第三章-基因组文库的构建

三、cDNA克隆载体
Zap cDNA克隆载体来自腺病毒系统，属于 噬 菌粒（phagemid）载体。线状的 Zap cDNA克 隆载体在体内能通过噬菌粒获救(phagemid rescue) 变成环状的表达载体。
(a) 噬菌体连续感染两个不同的E.coli 菌株，在这 两个菌株中一个噬菌体不受“限制”，而另一个 受到“限制”。结果,在kanr 菌落中获救，此菌落 中含有多个拷贝的双链质粒。
巨细胞病毒第三节 cDNA的筛选间接用探针筛选噬菌体cDN相关氨基酸密码子的简 并寡核苷酸探针；
（2）纯化蛋白质的相应抗体探针； （3）针对差异表达基因的扣除
cDNA探针。
探针的特异性可通过以下的策略来解决： ①选基因的特异序列为探针； ②长度不低于17～20nt； ③控制片段但酶的选择和酶切反应条件的选择是取决于克隆载体的类型重组噬菌体细胞基因组噬菌体尼龙膜与放射性探针进行分子杂交用放射自显影定位阳性克隆阳性克隆用限制性酶剪切提取dna用限制性酶剪切用连接酶连接重组体dna细菌感库的构建
用体外包装系统将串联体中单个的基因组DNA分 别包装入不同噬菌体头部，形成不同的重组噬菌 体颗粒。
用重组噬菌体感染适合的宿主菌，产生噬菌斑。每 一个噬菌斑来自单个感染噬菌体的一个克隆。
各个克隆带有不同的细胞DNA片段。
限制性
(a)
酶切位点
Alu散在元件
启动子 外显子探针1 启动子启动子
探针2
探针3
将DNA亚克隆到质粒载体中的通用策略
①根据已知的酶切图谱进行定向克隆
（directed cloning）；
②用常用的限制性酶交错剪切或平切进行
随机亚克隆。
这种策略也称为“鸟枪法（shot-gun）”，即将 完整的基因组或部分基因组的DNA用限制性酶 或机械的方法随是将小片段逐一测序，再拼接 成序列图谱。
(b) mRNA
mRNA
mRNA 5kb一个典型的基因组含带有重叠基因片段的多拷 贝克隆。
(a)用从原有的克隆DN得与上述片段部分重叠的DNA序列。
罕见的酶切位点和重复DNA序列(如Alu分散元件)可 作为界标，用来排列分离的基因组DNA克隆。
猜测体探针是根据特定物种某已知蛋白的密码 子使用频率，选择含有密码子简并程度最低的 蛋白质区段进行人工合成的低简并性寡核苷酸 探针。
猜 测 体 探 针 的 制 备 原 理
猜测体探针只要有85％的 碱基能和目的基因配 对即可杂交。如连续的配对区较长(达10～ 12nt),那么猜测体探针作用的强度足以鉴定出含 目的基因的阳性克隆。
a.用苯酚和氯仿提取 后，在酸性条件下总RNA 留在水相，然后用异丙醇 沉淀。
b. RNA溶于高盐溶液 (0.5M NaCl)中，过寡聚 dT纤维素柱，完整的 RNA 能用甲醛琼脂糖凝 胶电泳，用EB染色进行 分析
二、cDNA合成
用寡聚dT为引物 (一个长 12～18nt的多聚dT链)能获 得总cDNA。因为这个引物 的靶序列是 mRNA的3'端 的多聚腺苷尾巴。但很多 人和小鼠的基因3'端含有 一段很长的非编码的尾随 序列（tailer sequence）， 因此寡聚dT从3' 端的多聚 腺苷尾巴引发的cDNA合成， 有时要越过很长的尾随序 列区，而在未达到编码区 时反应就已终止，因此文 库有可能丢失全部的ORF 序列。
一、mRNA的分离纯化
mRNA 的提纯涉及到两个基本的步骤： ①将细胞总的RNA和DNA及蛋白质分开，用蛋 白质强变性剂来抑制细胞中的RNase，防止 RNA降解； ②用寡聚dT亲和基质将mRNA和其他的RNA （tRNA及rRNA等）分开。
从组织培养细胞中分离mRNA的通用方法
用硫氰酸胍和寡聚dT纤 维素柱从组织培养NA片段的复合位点。在图中表示已克隆的50kb的 基因组DNA中含有三个转录的基因。
克隆数的确定
建库的关键是如何产生足够数量的重组 larke 和 J.Carbon 建立了ClarkeC的指导意义。
(b) 噬菌斑的模式被转移到尼龙膜上，而噬菌体 的蛋白被溶解，和重组体DNA分开，DNA吸附 到膜上。再将此膜与带有放射性同位素标记的 探针进行分子杂交，可以杂交的便是目的基因。
三、亚克隆
所谓亚克隆（sub-clone）就是对已经克隆的目 的DNA片段经限制性酶消解后再次重新克隆， 其目的在于对目的DNA进行进一步分析，或进 行“重编程”。 亚克隆的基本过程： ①制备目的DNA片段和载体； ②连接目的DNA片段和载体； ③重组载体转化到宿主中； ④筛选重组子。
合成cDNA三种不同策略的优缺点。cDMA的第一 条链的合成能用寡聚dT，随机引物或基因特异性引 物来起始以达到不同的结果。
用E.coli的
RNase H 和 DNA pol I合成 cDNA的 第二条链。
phagemid 噬菌粒，噬粒：是嵌合噬菌体质粒克 隆载体（cloning vector），它同时含有双链和单 链的复制起点。如携带M13(或类似)噬菌体的复 制起始点的质粒，噬菌体的复制起始点使质粒由 另一个助噬菌体提供噬菌体功能时，作为单链 DNA噬菌体基因组可得到复制。噬粒将质粒的 通用性与噬菌体产生单链DNA的能力结合起来。 这样产生单链DNA的载体用于测序、体外诱变 和探针合成等。噬粒载体导入宿主、载体筛选及 重组体筛选的方法与质粒相同。插入DNA的大 小也与质粒一样。主要用于产生单链DNA。
限制性酶消解用来构建克隆DNA的物理图谱
用酶（KpnⅠ和 Hind Ⅲ）来剪切载体，构建一个 SalⅠ插入片段的不完全酶切图谱。
M1 2 3 4 5 6 7 8 M
M：标记泳道，
是含有已知不同长度
的DNA，用来衡量
样本DNA的分子大
小。 1：SalⅠ-KpnⅠ； 2：HindⅢ； 3：SalⅠ-HindⅢ； 4：KpnⅠ-HindⅢ； 5：EcoRⅠ； 6：SalⅠ- EcoRⅠ； 7： KpnⅠEcoRⅠ； 8：HindⅢ- EcoRⅠ
Clarke-) ln(1 I / G )
N：该序列 I ：待克隆DNA片段的长度，假定为20kb; G : 基因组DNA的总长度，如人类为3×109bp
带有此DNA的克隆可通过放射自显影而显现出来。 这样阳性克隆可从培养基中分离出来，再转接到新 鲜的宿主菌中，使目的因得到的片段， 再用相同的限制性酶剪切外源基因组DNA，将约 15kb的酶切片段随机地和噬菌体载体的两臂连接， 形成线性的重组的串联体。
进行杂交，选择阳性克隆。此猜测体探针是按32aa序列 推导猜测而来的。 ⑤分离的克隆中部为上述32aa,两端为引物序列。
⑥用这段插入序列为探针 体 技 术
二、抗体探针
蛋白质特异性抗体能用作免疫探针来探测细菌功 能蛋白编码的蛋白质抗原。用噬菌体表达载体产 生功能性蛋白，组DNA克隆群体。
将数据代入上式
N ln(1 0.99) ln(1 20kb/ 3Gb)
= 7×105
N的含义是克隆大小99 小片段，但酶的选 择和酶切反应条件的选择是取决于克隆 载体的类型“n”是细胞中最稀有的mRNA的拷贝数；
“T ”为细胞中各种mRNA的总拷贝数。
如哺乳动物细胞中约含560,000个mRNA，若分 析的基因在细胞中仅有8个拷贝，那么带入公 式，以99％的概率得 到此基因。
细胞 基因组 用限制性 酶剪切
用连接酶 连接
λ噬菌体 提取DNA 用限制性酶剪切
尼龙膜 与放射性探针 进行分子杂交
膜
重组噬菌体
重组体DNA
细菌 感染
裂解
释放噬菌体菌苔 噬菌体克隆噬菌斑中的 噬菌体克隆用放射自显影 定位阳性克隆 膜
阳性克隆 感染新鲜 的宿主菌菌体，每一个噬菌斑 来自单个感染噬菌体的一个克隆。
如错配的核苷酸均匀分散在探针分子的各部位， 那么这种猜测体探针就不会和目的基因的序列 杂交。
提高杂交温度，以减少假阳性。
(2)PCR猜测体技术
①测定尿酸氧化酶末端一段32aa的序列； ②根据此段顺序两侧的序列推测,合成一组引物; ③从猪肝中提取mRNA,反转录成cDNA,用以上述 引物对此
cDNA进行特异扩增。 ④扩增产物连接到载体上进行在细菌或酵母中。这些克隆代表从某个特定物 种或器官的所有mRNA制备复杂的基因组中分离单拷贝的基因；
②是从来源复杂的总mRNA的cDNA中分离稀 有的cDNA克隆。第一总RNA中，各种RNA丰 度不同。故Clarke-C少要含有5×105的个重组 体，可根据RNA的复杂性估计的计算方法和经 验来确定。其计算公式是：
N ln1( p) ln1( 菌体，每一个噬菌斑来自单个感染噬菌 体的一个克隆。各个克隆带有不同的细胞DNA片段。
(b) 噬菌斑被转移到尼龙膜上，而噬菌体的蛋白被溶 解，和重组体DNA分开，DNA吸附到膜上。再将此 膜与带有放射性同位素标记的探针进行分子杂交， 可以杂交的便是目的基因。
(b) SV40
kanr /neor
ZapcDNA克隆
pr
f1 ori
PA
载体含有真核 基因调节元件，
可在哺乳动物
细胞中高水平
pBk-CMV (4513bp)
插入的 cDNA
的表达插入的
cDNA, 通 过 neor
标记可选择稳
定的DNA重组体。
PA O
CMV (cytomegalovirus)
碱基的简并性可通过以下的策略来解决： ①选用简并程度最低的序列； ②选用使用频率最高的密码子； ③简并密码子的第3个碱基可用H； ④应用混合探针； ⑤控制退火温度。
一、简并寡核苷酸探针
应用混合探针分离克隆基因虽取得了良好的效 果，但也会产生相当数量的假阳性。克服假阳 性的方法有二: 种生物体全部基因的随机 片断的重组DNA克隆群。其中可能含有基因外 显子、内含子、基因5'端调控区、3'端的尾随序 列和原来样本中存在的所有DNA序 列相一致，并保持原有的相关丰度。