蚓粪对大蒜中蒜氨酸和大蒜素含量及大蒜精油抗菌活性的影响

蚓粪对大蒜中蒜氨酸和大蒜素含量及大蒜精油抗菌活性的影响
作者：叶嘉张浩郭海燕宁辉
来源：《中国瓜菜》2021年第10期
摘要：以大蒜为材料，测定不同处理下蒜氨酸和大蒜素含量并检测大蒜精油对金黄色葡萄球菌和沙门氏菌的抑制效果，为开发大蒜天然抑菌药物和高效防腐保鲜剂提供参考。

结果表明，施用蚓粪和化肥的大蒜蒜氨酸含量（w，后同）分别为44.05 mg·g-1 和33.86 mg·g-1，大蒜素含量分别为0.33 mg·g-1和0.13 mg·g-1，施用蚓粪的大蒜蒜氨酸和大蒜素含量均显著高于施用化肥处理;施用蚓粪的大蒜精油得率显著高于化肥处理;在1.25～40.0 mg·mL-1质量浓度内，2种施肥处理大蒜提取得到的精油对金黄色葡萄球菌和沙门氏菌的最小抑菌质量浓度均为2.5 mg·mL-1，并表现出一定的量效关系;同一浓度处理下，蚓粪处理的大蒜精油对金黄色葡萄球菌和沙门氏菌的抑制作用优于化肥处理。

关键词：大蒜;高压液相色谱法;蒜氨酸;大蒜素;大蒜精油;抑菌
中图分类号：S633.4 文献标志码：A 文章编号：1673-2871（2021）10-098-06
Effects of vermicompost on alliin and allicin contents and antibacterial activity of garlic oil in garlic
YE Jia1， 2， ZHANG Hao1， 2， GUO Haiyan1， 2， NING Hui1
（1. School of Life Science and Engineering， Handan College， Handan 056005， Hebei，China; 2. Wild Plant Resources Research Centre in Taihang Mountain of Southern Hebei， Handan 056005， Hebei， China）
Abstract： In order to provided reference data for the development of natural antibacterial drugs and high-efficiency preservatives， the contents of alliin， allicin and the inhibitory effect of garlic oil on Staphylococcus aureus and Salmonella typhimurium were detected. The results showed that the contents of alliin were 44.05 mg·g-1 and 33.86 mg·g-1， after treated by vermicompost and chemical fertilizer respectively， and allicin were 0.33 mg·g-1 and 0.13 mg·g-1， respectively. The contents of alliin and allicin treated with vermicompost were significantly higher than those of fertilizer treatment. The yield of garlic essential oil in vermicompost substrate was significantly higher than that in fertilizer substrate. The minimum inhibitory concentration of garlic oil contained in vermicompost and chemical fertilizer substrate to Staphylococcus aureus and Salmonella typhimurium was 2.5 mg·mL-1 in the range of 1.25-40.0 mg·mL-1， and it was showed a certain dose effect relationship. With the increase of garlic essential oil concentration， the diameter of bacteriostatic circle of Staphylococcus aureus and Salmonella typhimurium increased gradually. At the same concentration， the inhibition of garlic essential oil in vermicompost matrix on Staphylococcus aureus and Salmonella typhimurium was better than that in fertilizer matrix.
Key words： Garlic; HPLC; Allicin; Alliin; Garlic essential oils; Bacterial inhibition
隨着我国现代农业协同发展的不断加快，如何促进农业可持续化发展成为当前农业种植的关键问题。

而肥料施用则成为农业可持续发展过程中的重要组成部分。

蚯蚓粪是蚯蚓通过自身降解有机物的产物。

蚓粪可以有效改善土壤的结构，降低土壤的pH值，减小土壤碱化度，从而改善土壤生态环境[1]。

大量研究表明，施加蚓粪可以明显促进作物生长，提高果实品质[2-4]。

大蒜为百合科葱属植物蒜的鳞茎，具有广谱的抗、抑菌及消炎作用[5]。

蒜氨酸和大蒜素是大蒜中重要的生物活性物质。

研究表明蒜氨酸具有清除自由基、降血糖、抑菌、保肝等生物活性[6]，还能抑制食品中的霉菌，延长食品的防腐保鲜期[7]。

蒜氨酸在大蒜酶的催化下可生成大蒜素。

大蒜素具有明显的抑菌作用，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、伤寒杆菌等有明显的抑制作用，已普遍用于食品和医药方面[8]。

研究表明，同种大蒜在不同的产地、不同的栽培方式下所含生物活性物质也不同[9]。

Ghasemi等[10]研究了添加腐殖酸对大蒜生物活性物质的影响，发现施肥对大蒜的总体抗氧化活性具有显著的提升作用。

Montano等[11]人发现不同产地的大蒜体内活性物质含量差异显著，蒜氨酸和异蒜氨酸的含量主要受产地影响。

Patidar等[12]通过在基质中添加蚯蚓粪，发现添加蚯蚓粪后大蒜中挥发油含量和产量与对照相比有明显提高。

但目前针对不同肥料栽培的大蒜中活性物质的含量变化及抑菌活性的报道很少。

笔者采用溶剂提取和酶解法得到大蒜粗提物，利用高效液相色谱法对蚓粪处理大蒜与化肥处理大蒜的大蒜素、蒜氨酸含量的差异性进行比较，并检测大蒜提取物对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌活性的抑制效果，为开发大蒜天然抑菌药物和高效防腐保鲜剂提供参考数据。

1 材料与方法
1.1 材料
试验所用大蒜品种为河北永年大蒜，施用蚓粪的大蒜购于河北朗力农业科技有限公司，化肥处理大蒜购于河北省邯郸市永年县农户。

蚯蚓粪由半腐熟牛粪经蚯蚓消化所得，pH值7.14，有机质含量（w，后同）78.4%（以烘干基计），全氮含量9.86%（以烘干基计），全磷含量2.45%（以烘干基计）。

普通化肥处理：尿素（全氮45.6%）、过磷酸钙（全磷12.3%）。

蒜氨酸标准品购于上海安谱实验科技股份有限公司;大蒜素标准品购于合肥博美生物科技有限公司;金黄色葡萄球菌（CMCC （B） 26003）购于上海鲁威科技有限公司;鼠伤寒沙门氏菌（ATCC 14028）购于合肥博美生物科技有限公司。

主要儀器采用美国产高效液相色谱仪（waters e2695-2489）。

1.2 试验设计
试验于2019年3—6月在邯郸学院生命科学实验中心及邯郸市永年县广府镇种植区开展。

采用不同肥料对基质进行处理，蚓粪施入量与化肥中常规施肥氮含量一致，蚓粪和常规化肥均作为基肥使用。

株行距7 cm×14 cm，每个处理设置3个小区，小区面积5 m×5 m，取样时每个处理随机取3次。

1.3 方法
1.3.1 蒜氨酸和大蒜素的提取首先微波（功率：700 W）高火（T：100 ℃）灭酶蚓粪、化肥处理的大蒜1 min[13]。

准确称取施用蚓粪和化肥处理的大蒜各5 g，并放入研钵中捣碎，采用水作为提取剂，料液比1∶9，提取时间1 h，在12 000 r·min-1转速下离心10 min，取上清液，用0.22 μm微孔滤膜过滤，滤液即为待测液。

重复3次实验，每次实验再检测3次。

分别称量5 g蚓粪、化肥处理的大蒜，于研钵中捣碎，40 ℃水浴酶解1 h，采用85% 甲醇作为提取剂，物料比1∶4，35 ℃水浴提取1 h[14]，在12 000 r·min-1转速下离心10 min，取上清液，用0.45 μm微孔滤膜过滤，滤液即为待测液。

3次重复，每次试验再检测3次。

1.3.2 标准曲线的绘制和样品的检测取蒜氨酸标品20 mg，用超纯水定容到10 mL容量瓶内，配成2 mg·mL-1母液。

然后依次配成0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mg·mL-1标准溶液。

参考常军民等[15]的HPLC条件，波长：214 nm;流动相：甲醇∶水=30∶70;柱温：30 ℃;进样体积：20 μL;流速：0.8 mL·min-1。

以峰面积为纵坐标，蒜氨酸质量浓度（计为mg·g-1）为横坐标绘制标准曲线，并根据标准方程计算样品含量。

取大蒜素标品0.5 g，用 85% 甲醇定容到 250 mL容量瓶内，配成2 mg·mL-1母液。

然后依次配成0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mg·mL-1标准溶液。

参考谭志静[16]的高效液相的色谱条件，波长：214 nm;流动相：甲醇∶水=85∶15;柱温：30 ℃;进样体积：20 μL流速：0.8 mL·min-1。

以峰面积为纵坐标，大蒜素浓度（计为mg·g-1）为横坐标绘制标准曲线，并根据标准方程计算样品含量。

采用高效液相色谱仪（waters e2695-2489），色谱柱为Symmetry-C18（4.6 mm×250 mm，0.5 μm），将配置好的蒜氨酸和大蒜素标准品进样检测获得色谱图。

1.3.3 大蒜精油的制备分别称取500 g 不同肥料种植的大蒜，于研钵中捣碎，选用二氯甲烷为萃取剂，料液比1∶4，萃取时间3 h，得到的萃取液在旋转蒸发仪上蒸发浓缩，浓缩液在通风良好、无光的地方用0.45 μm的微孔滤膜中过滤，利用便携式气体检测仪检测二氯甲烷，待滤液中二氯甲烷挥发干净，得到大蒜精油纯品，密封保存，备用，重复6次并计算得率。

1.3.4 不同种植基质的大蒜精油的抑菌活性测定培养基采用牛肉膏蛋白胨培养基（NA），调pH至7.6，121 ℃灭菌30 min。

用灭菌的接种环将两种细菌接种到 NA 液体培养基中，恒温摇床培养48 h，进行活化。

活化后采用平板计数的方法计算原菌液的数量，冷藏、备用。

利用逐级稀释的方法将菌悬液浓度调整为106 CFU·mL-1，用滤纸片琼脂扩散法评价不同种植基质大蒜精油对不同菌株的抑菌影响。

首先用打孔器将滤纸打成直径为6 mm的圆形纸片，121 ℃灭菌 20 min后，60 ℃烘干。

取滤纸圆片，置于提取的大蒜精油稀释液中，大蒜精油用少量吐温-80助溶，用无菌水溶解。

稀释液设置为1.25、2.5、5.0、10.0、20.0、40.0 mg·mL-1 6个质量浓度，同时用无菌水作空白对照，4 mg·mL-1青霉素G钠组作阳性对照，3 mg·mL-1吐温-80作阴性对照，浸泡1 h，沥干。

吸取0.2 mL的菌液于培养基，并用经高压蒸汽灭菌的涂布器涂抹均匀。

用镊子取上述圆片，置于培养基表面，倒置平板放置培养箱
（37 ℃）中、培养24 h，取出测量抑菌圈直径。

试验设置3次重复，每次试验每个浓度下操作3次，测量每个抑菌圈两个垂直方向的直径，取平均值。

1.4 数据处理
利用 Excel 软件统计各参数的平均值和标准误差并作图，采用SPSS 18.0进行数据统计和单因素方差分析。

2 结果与分析
2.1 蒜氨酸和大蒜素标准曲线绘制
由图1可知，蒜氨酸标准曲线回归方程为y=1×107x + 5 165.2，R2 = 0.999 6，表明蒜氨酸在0～0.8 mg·g-1内，其浓度和峰面积呈现良好的线性关系。

笔者采用溶剂提取和酶解法得到大蒜粗提物，利用高效液相色谱法对蚓粪处理大蒜与化肥处理大蒜的大蒜素、蒜氨酸含量的差异性进行比较，并检测大蒜提取物对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌活性的抑制效果，为开发大蒜天然抑菌药物和高效防腐保鲜剂提供参考数据。

1 材料与方法
1.1 材料
试验所用大蒜品种为河北永年大蒜，施用蚓粪的大蒜购于河北朗力农业科技有限公司，化肥处理大蒜购于河北省邯郸市永年县农户。

蚯蚓粪由半腐熟牛粪经蚯蚓消化所得，pH值7.14，有機质含量（w，后同）78.4%（以烘干基计），全氮含量9.86%（以烘干基计），全磷含量2.45%（以烘干基计）。

普通化肥处理：尿素（全氮45.6%）、过磷酸钙（全磷12.3%）。

蒜氨酸标准品购于上海安谱实验科技股份有限公司;大蒜素标准品购于合肥博美生物科技有限公司;金黄色葡萄球菌（CMCC （B） 26003）购于上海鲁威科技有限公司;鼠伤寒沙门氏菌（ATCC 14028）购于合肥博美生物科技有限公司。

主要仪器采用美国产高效液相色谱仪（waters e2695-2489）。

1.2 试验设计
试验于2019年3—6月在邯郸学院生命科学实验中心及邯郸市永年县广府镇种植区开展。

采用不同肥料对基质进行处理，蚓粪施入量与化肥中常规施肥氮含量一致，蚓粪和常规化肥均作为基肥使用。

株行距7 cm×14 cm，每个处理设置3个小区，小区面积5 m×5 m，取样时每个处理随机取3次。

1.3 方法
1.3.1 蒜氨酸和大蒜素的提取首先微波（功率：700 W）高火（T：100 ℃）灭酶蚓粪、化肥处理的大蒜1 min[13]。

准确称取施用蚓粪和化肥处理的大蒜各5 g，并放入研钵中捣碎，采用水作为提取剂，料液比1∶9，提取时间1 h，在12 000 r·min-1转速下离心10 min，取上清液，用0.22 μm微孔滤膜过滤，滤液即为待测液。

重复3次实验，每次实验再检测3次。

分别称量5 g蚓粪、化肥处理的大蒜，于研钵中捣碎，40 ℃水浴酶解1 h，采用85% 甲醇作为提取剂，物料比1∶4，35 ℃水浴提取1 h[14]，在12 000 r·min-1转速下离心10 min，取上清液，用0.45 μm微孔滤膜过滤，滤液即为待测液。

3次重复，每次试验再检测3次。

1.3.2 标准曲线的绘制和样品的检测取蒜氨酸标品20 mg，用超纯水定容到10 mL容量瓶内，配成2 mg·mL-1母液。

然后依次配成0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mg·mL-1标准溶液。

参考常军民等[15]的HPLC条件，波长：214 nm;流动相：甲醇∶水=30∶70;柱温：30 ℃;进样体积：20 μL;流速：0.8 mL·min-1。

以峰面积为纵坐标，蒜氨酸质量浓度（计为mg·g-1）为横坐标绘制标准曲线，并根据标准方程计算样品含量。

取大蒜素标品0.5 g，用 85% 甲醇定容到 250 mL容量瓶内，配成2 mg·mL-1母液。

然后依次配成0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mg·mL-1标准溶液。

参考谭志静[16]的高效液相的色谱条件，波长：214 nm;流动相：甲醇∶水=85∶15;柱温：30 ℃;进样体积：20 μL流速：0.8 mL·min-1。

以峰面积为纵坐标，大蒜素浓度（计为mg·g-1）为横坐标绘制标准曲线，并根据标准方程计算样品含量。

采用高效液相色谱仪（waters e2695-2489），色谱柱为Symmetry-C18（4.6 mm×250 mm，0.5 μm），将配置好的蒜氨酸和大蒜素标准品进样检测获得色谱图。

1.3.3 大蒜精油的制备分别称取500 g 不同肥料种植的大蒜，于研钵中捣碎，选用二氯甲烷为萃取剂，料液比1∶4，萃取时间3 h，得到的萃取液在旋转蒸发仪上蒸发浓缩，浓缩液在通风良好、无光的地方用0.45 μm的微孔滤膜中过滤，利用便携式气体检测仪检测二氯甲烷，待滤液中二氯甲烷挥发干净，得到大蒜精油纯品，密封保存，备用，重复6次并计算得率。

1.3.4 不同种植基质的大蒜精油的抑菌活性测定培养基采用牛肉膏蛋白胨培养基（NA），调pH至7.6，121 ℃灭菌30 min。

用灭菌的接种环将两种细菌接种到 NA 液体培养基中，恒温摇床培养48 h，进行活化。

活化后采用平板计数的方法计算原菌液的数量，冷藏、备用。

利用逐级稀释的方法将菌悬液浓度调整为106 CFU·mL-1，用滤纸片琼脂扩散法评价不同种植基质大蒜精油对不同菌株的抑菌影响。

首先用打孔器将滤纸打成直径为6 mm的圆形纸片，121 ℃灭菌 20 min后，60 ℃烘干。

取滤纸圆片，置于提取的大蒜精油稀释液中，大蒜精油用少量吐温-80助溶，用无菌水溶解。

稀释液设置为1.25、2.5、5.0、10.0、20.0、40.0 mg·mL-1 6个质量浓度，同时用无菌水作空白对照，4 mg·mL-1青霉素G钠组作阳性对照，3 mg·mL-1吐温-80作阴性对照，浸泡1 h，沥干。

吸取0.2 mL的菌液于培养基，并用经高压蒸
汽灭菌的涂布器涂抹均匀。

用镊子取上述圆片，置于培养基表面，倒置平板放置培养箱
（37 ℃）中、培养24 h，取出测量抑菌圈直径。

试验设置3次重复，每次试验每个浓度下操作3次，测量每个抑菌圈两个垂直方向的直径，取平均值。

1.4 数据处理
利用 Excel 软件统计各参数的平均值和标准误差并作图，采用SPSS 18.0进行数据统计和单因素方差分析。

2 结果与分析
2.1 蒜氨酸和大蒜素标准曲线绘制
由图1可知，蒜氨酸标准曲线回归方程为y=1×107x + 5 165.2，R2 = 0.999 6，表明蒜氨酸在0～0.8 mg·g-1内，其浓度和峰面积呈现良好的线性关系。

笔者采用溶剂提取和酶解法得到大蒜粗提物，利用高效液相色谱法对蚓粪处理大蒜与化肥处理大蒜的大蒜素、蒜氨酸含量的差异性进行比较，并检测大蒜提取物对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌活性的抑制效果，为开发大蒜天然抑菌药物和高效防腐保鲜剂提供参考数据。

1 材料与方法
1.1 材料
试验所用大蒜品种为河北永年大蒜，施用蚓粪的大蒜购于河北朗力农业科技有限公司，化肥处理大蒜购于河北省邯郸市永年县农户。

蚯蚓粪由半腐熟牛粪经蚯蚓消化所得，pH值7.14，有机质含量（w，后同）78.4%（以烘干基计），全氮含量9.86%（以烘干基计），全磷含量2.45%（以烘干基计）。

普通化肥处理：尿素（全氮45.6%）、过磷酸钙（全磷12.3%）。

蒜氨酸标准品购于上海安谱实验科技股份有限公司;大蒜素标准品购于合肥博美生物科技有限公司;金黄色葡萄球菌（CMCC （B） 26003）购于上海鲁威科技有限公司;鼠伤寒沙门氏菌（ATCC 14028）购于合肥博美生物科技有限公司。

主要仪器采用美国产高效液相色谱仪（waters e2695-2489）。

1.2 试验设计
试验于2019年3—6月在邯郸学院生命科学实验中心及邯郸市永年县广府镇种植区开展。

采用不同肥料对基质进行处理，蚓粪施入量与化肥中常规施肥氮含量一致，蚓粪和常规化肥均作为基肥使用。

株行距7 cm×14 cm，每个处理设置3个小区，小区面积5 m×5 m，取样时每个处理随机取3次。

1.3 方法
1.3.1 蒜氨酸和大蒜素的提取首先微波（功率：700 W）高火（T：100 ℃）灭酶蚓粪、化肥处理的大蒜1 min[13]。

准确称取施用蚓粪和化肥处理的大蒜各5 g，并放入研钵中捣碎，采用水作为提取剂，料液比1∶9，提取时间1 h，在12 000 r·min-1转速下离心10 min，取上清液，用0.22 μm微孔滤膜过滤，滤液即为待测液。

重复3次实验，每次实验再检测3次。

分别称量5 g蚓粪、化肥处理的大蒜，于研钵中捣碎，40 ℃水浴酶解1 h，采用85% 甲醇作为提取剂，物料比1∶4，35 ℃水浴提取1 h[14]，在12 000 r·min-1转速下离心10 min，取上清液，用0.45 μm微孔滤膜过滤，滤液即为待测液。

3次重复，每次试验再检测3次。

1.3.2 标准曲线的绘制和样品的检测取蒜氨酸标品20 mg，用超纯水定容到10 mL容量瓶内，配成2 mg·mL-1母液。

然后依次配成0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mg·mL-1标准溶液。

参考常军民等[15]的HPLC条件，波长：214 nm;流动相：甲醇∶水=30∶70;柱温：30 ℃;进样体积：20 μL;流速：0.8 mL·min-1。

以峰面积为纵坐标，蒜氨酸质量浓度（计為mg·g-1）为横坐标绘制标准曲线，并根据标准方程计算样品含量。

取大蒜素标品0.5 g，用 85% 甲醇定容到 250 mL容量瓶内，配成2 mg·mL-1母液。

然后依次配成0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mg·mL-1标准溶液。

参考谭志静[16]的高效液相的色谱条件，波长：214 nm;流动相：甲醇∶水=85∶15;柱温：30 ℃;进样体积：20 μL流速：0.8 mL·min-1。

以峰面积为纵坐标，大蒜素浓度（计为mg·g-1）为横坐标绘制标准曲线，并根据标准方程计算样品含量。

采用高效液相色谱仪（waters e2695-2489），色谱柱为Symmetry-C18（4.6 mm×250 mm，0.5 μm），将配置好的蒜氨酸和大蒜素标准品进样检测获得色谱图。

1.3.3 大蒜精油的制备分别称取500 g 不同肥料种植的大蒜，于研钵中捣碎，选用二氯甲烷为萃取剂，料液比1∶4，萃取时间3 h，得到的萃取液在旋转蒸发仪上蒸发浓缩，浓缩液在通风良好、无光的地方用0.45 μm的微孔滤膜中过滤，利用便携式气体检测仪检测二氯甲烷，待滤液中二氯甲烷挥发干净，得到大蒜精油纯品，密封保存，备用，重复6次并计算得率。

1.3.4 不同种植基质的大蒜精油的抑菌活性测定培养基采用牛肉膏蛋白胨培养基（NA），调pH至7.6，121 ℃灭菌30 min。

用灭菌的接种环将两种细菌接种到 NA 液体培养基中，恒温摇床培养48 h，进行活化。

活化后采用平板计数的方法计算原菌液的数量，冷藏、备用。

利用逐级稀释的方法将菌悬液浓度调整为106 CFU·mL-1，用滤纸片琼脂扩散法评价不同种植基质大蒜精油对不同菌株的抑菌影响。

首先用打孔器将滤纸打成直径为6 mm的圆形纸片，121 ℃灭菌 20 min后，60 ℃烘干。

取滤纸圆片，置于提取的大蒜精油稀释液中，大蒜精油用少量吐温-80助溶，用无菌水溶解。

稀释液设置为1.25、2.5、5.0、10.0、20.0、40.0 mg·mL-1 6个质量浓度，同时用无菌水作空白对照，4 mg·mL-1青霉素G钠组作阳性对照，3 mg·mL-1吐温-80作阴性对照，浸泡1 h，沥干。

吸取0.2 mL的菌液于培养基，并用经高压蒸汽灭菌的涂布器涂抹均匀。

用镊子取上述圆片，置于培养基表面，倒置平板放置培养箱
（37 ℃）中、培养24 h，取出测量抑菌圈直径。

试验设置3次重复，每次试验每个浓度下操作3次，测量每个抑菌圈两个垂直方向的直径，取平均值。

1.4 数据处理
利用 Excel 软件统计各参数的平均值和标准误差并作图，采用SPSS 18.0进行数据统计和单因素方差分析。

2 结果与分析
2.1 蒜氨酸和大蒜素标准曲线绘制
由图1可知，蒜氨酸标准曲线回归方程为y=1×107x + 5 165.2，R2 = 0.999 6，表明蒜氨酸在0～0.8 mg·g-1内，其浓度和峰面积呈现良好的线性关系。