综合性试验课程指导书生物显微技术大试验陈超石洪凌编写适用

综合性实验课程指导书《生物显微技术大实验》
陈超、石洪凌编写
适用专业：生物科学
生物技术
唐山师范学院生命科学系
2007年3月
实验学时：36 学时
实验类型：综合性
每组人数：4 人／组
一、实验目的
通过本实验的学习，使学生了解传统显微摄影的原理和方法、暗室技术，掌握采用徒手切片与整体制片法制作永久切片的技术；掌握石蜡切片制作技术及各步骤相关的知识点，掌握数码显微摄影的技术，学会动植物内部结构的比较研究方法。

培养学生采用石蜡切片技术进行动植物组织、结构观察的技能，为今后学生参与动植物细胞学方面的研究工作奠定基础。

二、实验原理
生物组织、细胞除用临时装片方法进行观察外，许多材料还必须经过染色等处理，长期保存这种制片称永久制片。

永久制片无论是涂片、装片、还是切片都需要经过下列步骤：固定、洗涤、染色、脱水、透明、封藏、镜检、标注。

徒手切片法：是指用刀片将手持的新鲜材料切成薄片或将小型而扁薄的材料夹持在夹持物中用刀切成薄片的方法。

徒手切片制作简单，又能随机迅速地观察到植物生活细胞及各器官的内部组织的生活状态和天然色彩，所以在组织化学中应用及其广泛。

石蜡切片法：是用石蜡浸透常用的一种方法。

本实验室让学生用爱氏苏木精稀释液对材料进行整染，仅染色、返蓝后再进行切片。

利用显微摄影装置真实而客观地将显微镜视野中羧观察到的物体的结构拍摄记录下来，这种技术成为显微摄影技术。

传统的显微摄影一般使用传统的相机，将镜头去除，装在显微镜上，拍摄显微镜下看到的切片；对焦、光圈、曝光全在显微镜上操作完成，除了连续照明外，甚至装有闪光灯和色温表，自动曝光系统既可点测光也可中心重点测光，曝光补偿、倒记数显示等等，一应俱全。

传统的显微摄影有着和传统相机一样的缺点：拍摄的照片，不能立拍即现，照片必须要经过冲洗，在数字化成电子文挡的时候，细节有损失等等。

数码显微摄影在装置上，一般使用数码相机通过各种接口和显微镜的组合，然后数码相机和计算机相连；数码显微摄影的优点在于，可即时浏览拍摄，拍摄后的照片即时观看，减少废片率；另外拍摄后的照片即时传入到计算机的分析软件，即刻得出分析接结果，大大缩减了因冲洗照片而耽误大量时间，从而解决了实验的连续性的问题；再者，
数码显微摄影拍摄的图片为数字化的文档，可即刻用于power point教学或日后的编辑出版工作。

本实验涉及以下知识点：试剂的配制、器皿的清洗、材料的选取、材料的固定、动植物组织、细胞的各种染色方法、石蜡包埋技术、切片机的使用、永久切片的制作、动植物组织切片的显微观察及显微摄影。

三、实验方案
本试验共分为三大部分：徒手切片及整体封藏制作永久切片技术、石蜡切片技术、生物显微摄影技术。

徒手切片与整体制片法
徒手切片法
1．取材：长寿花叶或橡皮树叶。

2．切片：
切片前在培养皿（或表面皿）中盛以清水，准备好毛笔、滴管和刀片等用具和欲切的材料。

切片时用左手的三个手指（拇指、食指、中指）拿住材料，并使材料稍突出手指之上（约2mm）,且外侧手指高，内侧手指低，外侧手指做刀的支架。

右侧持刀片，平放于左手的食指之上，刀口向上且与材料的断面平行，然后以均匀的动作，自左前方向右后方滑行切片，注意用整个手臂向后啦，手腕不用力，切片时动作要敏捷，材料要一刀切下，注意用水和润滑材料和刀面如此连续切下许多薄片后，用湿毛笔将这些薄片轻轻的移入一盛水的培养皿中备用。

用毛笔挑选最薄而透明的切片放在载玻片上，制成临时水装片观察。

3．固定：70%酒精固定5min。

（3min）
4．复水：下降至水→50%酒精（3min）→35%酒精（3min）→蒸馏水（3min）注意各级时间短，若时间长的话，会引起材料变形。

不用自来水的原因是杂质多，对显微结构的观察造成障碍。

5．染色：1%番红染20-30min。

6．冲洗：水冲洗及此，洗去浮色。

7．脱水：35%酒精→50%酒精→70%酒精→83%酒精→95%酒精
8．对染：1%苯胺兰染色（2-4min）
9．分色：95%酒精除去多于苯胺兰，注意时间的把握。

10．脱水：100%酒精5min彻底脱水，若脱水不净，透明事会出现乳白色乳浊液，因为水与二甲苯向与会产生乳白色乳浊液。

11．透明：1/2二甲苯+1/2100%酒精(3-5min) →纯二甲苯(3-5min)
12．封藏：树胶封片。

注意封片时树胶的量要适宜，不宜过多，溢出盖玻片四周，导致整个片子不干净，不宜太少，不能充盈整个盖玻片的范围，还留有空气。

若树胶可用加拿大数角、中性树胶、光学树胶。

用二甲苯溶浓度要适宜，不能过稠或过稀，要使树胶能逐滴滴下。

整体制片法：
1．取材：长寿花叶或橡皮树叶。

2．固定：撕表皮：可采用镊子夹取的方法，或用挫折的办法撕取。

取叶片后用镊子夹住叶尖由腹面向背面折断，下表皮相连（轻轻的撕去表皮，将下表皮撕下，放入70%酒精固定5min-10min。

3．复水：50%酒精（3-5min）→35%酒精（3-5min）→蒸馏水（3-5min）
4．染色：爱氏苏木精稀释液染色20-30min。

5．冲洗：用水冲洗后，加2% 氨水返蓝1-4min,时间可视材料兰后而定。

6．脱水：应为35%酒精→50%酒精→70%酒精→83%酒精→95%酒精→100%酒精→100%酒精。

每级1-2min。

7．透明：1/2二甲苯+1/2100%酒精(3-5min) →纯二甲苯(3-5min)
8．封藏：树胶封片
石蜡切片技术
1．取材：依据生物组织取材的各项注意事项。

2．固定：卡诺固定液、FAA固定液固定24小时。

3．复水：卡诺固定液（1h）→50%酒精（1h）→爱氏苏木精染液
FAA固定液→爱氏苏木精染液
4．染色（整染）：爱氏苏木精染液染色，染色时间视材料不同而有所不同，总之使材料最后染指红棕色为止，且内外均染色均匀。

对于染不好的材料，可加长染色时间，还可通过负压，超声波加注浸剂等方法提高染色效率。

时间为1-2天。

5．返蓝：染好的材料，用自来水冲洗，加2% 氨水使材料变为蓝色，时间也因材料的不同而有所不同，好返蓝的材料用水一洗就蓝。

6．脱水：35%酒精→50%酒精→70%酒精→83%酒精→95%酒精→100%酒精→100%酒精。

每级1-2h。

70%酒精处可长期保存。

7．透明：1/2二甲苯+1/2100%酒精(1-2h) →纯二甲苯(1h) →纯二甲苯(1h)
8．浸蜡：石蜡先置于60℃的温箱中，倒入含二甲苯及材料的小瓶中置于38℃温箱中，放置2-4小时。

8．包埋：先提升恒温箱的温度至60℃，换纯蜡3次，每次1-2h，用硬的电光纸、牛皮纸叠纸盒，置于45-60℃的烫板上，倒入材料，摆放好材料，把标签（正面向外置于底部），补足石蜡，倒好后轻轻的置于冷水盆中，注意底面要接触盆中凉水，待石蜡全部凝固后可取出晾干，也可在凉水盆中放置过夜。

9．修块、粘块、整修的步骤：
①选取所要切片的材料，从包埋的石蜡块上用单面刀片切割下来，注意不可损伤包埋的组织。

②确定切面的方位，用刀片将石蜡块的四面作初步的整修。

保证材料四周都有石蜡包围。

但不可太多。

切面的上、下边平行。

③点燃酒精灯，并准备一把旧的解剖刀。

④左手大拇指与食指间持整修好的石蜡块，材料向上用其余三指夹住台木。

此时将解剖刀在酒精灯上加温后，即放在台木与石蜡块之间，因解剖刀已加温，遇上两面的石蜡都会融化，可立即将解剖刀抽出，石蜡块迅速压在台木上。

⑤再将解剖刀蘸取少许石蜡碎屑，放在刚才固定的石蜡四周。

此时，解剖刀再加温，并迅速将石蜡块四周的碎屑烫平。

使石蜡块牢固地粘在台木上。

⑥修石蜡块上下面平行，是切成的蜡带呈一直线，不弯曲。

每个切片中组织的距离接近。

10．切片的方法：
①准备下列用具：毛笔、黑色亮光纸
②将已固着和整修好的石蜡块和台木装在切片机的夹物部分.
③安装切片刀，将刀片夹在刀夹上，并调整好刀的角度。

刀的斜度，非常重要，最好先切除的蜡块试刀，以确定刀的斜度，一经调度适合后，就不要随便变动，以免每次
试刀的麻烦。

④移动刀片固定器，使夹刀部与夹物部之间的距离调整好，以石蜡块的表面刚贴近刀口为度，在旋紧切片固定器的螺旋。

⑤调整石蜡块与刀口之间的角度与位置。

修整蜡块，将刀片移近蜡块，使小蜡块的下边与刀锋平行，如不平行，可调夹物部上的螺旋。

然后把它固定，再转下蜡块．呈矩形才行。

只有平整的蜡块，才能切出平整的蜡带。

最后根据需要，调整控制切片厚度的机制。

调度后，把它固定下来。

上述四步骤完成后，就可进行切片，
⑦开始切片。

右手握旋转轮的手柄，摇动一转就可切下一片，切下的蜡片粘在刀口上，待第二片切下时粘在一起，所以连续摇动就可将切下的蜡片连成一条蜡带。

这时左手就可持毛笔将蜡带提起，边摇边移动蜡带。

转速为每分钟40-50为宜。

⑧切成的蜡带到20-30厘米时，即以右手用另一只毛笔轻轻将蜡带挑起，平放在黑电光纸上。

靠刀的一面较光滑，应向下，较皱的一面向上。

⑨切下的蜡片是否良好，此时应先行检查。

⑩切片工作结束后，仍将刀片用具擦拭干净。

11．贴片：贴附牢固，在染色时不易脱落；是皱褶的蜡片伸展平整。

用具：载玻片、粘片剂、解剖刀、蒸馏水、展片机及铐片机。

材料切成薄片后，须将切片粘在玻璃片上，加热展开，这叫粘片。

①将展片机温度调整到35℃，保持恒定。

②在载玻片上涂蛋白甘油粘片剂。

其法是用细玻璃棒蘸取一小滴粘片剂，加在载玻片的中央，然后用洗净的手指（无名指）加以涂抹，范围不要太广，也不要太多，以能贴足够的蜡片为度。

蛋白甘油粘片剂的配方：（不适宜用作蛋白观察）
③将涂粘片剂的载玻片放在展片机上，滴加蒸馏水数滴，此时若发现水不均匀分散而聚成滴状，即表示玻片不清洁，有残留油脂等物在上面。

④用解剖刀将蜡带切成小段，每段的长度应以盖玻片的长度为准，一般应比盖玻片短约1/5-2/5。

分片应从蜡带交界处分。

F将蜡带轻轻移到涂有水的载玻片上，蜡片光面应向下贴在载玻片上，依次排列整齐。

留出右端贴标签处。

⑤材料展平后，从展片机上取下，稍稍倾斜留出多余的水分，用吸水纸吸干背面及周围多余水分，放于烤片机（35℃）上烤干水分。

12.脱蜡：玻片烘干后，须将蜡脱去，才能染色，脱蜡用二甲苯，把烤好的载玻片放于盛二甲苯的染缸中纯二甲苯(5-10min) →纯二甲苯(5-10min)
若分染需再经酒精入水中，而后染色，其顺序如下：二甲苯→1/2 二甲苯十1/2纯酒精→100%酒精→95％酒精→85％酒精→70％酒精→50％酒精→30％酒精→水→染色
以上各级约需5～10分钟。

13.滴加加拿大树胶封藏。

14．镜检：
显微摄影技术
1.传统显微摄影技术：
（1）显微镜的正确使用
（2）利用显微摄影装置进行拍摄
（3）介绍传统显微摄影的方法暗室技术
2.数码显微摄影技术：
重点是利用数码显微镜进行拍照。

如何正确使用拍摄软件。

四、主要仪器及试剂
主要仪器：YD-6L智能生物组织包埋机、SD-3滑行切片机、QPJ-1旋转切片机、KD-202C轮转式切片机、RM2015上海LEICA切片机、PHT-400病理样品快速超声处理仪、KD-H烘片机、MDJ-4自动磨刀机、XSZ-HS3摄影生物显微镜、XSZ-HS7摄影生物显微镜、DMB5-223I-5Motic数码显微镜、方正尊越系列A360电脑、SFC-18MOTIC 生物显微镜
试剂：95%乙醇、100%酒精、二甲苯、加拿大树胶、石蜡、卡诺固定液、FAA固定液、中性树胶、2% 氨水、爱氏苏木精染液、10%番红水溶液、0.5%固绿、甘油、1%
苯胺兰。

五、实验要求
学生应课前查阅采用常规石蜡切片法进行动植物细胞学研究的相关文献资料，以了解掌握石蜡切片技术的用途。

六、思考题
1.石蜡切片制作过程中每一个环节的目的是什么？你在操作中遇到了什么问题？如何解决？
2.查阅相关文献，总结采用常规石蜡切片法开展的研究工作。

七、实验报告
主要内容包括，实验目的、实验原理、主要仪器设备、实验步骤、实验结果及分析、实验注意事项等几部分。

并回答思考题，对自己在实验中遇到的问题和情况，提出自己的改正建议。