
进行连锁分析
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（一）直接诊断途径
必要条件：
◆ 被检测基因变化与疾病发生有直接因果关系 ◆ 被检基因正常分子结构已被确定 ◆ 被检基因致病的分子机制（突变位点或表达变化）
已知
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1.点突变的检测 （1）有限制性内切酶位点改变
5/—
多在进化中形成，本身并不致病，只是 与某些遗传性致病基因有一定连锁关系。
目录
间接诊断：检测与致病基因连锁的遗传标记
三代遗传标记：
① RFLP（基于核酸分子杂交技术） ② VNTR (variable number of tandem repeats) ;
STR (short tandem repeats)
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1.镰状红细胞贫血患者基因诊断 ASO杂交法
正常的（N）的ASO探针： 5´-ACT CCT GAG GAG AAG TCT GC-3´
突变的（M）的ASO探针： 5´-ACT CCT GTG GAG GAAG TCT GC-3´
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镰状红细胞贫血患者ASO杂交法检测
N-ASO