ATP生物发光原理及应用研究

ATP生物发光原理及应用研究
ATP生物发光是一种快速的微生物检测方法,具有灵敏、快速、简便、稳定等优点,本文就其原理、特点及在食品卫生、医药中的应用进行了综述。

[Abstract] As a fast detecting method of microorganism, ATP bioluminescence has the advantages of sensitivity, high-speed, convenience and stability and so on. The article summarizes its principles, characteristics and application to food hygiene and medicine.
[Key words] ATP; Application; Bioluminescent theory
生物发光(bioluminescence)在希腊语中表示活着的意思,在拉丁语中表示发光、发亮。

目前生物发光,应用最广最主要的是荧光素-荧光素酶反应发出的荧光,荧光素酶存在于萤火虫、水母和一些细菌中,它是生物体内产生的一种生物反应蛋白质[1]。

三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,简称ATP)是高能磷酸化合物。

ATP由一分子腺嘌呤、一分子核糖和三个相连的磷酸基团构成的核苷酸,其结构式见图1。

图1 三磷酸腺苷的结构式
Fig.1 Adenosine triphosphate
ATP存在于所有的有机体中,极易被储存和利用,是活细胞新陈代谢能量的源泉,在化学反应中,主要是通过释放磷酸基团从而达到释放能量的目的。

1 ATP生物发光工作原理
1963年McElroy[2]最先用荧光素酶-ATP检测法,其化学反应的结果是把化学能转化为光能。

1983年Moyer等提出细胞内源性的ATP含量可以反应活细胞的数量和活性。

其化学反应如下:
ATP+D-Luciferin+O2→Oxyluciferin+AMP+PPi+O2+Light
当细胞受损或死亡时,其ATP值迅速下降或消失,基于这一原理,检测细胞内的ATP含量,即可反应其细胞的存活状况,ATP浓度与活细胞数密切相关,ATP生物发光检测步骤包括:取样、样品ATP的提取、添加荧光素-荧光素酶、测定生物发光值、计算出ATP的浓度和活菌数量。

检测时先将ATP与提取剂充分混合,使细胞壁和细胞膜裂解,释放ATP,再加入荧光素-荧光素酶,ATP在荧光素和荧光素酶的作用下,使其释放磷酸基团同时发出荧光,用生物荧光仪检测相对荧光强度(relative light units,RLU),由此测出ATP的含量,进而反映活细胞数。

这项技术高度敏感,只需50个细胞就能测出ATP 的量,而且,当ATP含量为105～1 012 mol/L时,
活细胞的对数值与ATP发光值的对数值之间存在良好的线性关系[3-5]。

2 ATP生物发光特点
2.1 ATP生物发光优点
灵敏、快速、简便、稳定是ATP生物发光的主要优势所在,同时可以把ATP 数量化,用荧光强度(RLU)把光定量,广泛应用于食品工业、医药、生物学等领域。

2.2 ATP生物发光法的不足
荧光强度(RLU)和菌落形成单位(CFU)之间没有直接关系,也无法对细菌的种属进行鉴定。

有的学者设想通过测定ATP/CFU的大小来预测样品中所含菌种类别,如果ATP/CFU较小,提示样品中可能主要含有形态较小的孢子或G-细菌,如果ATP/CFU较大,提示样品中主要含有形态较大的G+细菌或酵母菌[6]。

3 国内外应用研究
3.1在卫生学上的应用
主要是指利用ATP生物发光检测环境是否被有害的微生物污染、食品中卫生学的检测和生产环境实时监测(HACCP)等。

食品环境清洁度的检测多采用检测周期长、结果滞后的棉拭取样与平板培养法共用的方法来检测表面附着的微生物,不能满足HACCP管理系统的要求,而ATP生物发光法利用其快速、简便的优点,对食品生产环境的清洁度进行检测。

例如,采用ATP生物发光法检测食品生产线以及厨房、冰箱、食品操纵台、铁路站车食品器具等的清洁度。

许多研究表明,ATP 生物发光法与琼脂培养法相关性高、可行、有效[7-11]。

吴慧清等[12]研究用ATP 生物发光法检测肉品的新鲜度,得出此方法比盐基氨基氮更快速、简便,能反应肉类的保存状态和新鲜度。

此外,ATP生物发光法还可用于乳制品中乳酸菌的检测、啤酒中菌落总数的检测、调味品即脱水蔬菜的细菌学的测定,实验结果显示,此方法与传统的琼脂平板法具有高度的相关性[13-15]。

3.2 在医学中的应用
3.2.1 药物敏感性试验目前主要用于肿瘤化疗药物敏感性试验,以实现个体化治疗,评价药物的疗效。

如应用ATP生物发光法为卵巢癌患者进行药物选择和个体化治疗取得较好的效果[16-17],田海梅等[18]采用ATP生物发光法对卵巢癌组织标本进行体外药敏试验,敏感性为90.0%,特异性为91.7%,阳性预测值为9
4.7%,阴性预测值为84.6%,准确率为90.6%。

金宝翠等[19]用ATP生物发光法对急性白血病患者进行药敏试验,并且与MTT法进行比较,两种方法的药物抑制率的符合率为76.9%～84.6%,与临床疗效比较后表明,ATP生物发光法优于MTT法。

由此可见,ATP生物发光法体外药敏检测结果与临床治疗反应有很好的相关性,是
开展个体化化疗的一种重要的体外药物筛选方法。

本课题组应用该方法评价分枝杆菌对抗结核药物的敏感性,以指导临床治疗。

3.2.2 新药筛选及疗效评价由于ATP生物发光简单、快速、灵敏、等特点,被广泛应用于需要进行大量快速初选工作的新药筛选中,Arian[20]推出了专门用于筛选抗分枝杆菌药物(如抗结核药)的生物发光系统。

湛雪军等[21]用ATP生物发光法评价抗癌中药对肿瘤细胞增殖的抑制作用。

本课题组应用该方法筛选具有抗结核活性的小分子化合物。

另外,一些新药出现后,在进行临床试验之前,都必须进行多阶段的Ⅱ、Ⅲ期试验,为了节省时间和降低成本,可以用体外药敏试验对不同的肿瘤进行药物的疗效评价。

3.2.3 细胞免疫活性检测应用ATP生物发光法还可测定T细胞的免疫活性[22]。

王志才等[23]研究表明,用ATP生物发光法检测能正确评估肝移植后受者的细胞免疫功能,及时调整用药。

陈涛等[24]通过肝细胞ATP检测评估肝实质储备功能,以预测肝切除手术风险及选择肝移植手术时机。

3.2.4 细菌总数检测可以对尿样中的细菌总数进行测定,用作尿路感染的早期检测指标之一,与培养法比较,阳性预测值可达98%以上,临床随访发现与尿路感染有很好的相关性[25]。

4 结论
ATP生物发光法简单、快速、灵敏度高,被广泛应用于食品卫生、医药、生物学等领域。

本课题组将单管检测改进为微孔板检测,大大提高了检测效率。

随着科学技术的不断提高,ATP生物发光法将更加成熟,更广泛地应用于各个领域。

[参考文献]
[1]Hasting JW. Chemistries and colos of bioluminescent reaction: a review [J]. Gene,1996,(173):5-11.
[2]Mcelroy WD. Crystalline firely luciferase: LH2+ATPLH2-AMP+PPLH2-AMP+O2: L-AMP+light+H2O [J]. Methods in Enzymology,1963,(6):445-448.
[3]James DM, Hendrson F. Nucleoside triphosphate soecificityoffirelyluciferase [J]. Analytical Biochemistry,1983,19(1):194.
[4]Sevin BU, Peng ZL, Perras JP, et al. Application of an ATP bioluminescence assay in human tumor chemosensitivity testing [J]. Gynecol Oncol,1988,31(1):191-204.
[5]Sevin BU, Perras JP, Averette HE, et al. Chemosensitivity testing in ovarian cancer [J]. Cancer, 1993,71(4):1613-1620.
[6]Venkateswarana K, Hattori N, Laduc MT, et al. ATP as abiomarker of viablemicro organismsinclean-room facilities [J]. Journalof Microbiological Methods, 2003,(52):367-377.
[7]Venkateswarana K, Hattori N, Laduc MT, et al. Microbiabiomarker of viabiemicroorganisms in clean-roomfacilities [J]. Journal of Miccrobiological Methods,2003,(54):368-377.
[8]Becker B, Fechler J, Holzapfel WH. Hygiene and cleaning control in the food chain with the ATP bioluminescence method [J]. Fleischwirtschaft,2004,84(1):121-124.
[9]Aycicek H, Oguz U, Karci K. Comparison of results of ATP bioluminescence and traditional hygiene swabbing methods for the determination surface cleanliness at
a hospital kitchen [J]. Int Jhyg Envir Heal,2006,209(2):203-206.
[10]Chen FC, Godwin SL. Comparison of a rapid ATP bioluminescence assay and standard plate count methods for assessing microbialcontamination of consumers’ refrigerators [J]. Journal of Food Protection,2006, 69(10):2534-2538.
[11]曹利蓉,张伟,晁蕊.A TP生物发光法在铁路站车食品器具卫生学检验中的应用[J].铁道劳动安全卫生与环保,2004,31(2):86-87.
[12]吴慧清,吴清平,张菊梅,等.肉品新鲜度的ATP生物发光法检测研究[J].中国卫生检验杂志,2006,16(8):902-903.
[13]Anwrm, Yaqoob M, Waseem A, et al. Bioluminescent determination of adenosine 5’-triphosphate in blood and milk samples [J]. Journal of the Chemical Society of Pakistan,2006,28(4):380-384.
[14]冯敏,高岳,吕海燕.A TP发光技术检测辐照前脱水蔬菜和调味品的含菌量[J].核农学报,2005,19(4):282-285.
[15]Takahashi T, Nakakita Y, Wateri J, et al. A new rapid technique for detection of microorganisms using bioluminescence and fluorescence microscope method [J]. Journal of Bioscience and Bioengineering,2000,(89):509-513.
[16]Ng TY, Ngan HY, Cheng DK, et al. Clinical applicability of the ATP cell viability assay as a predictor of chemoresponse in platinum resistant epithelial ovarian cancer usign nonsurgical tumor cell samples [J]. Gynecol Oncol,2000,76(3):405-408.
[17]Breidenbach M, Rrin DT, Mallmann P, et al. Indibidualized long-term chemotherapy for recurrent ovarian cancer after failing high-dose treatment [J].
Anticancer Drugs,1998,9(1):51-57.
[18]田海梅,石晓燕,傅军,等.ATP抗肿瘤药物敏感性检测技术与卵巢癌临床治疗的相关性研究[J].中华肿瘤杂志,2005,27(5):296-298.
[19]金宝翠,赖启明,刘立华,急性白血病患者药物敏感性测定及临床意义[J].江苏医药,1996,22,(10):688.。