阿托伐他汀对氯化锂诱导人脐静脉内皮细胞Wnt信号通路相关因子表达的影响

阿托伐他汀对氯化锂诱导人脐静脉内皮细胞Wnt信号通路相
关因子表达的影响
申玉超;于晓玲;张秀梅
【摘要】目的研究探讨阿托伐他汀对诱导人脐静脉内皮细胞Wnt信号通路相关因子表达的影响。

方法人脐静脉内皮细胞、传代后取生长良好4～6代用于实验。

实验分空白对照组、氯化锂组和阿托伐他汀组。

细胞经孵育24h后,用硝酸还原酶法
测定细胞培养上清液中的一氧化氮含量,用免疫组化法和蛋白质印迹法检测Wnt1、β-catenin及蓬乱蛋白-1（dvl-1）蛋白的表达。

结果与对照组相比,其他两组细胞
培养的上清液中一氧化氮含量显著减少,Wnt1、β-catenin及dvl-1蛋白的表达增多;与氯化锂组相比,阿托伐他汀组细胞培养的上清液中一氧化氮含量显著增
多,Wnt1、β-catenin及dvl-1蛋白的表达明显减少。

结论抑制Wnt/β-catenin
信号通路可能是阿托伐他汀抗动脉粥样硬化的机制之一。

【期刊名称】《解放军医学院学报》
【年(卷),期】2013(034)003
【总页数】3页(P276-278)
【关键词】动脉粥样硬化;内皮细胞功能;阿托伐他汀;人脐静脉内皮细胞;Wnt信号
通路;氯化锂
【作者】申玉超;于晓玲;张秀梅
【作者单位】辽宁医学院附属第一医院,辽宁锦州121001;;;
【正文语种】中文
【中图分类】R543.1
动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是众多心脑血管疾病共同的病理基础，严重危害人类健康。

近年来内皮损伤学说得到了多数学者支持，内皮功能不全被认为是AS发生机制中的始动环节，因而对内皮细胞损伤进行药物干预治疗，也成为心血管疾病领域研究的一个新的趋势[1]。

Lee等[2]激活内皮细胞的Wnt/β-连环蛋白(Wnt/β-catenin)信号通路，发现内皮细胞功能紊乱，单核细胞对血管内皮的黏附性增强，但内皮细胞黏附分子表达并未增加，因此推断Wnt/β-catenin信号通路可能与AS的发生机制有关[3-4]。

本文通过研究阿托伐他汀对氯化锂诱导人脐静脉内皮细胞Wnt信号通路相关因子Wnt1、β-catenin、dvl-1蛋白表达的影响，探讨AS与Wnt/β-catenin信号通路的关系及阿托伐他汀抗AS的可能机制。

材料和方法
1 材料和试剂人脐静脉内皮细胞株(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)购自 ATCC公司；胎牛血清、1640培养基、胰蛋白酶购自海克隆生物有限公司(北京)；Licl购自北京协生生物科技有限公司；阿托伐他汀原粉购自辉瑞公司；兔抗人Wnt1抗体购自巴傲得生物科技有限公司；鼠抗人β-catenin抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司；兔抗人dvl1抗体购自北京博奥森生物技术有限公司；NO试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

2 实验细胞与分组 HUVECs的培养用含体积分数10%胎牛血清的1640细胞培养液培养，体积分数5% CO2的细胞培养箱中，1~2 d换液1次。

以0.25%胰蛋白酶消化及传代，并在倒置显微镜下观察细胞形态、选择生长良好的4~6代的细胞用于实验。

细胞分为3组：1)空白对照组：细胞不加任何干预；2)Licl组：加入终浓度为20 mmol/L的Licl；3)阿托伐他汀组：加入终浓度为20 mmol/L的
Licl+10 μmol/L的阿托伐他汀共同处理。

各组经卵育24 h后，收集细胞及培养的
上清液，观察不同组Wnt1、β-catenin、dvl-1蛋白的表达及培养液中NO含量的变化。

3 HUVECs形态学观察倒置显微镜观察各组处理24h后HUVECs的形态学变化。

4 HUVECs的NO含量用硝酸还原酶特异性将NO3-还原NO2-，通过显色深浅测定其浓度高低。

吸取各组中的细胞培养液，按南京建成生物工程研究所的试剂盒说明书进行检测。

5 免疫组织化学法检测蛋白的表达将第4代细胞接种在有盖玻片(多聚赖氨酸处理好)的6孔板中进行细胞爬片。

4 ℃10%甲醛固定30 min，30%H2O2 1份+纯甲醇9份室温浸泡15 min，封闭液37 ℃孵育30 min，加兔抗人Wnt1、鼠抗人β-catenin、兔抗人dvl-1抗体(1∶600)于4 ℃过夜;加二抗A液37 ℃卵育30 min，加二抗B液37 ℃孵育30 min，显色、复染。

以上每步之间用PBS冲洗3次，每次4 min；显色、复染，脱水、封片。

镜下观察蛋白表达。

6 Western blot法检测蛋白表达收集各组细胞，超声裂解细胞，4 ℃ 1 000 g离心2 min，取上清液，用考马斯亮蓝法蛋白定量。

取20 μl蛋白质样品行聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，5%脱脂奶粉封闭2 h，分别滴加兔抗人Wnt1、鼠抗人β-catenin、兔抗人dvl-1(1∶400)抗体，4 ℃孵育过夜，相应碱性磷酸酶标记的二抗室温孵育2 h，碱性磷酸酶法显色。

于扫描仪上成像，并用GENE GENIUS软件对条带进行灰度值半定量进行分析。

以肌动蛋白(β-actin，分子量为43 kU)为内参照，Wnt1(分子量为40 kU)、β-catenin(分子量为92 kU)及dvl-1(分子量为76 kU)与β-actin条带灰度值的比值代表各蛋白表达的相对量。

7 统计学方法采用SPSS13.0统计软件，计量资料用-x±s表示，组间差异采用单因素方差分析，组间两两差异采用SNK检验。

P＜0.01为差异有统计学意义。

图1 倒置显微镜观察各组的形态学变化
图2 免疫组化法检测各组Wnt1、β-catenin、dvl-1蛋白表达 A：Wnt1抗体；
B：β-catenin抗体； C：dvl-1抗体
结果
1 HUVECs形态学观察对照组细胞倒置显微镜下呈单层铺路石状镶嵌排列，互不
重叠，细胞边界清晰，呈多角形；Licl组细胞收缩变圆，细胞间隙增宽，边界不清，部分细胞脱落；阿托伐他汀组细胞间隙较Licl组窄，细胞形态趋于对照组。

见图1。

2 各组HUVECs的NO含量比较与对照组比较，Licl组及阿托伐他汀组细胞培养
的上清液中一氧化氮含量显著减少(P＜0.01)；与Licl组比较，阿托伐他汀组细胞
培养的上清液中一氧化氮含量显著减少(P＜0.01)。

见表1。

3 各组Wnt1、β-catenin、dvl-1蛋白表达利用免疫组化法检测，对照组Wnt1、β-catenin、dvl-1蛋白在细胞质内出现棕黄色淡染颗粒；与对照组比较，Licl组
细胞质内出现大量棕色颗粒聚集、浓染；阿托伐他汀组较对照组细胞质内出现较多棕黄色颗粒，但较Licl组棕黄色颗粒明显少。

见图2。

利用Western blot法检测，与对照组相比，Licl组和阿托伐他汀组Wnt1、β-catenin、dvl-1蛋白定量明显上升(P＜0.01)；与Licl组相比，阿托伐他汀组Wnt1、β-catenin、dvl-1蛋白定量
明显降低(P＜0.01)。

见表1、图3。

表1 各组HUVECs的NO含量及Wnt1，β-catenin，dvl-1表达的比较, n=6)aP ＜0.01，与对照组相比较；bP＜0.01，与Licl组相比较?
图3 Western blot法检测各组HUVECs的Wnt1，β-catenin， dvl-1蛋白表达
电泳图
讨论
Wnt信号通路至少分为3个分支[5]：经典Wnt信号通路(Wnt/β-catenin信号通路)，Wnt/JNK信号通路，Wnt/Ca2+信号通路。

通过上述途径影响细胞的增殖，分化及凋亡。

本研究主要探讨Wnt/β-catenin信号通路，正常情况下此通路处于
关闭状态，当被激活时Wnt蛋白表达增多，与其受体卷曲蛋白(frizzled)结合，激
活dvl-1，使糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)活性受抑制，胞内β-catenin水平升高，入细胞核识别淋巴样增强因子/白细胞增强因子(Tcf/Lef)[6-7]。

β-catenin入细胞
核形成Tcf-β-catenin复合物，它可与钙黏蛋白启动子区结合，从而下调钙黏蛋白的表达[8]。

钙黏蛋白表达减少，使内皮细胞间黏附功能下降，细胞间缝隙形成、
通透性增加，从而导致炎症细胞侵入血管内皮下致AS形成。

有报道证实了
Wnt/β-catenin信号通路在内皮细胞黏附连接重建中居于重要地位[9-10]。

Lee等[2]激活内皮细胞的Wnt/β-catenin信号通路，发现内皮细胞功能紊乱，单核细胞对血管内皮的黏附性增强，但内皮细胞黏附分子表达并未增加。

综上推断Wnt/β-catenin信号通路激活与AS的形成有关。

阿托伐他汀是3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A(HUG-CoA)还原酶选择性抑制剂，是
广为应用的他汀类药物，其除有降脂作用外，还具有独特的心血管疾病防治作用。

Haidari等[11]发现阿托伐他汀通过抑制血管内皮细胞钙黏蛋白酪氨酸磷酸化保护
内皮细胞间的黏附功能。

本研究通过Wnt信号通路激活剂Licl诱导HUVECs，发现内皮细胞分泌的NO明显减少，同时Wnt1、β-catenin、dvl-1蛋白表达明显升高，证明在这一过程
Wnt/β-catenin信号通路激活。

在Licl诱导HUVECs的同时加入阿托伐他汀，发现内皮细胞分泌的NO明显增加，同时Wnt1、β-catenin、dvl-1蛋白表达明显
降低，证明在这一过程Wnt/β-catenin信号通路被抑制。

本研究证实了Wnt/β-catenin信号通路激活可能与AS的形成有关，而阿托伐他汀抗AS可能与其抑制Wnt/β-catenin信号通路有关。

参考文献
1 Schwartz BG, Economides C, Mayeda GS， et al. The endothelial cell in health and disease ： its function， dysfunction， measurement and therapy［J］. Int J Impot Res， 2010， 22（2）： 77-90.
2 Lee DK， Nathan Grantham R， Trachte AL， et al. Activation of the canonical Wnt/beta-catenin pathway enhances monocyte adhesion to endothelial cells［J］. Biochem Biophys Res Commun， 2006， 347（1）：109-116.
3 Marinou K， Christodoulides C， Antoniades C， et al. Wnt signaling in cardiovascular physiology. Trends Endocrinol Metab. 2012. [Epub ahead of print] .
4 Mill C， George SJ. Wnt signalling in smooth muscle cells and its role in cardiovascular disorders［J］. Cardiovasc Res， 2012， 95（2）：233-240.
5 Rao TP，Kühl M. An updated overview on Wnt signaling pathways：a prelude for more［J］. Circ Res， 2010， 106（12）： 1798-1806.
6 Miller JR. Wnt signal transduction［M］. London：Nature publishing Group，2002：195-208.
7 Miller JR， Hocking AM， Brown JD， et al. Mechanism and function of signal transduction by the Wnt/beta-catenin and Wnt/Ca2+ pathways［J］. Oncogene， 1999， 18（55）： 7860-7872.
8 Birchmeier W. Cell adhesion and signal transduction in
cancer.Conference on cadherins， catenins and cancer［J］. EMBO Rep，2005， 6（5）：413-417.
9 Van Gijn ME， Daemen MJ， Smits JF， et al. The wnt-frizzled cascade in cardiovascular disease［J］. Cardiovasc Res， 2002， 55（1）：16-24. 10 Kuroda J， Nakamura M， Yoshida M， et al. Canonical Wnt signaling in the visceral muscle is required for left-right asymmetric development of the Drosophila midgut［J］. Mech Dev， 128（11-12）： 625-639.
11 Haidari M， Zhang W， Chen Z， et al. Atorvastatin preserves the integrity of endothelial adherens junctions by inhibiting vascular endothelial cadherin tyrosine phosphorylation［J］. Cell Res， 2012，318（14）： 1673-1684.。