EB病毒与乳腺癌的相关性

EB病毒与乳腺癌的相关性
潘鑫艳;王靖彦;黎贵芸;徐文漭;王丽;宋蜀伶;杨举伦
【摘要】Purpose To study the relationship between Epstein-Barr virus ( EBV) and breast cancer. Methods 246 cases of breast lesions at different development stages were selected and EBV DNA, RNA and protein was used by polymerase chain reaction ( PCR) , in situ hybridization ( ISH) , laser capture microdissection ( LCM) , immunohistochemistry ( IHC) EnVision technology. Results No expression of EBV latent membrane protein LMP1 was detected in all 246 cases of benign and malignant breast lesions. In 12 cases of breast cancer of EBV DNA, carcinoma in situ and breast lesions not EBV DNA was detected by PCR. However, using digoxigenin la-beled EBV DNA probe for the 48 cases ( including 12 cases of breast cancer specimens of positive PCR amplification) of benign and malignant breast lesions, no positive hybridization signal was detected in cancer cells, mammary epithelial cells and stromal lympho-cytes. Using laser capture microdissection and PCR amplification, cancer cells and stromal cells were captured respectively from 12 ca-ses of PCR positive and 12 cases of PCR negative of breast cancer specimens, we found EBV DNA was only amplified in mesenchymal cells. In the detection of the EBER expression with EBV RNA probe and in situ hybridization, the results of 75 cases of benign and malignant breast lesions ( including 12 cases of breast cancer by positive PCR amplification) were all negative. Conclusions The
re-sults indicate that the tumorigenesis and development of breast cancer
have nothing to do with EBV infection in all cases were chosen.%目的：探讨EB病毒( Epstein-Barr virus, EBV)与乳腺癌发生、发展的相关性。

方法随机选取不同发展阶段的乳腺病变组织246例,采用聚合酶链反应( polymerase chain reaction, PCR)、原位杂交( in situ hybridization, ISH)、激光捕获显微切割( laser capture microdissection, LCM)、免疫组化染色EnVision法检测EBV DNA、RNA、蛋白质水平,分析EBV与乳腺癌发生、发展的关系。

结果免疫组化标记246例乳腺病变均未检测到EBV潜伏膜蛋白LMP1的表达。

PCR法在乳腺癌(12/23)、原位癌(0/10)以及乳腺良性病变(0/15)中检测到EBV DNA,但用地高辛标记的EBV DNA探针对48例乳腺良、恶性病变组织(包括PCR扩增阳性的12例乳腺癌标本)进行ISH检测,在癌细胞、乳腺上皮细胞和间质淋巴细胞内均未检测到阳性杂交信号。

采用LCM PCR检测12例PCR扩增阳性和12例阴性乳腺标本的乳腺上皮细胞和间质淋巴细胞,在12例PCR阳性标本的间质细胞中扩增出EBV DNA,癌组织中未检出EBV DNA。

用EBV RNA探针和ISH方法在75例乳腺良恶性病变组织中均未检测到EBER表达。

结论在该文选择的标本中,乳腺癌发生、发展与EBV感染无关。

【期刊名称】《临床与实验病理学杂志》
【年(卷),期】2014(000)011
【总页数】5页(P1215-1219)
【关键词】乳腺肿瘤;EB病毒;聚合酶链反应;原位杂交;免疫组织化学
【作者】潘鑫艳;王靖彦;黎贵芸;徐文漭;王丽;宋蜀伶;杨举伦
【作者单位】成都军区昆明总医院病理科，昆明 650032;昆明医科大学成都军区昆明总医院临床学院，昆明650032;成都军区昆明总医院病理科，昆明 650032;
成都军区昆明总医院病理科，昆明 650032;成都军区昆明总医院病理科，昆明650032;成都军区昆明总医院病理科，昆明 650032;成都军区昆明总医院病理科，昆明 650032
【正文语种】中文
【中图分类】R737.9
乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，严重影响妇女的身心健康。

近年来我国乳腺癌发病率逐年上升，并有跃居女性恶性肿瘤首位的趋势。

乳腺癌的发病是一个多因素长期作用、逐步发展的过程[1]。

最近文献报道[2]发现EB病毒(Epstein-Barr virus, EBV)、人类乳头瘤状病毒(human papillomavirus, HPV)、小鼠乳腺肿瘤病毒(mouse mammary tumor virus, MMTV)可能在乳腺癌的发病过程中起作用，其中EBV与乳腺癌的相关研究备受关注。

EBV是一种人类DNA疱疹病毒，为线
形双链DNA病毒，感染人口咽部上皮细胞及B淋巴细胞。

自1995年Labrecque 等[3]最先报道EBV与乳腺癌的相关性后，陆续有相关报道。

然而，也有一些报道[4,5]认为EBV与乳腺癌的发生无相关性。

由于检测方法的差异以及实验材料处理
方式不同，无法达到一致的解释，EBV与乳腺癌发生、发展是否相关成为一个令
人困惑的问题。

若能证实EBV感染是乳腺癌的致癌因子或促癌因子而导致小部分
乳腺癌的发生，将对乳腺癌的预防、早期诊断和治疗有重要意义。

本文收集乳腺良、恶性病变组织，从核酸和蛋白质水平分析EBV与乳腺癌之间的关系，为防治乳腺
癌寻求一条新途径。

1 材料与方法
1.1 材料收集2009～2013年成都军区昆明总医院乳腺病变组织246例，包括乳
腺浸润癌184例、原位癌10例、不典型增生5例、良性病变47例，全部标本均
经两位有经验的病理医师证实。

1.2 方法
1.2.1 不同方法分别检测乳腺病变组织中EBV的核酸和蛋白采用聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)和原位杂交法(in situ hybridization, ISH)检测48例标本(浸润癌23例、原位癌10例、良性病变15例)的EBV DNA；用激光捕获显微切割(laser capture microdissection, LCM)PCR检测上述48例标本中12例PCR扩增阳性乳腺癌标本的癌细胞和间质细胞中EBV DNA；ISH法检测75例乳腺癌标本的小RNA(EBER1/EBER2)；免疫组化法检测246例标本的EBV 表达蛋白LMP1。

1.2.2 PCR检测乳腺良、恶性病变组织中的EBV DNA 应用Primier 5.0软件针对EBV全基因组设计8对引物，引物序列和扩增区域详见表1。

从乳腺石蜡切片组织中提取DNA，进行PCR扩增，反应结束后，取扩增产物5 μl进行1.5%琼脂糖凝胶电泳分析，观察条带大小是否与目的DNA大小一致。

对阳性PCR产物进行测序鉴定。

1.2.3 DNA探针的合成以鼻咽癌阳性标本为模板，使用8对引物进行PCR扩增，割胶纯化。

将纯化的扩增产物与pMD-19T Vector进行连接，转化DH 5α大肠杆菌感受态细胞，挑取阳性克隆扩大培养，提取质粒并测序鉴定。

以地高辛探针标记试剂盒(PCR DIG Probe Synthesis Kit购自Roche公司)标记，合并8个DNA 探针。

1.2.4 ISH检测EBV DNA 乳腺标本石蜡切片脱蜡，水化，预杂交，用上述混合DNA探针进行ISH检测，经一抗(鼠抗地高辛抗体)、二抗(HRP标记抗鼠IgG)、HRP聚合物信号放大，DAB显色，镜下观察癌细胞以及其他间质成分细胞核是否存在EBV DNA。

表1 EBV基因组DNA PCR扩增引物引物名称引物序列(5′-3′)扩增区域产物大小
(bp)退火温度
(℃)P1:TTTTCTGCTAAGCCCAACACBamHIW115656ACGAGGACCCTTCTACG GACP2:GCCAGGAGTCCACACAAATGBamHIW215058AGTCAGCGACGGTGA TGAAGP3:AGTTACGGTTCGCTACATCAAEBER117858GAATACCCTTCTCCCA GAGGP4:GTGAGGACGGTGTCTGTGGTEBER218056GGTTAAGCGTGCATCTTC TGP5:GAGGGTGGTTTGGAAAGCATEBNA123758AGGGGAGACGACTCAATG GTP6:ATACACAGGAGCCTCACGAAEBNA3A23858AGTCTATCCCATACGCAC GAP7:GCCTGCCTCACCCTAGACTABMRF120558TGATGCCAGACCTGTAAAA CCP8:GGGGTCTCGGGGATACTATGBZLF17658GATGGCAAGATTCAATTTCG 1.2.5 LCM PCR法检测EBV DNA 采用LCM技术捕获乳腺标本中的乳腺癌细胞和间质细胞(含纤维细胞、纤维母细胞、淋巴细胞)，分别提取乳腺癌细胞和间质细胞的基因组DNA(QIAamp DNA Micro Kit，Cat.56304，德国QIAGEN公司)，采用设计的8对引物对其进行PCR扩增，检测癌细胞及间质细胞中的EBV。

1.2.6 ISH检测EBV RNA 使用EBER ISH检测试剂盒(福建TIB公司)检测EBV编码的小RNA即EBER1/EBER2。

1.2.7 免疫组化检测乳腺病变组织EBV的LMP1蛋白表达 EBV潜伏膜蛋白LMP1抗体购自DAKO公司，采用免疫组化EnVision法检测乳腺良恶性病变组织中LMP1蛋白的表达。

2 结果
2.1 检测乳腺病变组织中EBV DNA
2.1.1 PCR扩增使用8对引物对48例乳腺良、恶性病变标本进行PCR扩增，12例乳腺癌标本中扩增出EBV DNA(图1)，而15例纤维腺瘤标本和10例乳腺原位癌中均未扩增出阳性产物，乳腺癌中PCR扩增的阳性率为52%(表2)。

将阳性对照及检测样本的PCR产物进行测序分析，发现与EBV基因组序列一致。

图1 PCR检测EBV DNA
A.自行设计的8对引物；
B.乳腺癌PCR扩增结果：1、5、7. EBV DNA阳性；2～
4、6. EBV DNA阴性
表2 PCR检测EBV DNA病理组织类型nEBV DNA+阳性率(%)乳腺癌231252.1 浸润性导管癌161275 浸润性小叶癌700乳腺良性肿瘤1500 纤维腺瘤和叶状肿瘤1500乳腺原位癌1000
2.1.2 ISH检测本组对8对引物扩增的PCR产物进行克隆、纯化、地高辛标记，制备EBV DNA探针进行EBV定位，对上述48例有PCR扩增结果的乳腺标本进行ISH检测，结果在23例乳腺癌、10例乳腺原位癌和15例良性病变组织中均未检测到阳性杂交信号(图2)。

2.1.3 LCM PCR检测从48例有PCR扩增结果的乳腺标本中选择阳、阴性标本各12例，用LCM技术分别获取乳腺上皮成分和间质成分，提取DNA，然后应用8对引物对其进行PCR扩增，结果在12例阴性样本的乳腺上皮细胞和间质细胞均未检测到EBV DNA；在12例阳性样本的乳腺癌细胞也未检测到EBV DNA，但在乳腺间质细胞中扩增出EBV DNA(图3、4)。

2.2 检测乳腺病变组织中EBV RNA 采用EBER检测试剂盒检测乳腺癌组织中EBV 的小RNA(EBER1/EBER2)，结果在阳性对照的鼻咽癌切片中检测到杂交信号，在75例乳腺癌切片中均未检测到杂交信号。

②A②B③
图2 ISH检测EBV DNA：A.鼻咽癌，阳性对照；B.乳腺浸润性导管癌，阴性图3 乳腺癌切片显微切割，空洞处为乳腺癌组织
图4 切割标本PCR扩增结果
2、4、6、8样本的癌组织(T)中未检测到EBV DNA，但在间质(S)中检测到EBV
DNA；1、3、5、7样本的乳腺上皮组织(T)和间质(S)中均未检测到EBV DNA
2.3 乳腺病变组织中EBV LMP1的表达本组免疫组化EnVision法检测246例乳
腺良、恶性病变组织中EBV潜伏膜蛋白LMP1的表达，结果显示：LMP1在阳性
对照(鼻咽癌组织)的细胞质中表达；在246例乳腺良、恶性病变组织中均未见表达(表3)。

表3 乳腺良、恶性病变组织中EBV LMP1的表达病理组织类型nEBV LMP1+-浸
润性导管癌1630163黏液腺癌10010浸润性小叶癌707髓样癌202腺样囊性癌202乳腺原位癌10010乳腺不典型增生505纤维腺瘤15015乳腺普通型增生32032合计2460246
3 讨论
自1994年Horiuchi等[6]首次采用PCR在乳腺癌中检测到EBV后，陆续有研究
者[7-11]在乳腺癌组织中发现EBV及其产物，Fina等[12,13]报道EBV表达定位
于恶性上皮细胞，提示EBV感染与乳腺癌的发生、发展相关。

也有文献报道[14-16]在乳腺癌组织中未发现EBV及其产物，因而认为EBV与乳腺癌发病无相关性。

为了进一步探讨EBV与乳腺癌的关系，本实验针对EBV DNA的几个重要区域(包括核抗原EBNAs、小RNA区EBER1和EBER2、早期基因BZLF和BMRF1、高
度保守和高度重复序列BamHIW区域)设计8对引物，采用PCR扩增技术检测乳腺标本中的EBV DNA。

通过对48例乳腺良恶性病变组织的PCR扩增，在乳腺癌(12/23)中检测到EBV DNA，但在10例乳腺原位癌和15例腺良性病变中均未检
出EBV DNA，与Bonnet等[8]报道采用PCR扩增EBER2的结果一致。

PCR扩增虽然灵敏度好、阳性率高，但无法确定EBV在组织细胞中的位置，即不
能判定是乳腺癌细胞感染EBV还是间质细胞感染EBV。

采用探针标记法对PCR阳性产物进行标记，构建地高辛标记的EBV DNA探针，对上述48例标本进行ISH
分析，结果在乳腺上皮肿瘤细胞和间质细胞中(包括12例PCR阳性病例)均未检测
到杂交信号。

为什么12例PCR扩增阳性标本ISH检测为阴性呢？这可能与乳腺
癌中EBV拷贝数低和ISH检测的敏感性低于PCR有关。

Murray等[11]采用高敏
感的实时定量PCR在92例乳腺癌中检出19例阳性，检测19例EBV DNA阳性
标本的EBV负荷量均在1.1～7.1 EBV拷贝/1 000细胞，而阳性对照鼻咽癌细胞
为5.4～7.6 EBV拷贝/1个细胞。

Arbach等[17]采用同样方法也证实EBV基因组在乳腺癌中的拷贝数相比在鼻咽癌中的拷贝数低。

淋巴细胞对EBV有较高的易感性，而乳腺癌中往往有较多的淋巴细胞。

为检测本
实验在乳腺癌标本中的EBV DNA是来自乳腺癌细胞还是间质中的淋巴细胞，本组采用LCM技术，从PCR扩增阳、阴性的乳腺标本各12例分别捕获乳腺上皮细胞和间质淋巴细胞后进行PCR检测。

结果显示12例PCR阳性的癌细胞中未扩增出EBV DNA，在PCR阳性样本的间质淋巴细胞中扩增出EBV DNA，而12例阴性
者乳腺上皮细胞和间质细胞中均未扩增到EBV DNA，表明EBV感染间质淋巴细
胞而非癌细胞。

本组结果与Chang等[16]采用ISH法检测EBV的结果一致，均认为EBV与乳腺癌无关。

Khan等[18]在三阴乳腺癌(ER、PR、HER-2均阴性)检测EBV阳性位于非恶性细胞。

Mazouni等[19]报道61例样本中仅有几个感染EBV
的淋巴细胞，认为EBV定位于随机浸润的淋巴细胞。

Gaffey等[20]采用实时定量PCR也得出相同的结论。

因此，PCR检测乳腺标本EBV存在局限性，应结合ISH 法或免疫组化结果判定。

本实验应用EBV RNA探针检测EBV的小RNA(EBER1/EBER2)表达，随机选取的75例乳腺癌中均无EBER表达，其中包括12例PCR扩增EBV DNA阳性的乳腺
癌标本。

EBV DNA阳性而EBER ISH检测为阴性，提示其可能为非增殖性感染，
此时EBV处于潜伏状态，不进行复制。

与EBV相关的肿瘤有很多表达EBER[21]，但在乳腺癌中，大部分的EBER ISH检测结果为阴性，且阳性信号只来自于少数肿瘤细胞[9,12,19,22,23]。

Bonnet等[8]采用PCR和Southern blot技术检测到
EBV存在，但应用ISH检测结果为阴性。

为了更进一步验证上述结果，本组采用免疫组化EnVision法检测246例乳腺良恶性病变组织中EBV潜伏膜蛋白LMP1的表达，结果均无LMP1蛋白表达。

不同的EBV检测方法，具有各自的优缺点。

免疫组化技术可在不改变细胞形态的原位上对乳腺癌组织细胞中EBV表达的相关蛋白进行定位、定性、定量检测；而ISH、PCR、LCM-PCR则是对乳腺癌组织中EBV的核酸进行定位、定性、定量检测。

不同的是ISH技术在保持组织细胞形态完整的基础上直接检测EBV核酸，并定位EBV感染的细胞类型，其缺点是敏感性较低。

而PCR技术的灵敏度显著高于ISH法，但其无法定位EBV存在的细胞类型。

本组采用ISH技术检测12例PCR 阳性标本的癌细胞及间质细胞中的EBV，结果显示均为阴性。

LCM技术很好地弥补PCR无法定位这一缺点，该技术采用显微镜可以在镜下精确地分离乳腺癌细胞和间质淋巴细胞，再分别对其EBV DNA进行扩增检测。

因此只有采用各种方法同时进行检测，才能更准确地鉴定EBV与乳腺癌的相关性。

综上所述，本实验通过多种检测方法，从多层面证实EBV感染与乳腺癌发生、发展无关。

由于本实验的标本来源有地区局限性，不除外其他地区乳腺癌与EBV的相关性。

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