脐带血CD4~+和CD8~+T细胞中T细胞特异转录因子Elf-1表达特点

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脐带血CD4~+和CD8~+T细胞中T细胞特异转录因子Elf-
1表达特点
林春兰;陈少华;杨力建;郑海涛;沈琦;周羽竝;李扬秋
【摘要】目的:了解脐带血单个核细胞(CBMCs)及其CD4~+和CD8~+T细胞亚群中转录因子Elf-1的表达特点.方法:采用SYBR GreenⅠ荧光定量PCR和相对定量分析法检测12例脐带血CBMCs、CD4~+和CD8~+T细胞亚群中Elf-1基因的表达情况,以β_2微球蛋白基因(β_2M)作为内参照,10例健康成人作为对照,采用相对定量公式:2~(-△Ct)×100%,计算Elf-1 mRNA相对表达量.结果:脐带血和健康成人外周血单个核细胞(PBMC)、CD4~+和CD8~+T细胞均表达Elf-1,具体表达量呈现明显的个体差异性.Elf-1 mRNA相对表达量在CBMCs为18.55%±2.48%(其中最高为36.22%,最低为6.45%),在脐带血CD8~+T细胞为3.52%±0.45%(其中最高为6.75%,最低为1.71%),均明显高于健康成人PBMC(9.16%±1.92%)及其CD8~+ T细胞(2.02%±0.27%)(P<0.01,P<0.05),而脐带血CD4~+T细胞Elf-1 mRNA 相对表达量为3.83%±0.61%,与健康成人外周血CD4~+T细胞
(2.73±0.52%)比较,无显著差异.结论:本研究率先报道脐带血T细胞亚群中Elf-1 mRNA表达特点,结果提示Elf-1基因在CBMCs及其CD8~+T细胞亚群中的高表达可能是T细胞的免疫学特点之一.
【期刊名称】《中国病理生理杂志》
【年(卷),期】2010(026)004
【总页数】4页(P777-780)
【关键词】脐带血;基因;Elf-1;T淋巴细胞
【作者】林春兰;陈少华;杨力建;郑海涛;沈琦;周羽竝;李扬秋
【作者单位】暨南大学医学院生物化学教研室,广东,广州,510632;暨南大学医学院血液病研究所,广东,广州,510632;暨南大学医学院血液病研究所,广东,广州,510632;暨南大学医学院血液病研究所,广东,广州,510632;暨南大学医学院血液病研究所,广东,广州,510632;暨南大学医学院生物化学教研室,广东,广州,510632;暨南大学医学院血液病研究所,广东,广州,510632;暨南大学医学院再生医学教育部门重点实验室,广东,广州,510632
【正文语种】中文
【中图分类】R371.22
脐带血 (umbilical cord blood,UCB)作为异基因造血干细胞移植物,由于其具有容易获取、来源丰富、方便快捷、移植物抗宿主病 (graft versus host disease,GVHD)的发生率和严重程度低、潜伏性病毒传播的机率低等优点,使UCB 作为一种新的重要的造血干细胞,尤其是无血缘关系造血干细胞的供体显示出广阔的应用前景。

目前,UCB移植不仅仅被应用于血液病、自身免疫性疾病、免疫缺陷和代谢性疾病以及遗传性疾病等多种疾病的治疗,还开始应用于神经系统疾病、心脏疾病、缺血性下肢血管病、实体瘤的治疗以及组织再生医学方面的应用研究,尽管有些还处于实验阶段,但充分说明了 UCB的重要作用得到了普遍的肯定[1,2]。

有关 UCB T细胞的免疫学特性目前研究不多,本课题组前期研究了 UCB T细胞的 T 细胞受体(T cell re ceptor,TCR)Vα和Vβ基因谱系分布特点[3,4]及TCRζ链基因的表达特点[5],本研究拟在此基础上进一步了解TCRζ基因特异性转录因子 Elf-
1(E74-like factor 1)在 UCB单核细胞细胞及其 CD4+和 CD8+T细胞亚群中的表
达特点,以期为更有效、更合理地应用 UCB提供一些实验依据。

材料和方法
1 标本收集
收集健康妇女妊娠 38-40周之间正常分娩时脐带血 12例(标本来源于广州暨南大学附属第一医院),产妇无恶性肿瘤和各种遗传性疾病,无急慢性传染病。

按常规方法分离单个核细胞,再利用 CD4和 CD8磁珠单抗(MiltenYibiotec)和免疫磁珠分选法(MCAS)分选 CD4+和 CD8+T细胞,10例健康成人外周血样本作为对照。

2 RNA提取及 cDNA合成
按常规方法用 Trizol试剂盒 (Invitrogen)提取RNA,随机引物和反转录酶试剂盒(PowerScriptTMReverse,BD)反转录合成 cDNA第 1链;用 RT-PCR检测β2微球蛋白(β2-microglobulin,β2M)基因的表达情况以检验所合成 cDNA的质量。

3 引物设计
Elf-1:上游引物5′-ACAAAGATGGAAAGGGAAACA-3′,下游引物5′-CCACAACCTGGACACTGCT-3′(基因序列号为 001145353),扩增目的片段长度152 bp,引物由上海英骏合成。

β2M:上游引物5′-TACACTGAATTCACCCCCAC-3′,下游引物5′-CATCCAATCCAAATGCGGCA-3′,产物片段大小为 144 bp,引物由德国柏林 T IB Molbiol公司合成。

4 扩增效率一致性检测
检测样本 Elf-1基因表达情况之前,根据相对定量法分析的原则,首先必须保证 Elf-1和β2M mRNA的扩增效率的一致。

故将Molt-3细胞株的cDNA以 5倍倍比稀释,以 50-5-4作为模板,进行SYBR GreenⅠ实时定量 PCR来检测其扩增效率是否一致。

5 SYBR GreenⅠ实时定量 PCR
利用SYBR GreenⅠ荧光定量 PCR检测各样本Elf-1 mRNA表达情况,并将β2M
mRNA作为内参照。

每一标本分别进行 Elf-1和β2M检测。

总反应体积为20μL,应用 RealMasterMix试剂盒 (Tiangen),包括2.5×RealMasterMix 9μL、0.5 mmol/L上、下游引物以及1μL cDNA。

在95℃、2 min变性后,共进行45个循
环扩增,每一循环包括95℃20 s, 62℃40 s。

并在79℃和81℃2次读板 (1 s)。

随后,以0.17℃/s变化速度从55℃到95℃每隔 2 s记录 1次荧光值,获得熔解曲线。

反应在 Chromo 4荧光定量 PCR仪 (Bio-Rad)中进行。

每样本均重复2次检测。

6 Elf-1 mRNA相对表达水平的计算
采用相对定量法分别分析脐带血和健康成人外周血 Elf-1 mRNA的表达水平,以
β2M为内参照,利用△Ct值,计算脐带血和健康成人外周血 Elf-1 mRNA相对表达量,计算公式为[6]:mRNA相对表达量=2-△Ct×100%,其中,△Ct=Ct(Elf-1)-Ct(β2M)。

7 统计学处理
采用 SPSS 11.5软件分析。

计量资料数据以均数±标准差(±s)表示。

2样本资料
之间的均数比较采用独立样本 t检验。

结果
1 扩增效率一致性分析
为了利用相对定量的比较 Ct法对 Elf-1 mRNA表达进行定量,将倍比稀释的
cDNA的 log值作为横坐标,ΔCt=[Ct(Elf-1)-Ct(β2M)]作为纵坐标绘制关系曲线,得出 Elf-1与内参照之间的直线斜率的绝对值为 0.066,直线斜率的绝对值接近于 0[7],表明目的基因 Elf-1和参照基因β2M的扩增效率一致,实验结果可以应用公式 2-
△Ct×100%进行相对定量。

2 Elf-1扩增产物鉴定
β2M产物的熔解曲线峰值均在83℃,Elf-1产物的熔解曲线峰值在82℃,2%琼脂糖凝胶电泳分析显示 Elf-1实时定量 RT-PCR产物片段大小正确,为 152 bp。

PCR产物直接序列分析结果与 Elf-1基因序列 (No.001145353)完全一致。

3 Elf-1在CBMCs和 PBMC中的表达
所有检测样本均表达 Elf-1。

根据实时定量PCR的相对定量公式:2-△Ct×100%计
算 Elf-1的mRNA表达量,结果显示,12例脐带血 Elf-1 mRNA相对表达量为
18.55% ±2.48%,其中最高为36.22%,最低为 6.45%,10例健康成人 Elf-1的mRNA相对表达量为9.16%±1.92%,均存在个体表达差异性,这种差异尤其以CBMCs为明显,见图1,CBMCs中Elf-1 mRNA表达量明显高于PBMC (P<0.01)。

Figure 1. Expression of Elf-1 mRNA in UCB and peripheral blood from healthy adults.图 1 Elf-1在脐带血及健康成人外周血中的表达水平
4 Elf-1在CD4+及CD8+T细胞中的表达特点
Elf-1在脐带血及健康成人外周血 CD4+及CD8+T细胞中的表达水平见图 2。

12
例脐带血CD4+T细胞中 Elf-1 mRNA相对表达量为3.83% ±0.61%,虽然高于健
康成人外周血 CD4+T细胞(2.73%±0.52%),但无显著差异 (P>0.05)。

而脐带血CD8+T细胞中 Elf-1 mRNA相对表达量相对较高(3.52%±0.45%),其中最高为
6.75%,最低为 1.71%,明显高于健康成人外周血 CD8+T细胞(2.02%±0.27%,P<0.05)。

脐带血中 CD4+T细胞和 CD8+T细胞 Elf-1 mRNA表达水平差别无显著(P>0.05);成人外周血中 CD4+T细胞和 CD8+T细胞 Elf-1 mRNA表达水平差别
无显著(P>0.05)。

Figure 2. Expression level of Elf-l mRNA in CD4+,CD8+T cells from UCB
and peripheralblood of healthy adults.图 2 Elf-1在脐带血及健康成人外周血中CD4+、CD8+T细胞的表达水平
讨论
Elf-1是 Ets转录因子家族成员之一,Elf-1基因定位于 13号染色体 13q13,主要表
达于造血细胞和成纤维细胞等,调节诱导多种基因的表达,包括CD4、G M-CSF和TCRζ等。

Elf-1蛋白为一种与细胞增殖相关的核蛋白,在 T细胞核中结合于TCRζ
基因的启动子并激活启动转录,是 T淋巴细胞特异性转录因子[8]。

TCRζ是 TCR-CD3复合物中最重要的成员,在细胞内外信号传递以及 T细胞的活化增殖中扮演着举足轻重的地位。

研究表明,TCRζ链表达缺失或下调不仅影响 TCR在细胞表面的表达,还导致 T细胞信号转导异常及免疫细胞功能障碍[9]。

而TCRζ链的正常表达非常依赖于 Elf-1的调节,在TCRζ基因启动子上有两个特异性的 Elf-1结合位点zEBS1和 zEBS2,其中 zEBS1是所有 Elf-1结合位点中亲和力最高的,Elf-1与之结合后激活启动TCRζ基因的转录[8]。

由于 Elf-1异常而导致TCRζ基因表达下调在SLE及口腔癌中均有报道[10,11]。

我们前期研究比较系统地分析了脐带血 T细胞的标型、TCR基因家族分布和相关基因表达情况,并发现 CB CD4+和 CD8+T细胞的TCRζ基因表达量均明显高于健康成人等特点[3-5]。

本研究进一步分析了这些脐带血 T细胞样本中 Elf-1基因的表达水平,结果发现:在脐带血单个核细胞水平上检测显示Elf-1 mRNA表达水平明显高于健康成人对照组,进一步分析分选的 CD4+和 CD8+T细胞中 Elf-1 mRNA 表达水平则显示,在 CB CD8+T细胞中,Elf-1基因的表达水平同样高于健康成人对照组,但 CB CD4+T细胞 Elf-1 mRNA的表达水平虽然略高于健康成人对照组,但无显著差异。

本研究初步的结果提示 Elf-1基因在脐带血 T细胞表达水平与成人外周血 T细胞中的一些差异和特点,整体结果显示 Elf -1基因在 CB中高表达特点,而在 CD4+T细胞中表达水平比较接近正常人,可能是其一个特点,提示CD8+T细胞和 CD4+T细胞中在 TCR信号通路分子表达上可能存在一些差异,由于不同亚群 T 细胞在移植免疫中所发挥作用有明显的不同,与移植排斥和移植物抗宿主病等密切相关,因此,对于 CB中 T细胞相关信号通路基因等系统的分析对于深入了解CB T 细胞特点是十分必要的。

总之,本实验率先对脐带血中 Elf-1 mRNA的表达水平进行初步研究,结果提示脐带血中 Elf-1 mRNA的高表达也许是TCRζ基因高表达的重要因素。

但由于 Elf-1
mRNA的表达产物要经过 PKC-θ进行翻译后磷酸化及糖基化修饰才能成为有活性的TCRζ转录因子,因此后续有必要对 Elf-1及 PKC-θ作进一步研究,才能提供更详尽的实验数据。

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