柱前衍生-高效液相色谱法测定甜蜜素的实验研究

柱前衍生-高效液相色谱法测定甜蜜素的
实验研究
作者：习娟
来源：《现代食品》 2018年第1期
摘要：目的：使检测方法与国际接轨。

方法：在流动相条件下，在波长为310 nm、柱温35 ℃、流量1.0 mL/min、进样量10 μL 的条件下，将标准样品溶液用不同衍生剂——亚硝酸、次氯酸钠，以2 mL 1 ∶ 1浓硫酸酸化加入5.0 mL 浓度为50% 衍生剂溶液衍生5 min，后用5 mL 正己烷、2 g 氯化钠进行萃取，取正己烷层加入10 mL 10% 碳酸氢钠溶液，用0.22 μm 的过滤器过滤上样，进行甜蜜素衍生物的测定。

结果：精密度、准确度、回收率均符合要求。

结论：该方法适用含乳饮料等食品中甜蜜素的测定。

关键词：高效液相色谱法；柱前衍生；甜蜜素
Abstract：Objective: To make the testing method in line with the international standards. Method:Under the condition of mobile phase, and 310 nm wavelength, column temperature of 35 ℃ , flow rate 1 mL/min, sample volume 10 μL, the
standard sample solution with different derivatizing agent -- nitrite, sodiumhypochlorite, 2 mL 1 ∶ 1 sulfuric acid acidification with 5 mL concentration of 50% derivative solution derived5 min, 5 mL after n-hexane, 2 g sodium chloride extraction from hexane layer with 10 mL 10% sodiumbicarbonate solution, with 0.22
μm filter sample, determination of cyclamate derivatives. Result: The accuracyof the accuracy of the recovery rate are met, so this method is suitable for milk beverages and other foodssodium cyclamate determination.
Key words：High performance liquid chromatography; Pre-column derivatization; Cyclamate中图分类号：TS207
关于甜蜜素的检测方法，国内标准检验方法有气相色谱法、比色法和薄层层析法[1-2]。

但这些方法最低检测限均高于欧盟和日本的标准，导致这样一种现象出现，即某些产品在国内未
检测出甜蜜素，而在国外会被检测出来，这就要求我国的检测技术必须与国际接轨。

笔者查阅
大量国内外资料发现，柱前衍生- 高效液相色谱法是测定甜蜜素较好的方法[3]，本文通过实验研究证实其应用价值。

1 材料及方法
1.1 实验材料
含有甜蜜素的碳酸饮料、果汁饮料、蔬菜汁、乳饮料、植物蛋白饮料，来源于市场。

1.2 试验方法
本试验方法是将甜蜜素标准品经过衍生化反应后，用液相色谱检测甜蜜素。

1.3 标准曲线
1.3.1 标准储备液的配制
称取甜蜜素0.100 0 g，用超纯水溶解并转移至100 mL 容量瓶中定容，制成浓度为1
mg/mL 的标准储备液待用。

1.3.2 标准溶液的配制
将已配制好的1 mg/mL 的标准储备液，吸取0、1、2、4、5 mL 分别移入500 mL 容量瓶中以超纯水定容，制成标准品浓度为0、2.0、4.0、8.0、10.0 mg/L。

1.3.3 标准曲线的绘制
将已经配制好的标准溶液在已优化好的条件下衍生，以优化好的液相条件进行HPLC 的测定，用标准曲线确定峰面积S 与溶液浓度c 的关系，计算线性回归方程和相关系数。

1.4 方法精密度的测定
将0.40 mg/mL 浓度标样通过衍生化条件处理，先后进样6 针进行精密度的分析。

1.5 最低检出限的测定
将0.40 mg/mL 浓度的标样分别稀释10、100、1 000、10 000 倍（浓度分别为0.040、0.004 0、0.000 4、0.000 040 mg/mL）后，测定信号值，采用3 倍信噪比计算检出限。

1.6 回收率和精密度测定
将碳酸饮料和含乳饮料中分别添加4.0 mg/mL 浓度的标样在已优化好的衍生条件和液相条件下进行测定样品的回收率测定。

在已优化好的衍生条件和液相条件下，将碳酸饮料和含乳饮料分别重复测定11 次，确定测定样品的平均值和标准偏差，以此来确定精密度。

1.7 干扰试验
为排除其他添加剂对方法的影响，在含有甜蜜素的标准溶液中加入安赛蜜、糖精钠、山梨酸、苯甲酸、亚硫酸钠后，用同样的衍生方法以及液相条件检测，确定此方法的抗干扰性[4]。

1.8 稳定性试验
将衍生物在室温、4 ℃条件下，放置4、8、12、24、48 h，在已优化好的液相条件下进行测定，确定衍生物的稳定性。

2 结果与分析
2.1 标准曲线及方法精密度的结果在已优化好的条件下进行不同浓度标准曲线的绘制，得到的浓度- 峰面积曲线如图1 所示。

由图2
可以看出，不同浓度的吸收峰重叠性很好，几乎完全重合。

同时，吸收峰的保留时间均是在合理范围内，保留时间依次是6.523、6.536、6.516、6.535、6.522 min。

此衍生物的线性
方程为y=10 195x+9 548.6，相关性为0.999 8，由此可见线性相关很好，甜蜜素的最低检出限为40 ng/mL。

加入0.4 mg/mL 的标准溶液衍生化后进行方法精密度的测定，进样6 针，精密度好，标准偏差小于0.001，见表1。

2.2 干扰实验结果
在上述已优化好的条件下，通过将标准物质中添加安赛蜜、糖精钠、山梨酸、苯甲酸、亚
硫酸钠后进行衍生，测定添加物质对标准物质的干扰试验。

结果表明苯甲酸、山梨酸、糖精钠、安赛蜜在所选色谱条件下不出峰，而亚硫酸钠出峰时间在甜蜜素的后面，不干扰测定。

2.3 回收率及精密度结果
在上述已优化好的条件下，向样品中添加0.4 mg/mL的标准溶液进行衍生化反应，过滤，进行液相回收率的测定，结果见表2，
回收率均大于95%，回收率相对较高，所以此曲线适用于饮料的甜蜜素含量测定实验。

将碳酸饮料和含乳饮料的样品进样11 次测定精密度，结果见表3，
用高效液相色谱测定饮料中的甜蜜素精密度很高，达到99% 以上。

2.4 样品中甜蜜素的测定结果由表4
可以看出，碳酸饮料中的甜蜜素含量最高，果汁饮料其次，含乳饮料的含量最少并且未检出样品居多；图3
为测定的果汁饮料5# 的甜蜜素谱图。

所以，就现代人们对于饮食健康安全的需求而言，
可以选择含乳饮料替代其他饮品。

3 结论
（1）本试验色谱最优化条件为：乙腈与水的比例为75 ∶ 25，添加0.02 mol/L 乙酸铵缓冲系作为流动相，在波长314 nm 处、柱温33 ℃、流量1.0 mL/ min、进样量10 μL 的条件下，对甜蜜素标准品的衍生物进行测定效果最佳，精密度和回收率较高，且没有其他同类样品
的干扰。

（2）本试验对样品前处理最优化条件为：将样品溶液用亚铁氰化钾- 乙酸铅等比例混合作为沉淀剂，离心取上清液10 mL，加入2mL 1 ∶ 1 浓硫酸酸化后加5.0 mL 浓度为50% 的次氯酸钠溶液衍生5 min，之后用5 mL 正己烷、2 g 氯化钠进行萃取，取正己烷层加入10mL 10%
碳酸氢钠溶液，用0.22 μm 的过滤膜过滤上样，进行甜蜜素衍生物的测定。

这种前处理方法
消除了食品相关成分即食品基质对衍生过程和检测过程的干扰。

（3）本试验对市售饮料甜蜜素含量进行测定，测定结果为在饮料类别中含乳饮料的甜蜜素含量最低，未检出样品个数最多，但所有样品均符合国家标准的限值，均属于安全食品。

（4）本试验所采用方法比起国家标准所采用方法成本相对较低、操作简单、检测效率高且适用于基层实验室的日常检测分析，其准确度和精密度也优于国标方法，并且比国家标准方法
更适用于蛋白含量高的产品中甜蜜素的测定。

参考文献：
[1] 张秀尧. 反相高效液相色谱法测定食品中甜蜜素[J]. 理化检验- 化学分册，2000，36（10）：451-452.
[2] 刘艳和，马公强. 高效液相色谱法测定食品中甜蜜素[J]. 中国公共卫生，1998，14（3）：169.
[3] 刘鹏春，祁广建. 环境与健康杂志[J]. 食品卫生理化检验，1996（8）：31.
[4] 李智红，尹艳春. 反相离子对高效液相色谱法快速分离和定量测定食品中的甜蜜素[J]. 色谱，1999（3）：278-279.。