Caspase活性检测说明书

Caspase活性检测（基于p NA标记底物的比色法）
在caspase 的底物多肽上标记发色团如：p NA，可用于检测凋亡细胞中的caspase活性及筛选caspases的激活剂或抑制剂。

本操作步骤主要针对使用酶标仪进行读数而设计。

其中使用的细胞抽提物、底物、抑制剂及p NA的用量为每个样本140ul。

若您希望设计针对分光光度计读数的实验，建议对每种溶液体积进行进一步优化。

所需溶液、试剂及设备
• Caspase底物
• Caspase抑制剂
• 细胞裂解缓冲液：50mM HEPES, pH7.4, 100mM NaCl, 0.1%CHAPS, 1mM DTT, 100uM EDTA • 检测缓冲液：50mM HEPES, pH7.4, 100mM NaCl, 0.1%CHAPS, 10mM DTT, 100uM EDTA, 10%Glycerol
• PBS：将8g NaCl、200mg KCl和1.44g Na2HPO4溶于800ml蒸馏水；用HCl调至pH7.4；定容至1L
• 酶标板和酶标仪
其它试剂(推荐)
• 纯化的Caspase（阳性对照）
• p NA
细胞抽提物的制备
以适合的凋亡诱导剂对细胞进行诱导（参考前述操作方法），同时做阴性对照，包括未处理细胞、用诱导剂的无诱导活性类似物处理细胞（若可得到），或一个凋亡诱导处理“零时间”样品。

应保证有足够细胞进行重复实验，包含或不含抑制剂的对照以检测蛋白浓度。

一般来说，我们下面推荐的裂解前细胞数量可以产生足够蛋白浓度供酶标仪检测；然而不同大小、体积的细胞及蛋白浓度可能需要增加铺板密度。

当裂解2×107/ml细胞是，产生的蛋白浓度约为1-3mg/ml，体积10ul，含约10-30ug蛋白。

依据其细胞系，最少应有106个细胞，体积50ul的裂解缓冲液进行处理。

• 细胞计数，离心收集细胞。

以PBS缓冲液洗涤一次。

若细胞已被caspase抑制剂处理过，建议多洗几次以防止后继实验中可能造成的不利影响。

• 以预冷裂解缓冲液将细胞重新悬浮至期望浓度，冰浴5分钟。

• 4℃，10,000×g，离心10分钟。

• 收集上清（胞浆抽提物），置于冰上备用。

也可将抽提物以冰丙酮/乙醇速冻后储存于-70℃备用。

活性分析
准备caspase底物和抑制剂的贮存液。

1. 制备浓度为100mM的底物的DMSO贮存液。

取储液以检测缓冲液按1:50（2mM）稀
释。

分装剩余底物储液，冻存于-20℃。

2. 制备浓度为100mM的抑制剂的DMSO贮存液。

取储液以检测缓冲液按1:1000 (100uM)
稀释，再取5ul此稀释液加入950ul检测缓冲液中获得5×工作浓度（500nM）。

分装剩
余储液，冻存于-20℃。

3. 将适量检测缓冲液加入酶标板的每个孔中。

空白及细胞抽提样品为确定细胞活性所必
需。

为测量caspase底物的非特异性水解，建议准备一个抑制剂处理过的细胞抽提物作
为对照。

同时也应以纯化的caspase 作为样本的阳性对照（请参见下列反应混合物配制表）。

4. 将酶标板平衡至37℃或室温，但底物的切割率在37℃较高。

5. 将10ul 的细胞抽提物加入适当孔中（空白对照孔不加）。

6. 将20ul 已知抑制剂（终浓度100nM ）或待测抑制剂加入相应孔中。

7. 将酶标板在检测温度预孵育10分钟，使酶/抑制剂充分反应。

8. 加入10ul 预热至反应温度的p NA 标记底物。

9. 以酶标仪测量405nm 的OD 值，根据需要以1-10分钟间隔记录反应30-120分钟内的
数据（时间间隔和记录时间长短通常取决于样本中的caspase 活力以及蛋白含量）。

样本类型
检测缓冲液
细胞抽提物
纯化的Caspase
(~2U/ul)
抑制剂
底物 (2mM)
空白对照 90ul 0 0 0 10ul 细胞抽提物 80ul 10ul 0 0 10ul 抑制剂处理的抽提物 60ul 10ul
0 20ul 10ul
纯化的caspase 75ul 0 15ul 0 10ul 待测样本/细胞抽提物 60ul 10ul
0 20ul 10ul
待测样本/纯化caspase 55ul 0 15ul 20ul 10ul 细胞抽提物/纯化caspase
65ul 10ul 15ul 0 10ul
数据分析
1. 针对每个样品，作A 405－时间曲线。

2. 确定每个样品吸光度值相对时间保持线性关系的时间段，若吸光度值足够大，可计算得
准确斜率。

底物初始浓度（200uM ）为饱和浓度。

对多数样品来说，底物切割的速率可在2小时或更长时间内保持稳定，但高活性样品在实验过程中可能导致底物转为亚饱和状态，所以应选择早期曲线线性阶段来计算斜率。

3. 采用相应线性回归程序计算符合线性规律部分的斜率。

4. 计算多个样品斜率平均值。

5. 若空白对照有明显斜率，将此数值从所有样品中扣除。

6. 以上数据可对caspase 活性有一个定性了解。

若需定量计算样品表达的caspase 活性，
按每分钟水解底物的pmol 数表示。

7. 确定酶标仪的换算因子：
A ．准备50uM p NA-连接的标准品（检测缓冲液），在酶标板的两孔中各加入100ul 。

B ．以100ul 检测缓冲液作为空白，确定A 405平均值。

C ．计算换算因子。

此计算基于pNA 校正标准浓度50uM 。

检测缓冲液中pNA 的消光系数为10000 M -1cm -1。

D ．转换因子 (uM/吸光率)=50uM÷A 405的平均值。

8. 计算活性（每分钟水解底物pmol 数）：活性（pmol/min ）=斜率（吸光率/min ）×换算因
子（uM/吸光率）×反应体积（ul ）。

Caspase活性检测（荧光底物法）
底物工作原理
AFC（7-Amino-4-trifluoromethylcoumarin）为一种荧光分子，以AFC标记一个合适的caspase 底物（通常为合成肽段），所得到的荧光化合物可用于检测caspase的活性。

底物也可用其他荧光分子进行标记，如AMC（7-Amino-4-methylcoumarin）。

当AFC标记于底物上时，在适当波长光线激发下（最大激发波长约为400nm）可发出蓝色荧光。

Caspase可对AFC-底物复合物进行切割从而释放出游离的AFC，游离的AFC可发出黄色荧光（最大激发波长约为505nm）。

AFC与其它荧光标记物相比有更大优势，它的黄绿色荧光既是一种可见光（肉眼可见），同时也可荧光计数，且比一般发色底物灵敏度更高。

检测方法原理
首先以已知量的游离AFC或AMC作出工作曲线（荧光强度）。

通过测量荧光强度计算出反应体系中AFC或AMC的释放量。

AFC或AMC的释放量与反应体系中caspase的活性成正比。

Caspase每活性单位定义为：25℃时，底物浓度为饱和时，每分钟产生1pmol AFC或AMC所需的酶量。

样本
使用纯化或部分纯化的caspase作为样本，酶量应为15ng左右。

若样本未经纯化，应使用特异性caspase抑制剂处理过的样本作为阴性对照。

荧光方法检测caspases活性的通用操作步骤
1. 制备500uM的caspase底物DMSO储液。

2. 制备500uM的caspase抑制剂DMSO储液。

3. 制备缓冲液：100mM HEPES，10%蔗糖，10mM DTT，500uM EDTA，以NaOH或
HCl调pH值至7.5。

4. 用上一步中配置好的缓冲液以不同稀释度稀释样本。

5. 理论上来说，应对每个浓度的样本都做平行对照如下：
a. 仅含底物的反应体系（空白对照）
b. 样本＋抑制剂＋底物（阴性对照）
c. 样本＋底物
6. 通过测量已知量AFC或AMC的荧光强度做标准曲线。

7. 在加入底物前，首先加入抑制剂与样本进行反应。

提前加入抑制剂反应可使实验得到更
好效果。

反应体系示例：在一个Eppendorf管中加入440ul的caspase缓冲液（第三步制备），20ul抑制剂，混匀；加入20ul样本，轻轻混合；30℃孵育60分钟-12小时。

8. 在空白对照管中加入480ul caspase缓冲液，20ul底物。

9. 在阴性对照管中加入20ul底物。

10. 在样本管中加入460ul caspase缓冲液，20ul底物，混匀后再加入20ul样本。

11. 将所有Eppendorf管置于30℃孵育60分钟，测量荧光强度（FU at t0）。

12. 继续孵育60分钟，测量荧光强度（FU at t1）。

13. 按以下公式计算每个样本的荧光强度的变化（∆FU）。

14. ∆FU＝（样本t1时的FU-空白对照t1时的FU）－（样本t0时的FU-空白对照t0时的FU）；
15. 计算得到t1时的酶活性，如果所得酶活性太低，需延长孵育时间（最高至12小时）。

16. 选择表现出最高样本读数和最低阴性对照读数的那组稀释样本的活性为最终结果。