QIAGEN--miScript PCR系统中文说明书(初次翻译,如有错误,敬请包涵)

miScript PCR 系统操作手册试剂盒成分：
miScript Reverse Transcription Kit
miScript Primer Assays
miScript SYBR® Green PCR Kit
10x miScript Primer Assay 和10x miScript Precursor Assay是干粉状的，需要稀释。

首先短暂离心小管，然后加入550μl TE，pH 8.0，最后在漩涡震荡仪上4-6次。

为了保持引物的活性，在冷冻条件下将稀释的引物分装成小管。

实验步骤：反转录反应
1、在冰上融化RNA，室温下(15–25ºC)融化5x miScript RT Buffer 和
RNasefree water 。

先轻弹每个小管使其充分混匀，然后短暂离心以收集管壁和管盖上的液体，最后放置在冰上。

2、在冰上配制reverse-transcription master mix。

配好后混合并放置在冰上。

如果miScript Reverse Transcriptase Mix是从-20°C 冰箱拿出来的话，那么在使用完毕后立刻放入冰箱。

如果要配制多次反应，先在一个大管中准备Mix，并且多配制10%。

3、将miScript Reverse Transcriptase Mix分装到每个小管中，然后
加入RNA。

4、在37°C下孵育60分钟
5、在95°C下孵育5分钟以灭活miScript Reverse Transcriptase
Mix
6、如果马上进行PCR，讲产物放置在冰上；如果不立刻做PCR，那么
将反转录产物放置在-20°C
实验步骤：Real-Time PCR检测miRNA或Noncoding RNA
1、融化2x QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix，10x miScript
Universal Primer, 10x miScript Primer Assay, template cDNA, 和RNase-free water。

用前分别混匀各试剂。

2、按下表准备反应mix。

因为PCR反应是热启动反应，所以在配制mix时不须放置在冰上。

cDNA的添加量不要超过PCR反应体系的10%。

3、加入模板cDNA到每个小管中
如果同时检测miRNA和miRNA前体，miRNA的cDNA加入量就要和检测前体时的加入量相同（10-20ng）。

4、充分混合好反应mix然后分装到有cDNA的小管中。

5、短暂离心
6、按一下程序进行PCR反应
在每次PCR反应中都要实施融解曲线，以确定反应的特异性和一致性。

miRNA-specific PCR 产物的Tm值大概为74–77°C。

合成的单链miRNA可以用来作为内部的阳性对照。

和miRNA同时进行融解曲线分析。

也可以进行cDNA合成后再进行标准曲线构建以确定miRNA的拷贝数。

实验步骤：Real-Time PCR for Detection of Precursor miRNA RNA纯化步骤必须包含基因组DNA去除步骤。

并且要求有“no RT”control。

1、融化2x QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix,10x miScript
Precursor Assay, template cDNA, 和RNase-free water。

并分别混匀。

2、按下表配制反应mix。

c DNA的加入量不要超过反转录反应体系的10%。

3、分装模板cDNA（10-20ng/reaction）到每个小管中。

4、充分混匀反应mix后分装到每个小管。

5、短暂离心
6、按下列程序进行PCR反应
基因组DNA（1ng/reaction）可以用作阳性对照。

讲基因组DNA和miRNA前体同时扩增，并比较融解曲线可以确定融解曲线的重复性。

附录：Protocol for Use of Synthetic miRNA as Positive Control in miRNA Detection
1、按下表准备一个20μl体积的反转录反应，使用5μl的合成miRNA
（终浓度1010copies/μl）和50ng细菌载体RNA。

2、在37°C孵育60分钟
3、在95°C孵育5分钟后转至冰上
4、加入480μl细菌载体RNA（终浓度1ng/μl），用移液器轻轻上下吹
打混匀并短暂离心。

这时稀释的产物浓度为108copies cDNA/μl
5、用第一步产生的cDNA和载体RNA（1ng/μl）做一下的梯度稀释
6、使用2-6管中的产物2μ来制作标准曲线。

运输和储存
miScript Reverse Transcription Kit 和 miScript SYBR Green PCR Kit 是干冰运输的。

两个试剂盒包括所有的试剂和缓冲剂都应该立刻放入-20度冰箱。

miScript Primer Assays 和 miScript Precursor Assays 是干粉状室温运输的。

储存时无论是干粉状还是稀释后也应该在-20度。

避免反复冻融。

如果正确处理，其可以保持18个月的优秀性能。

稀释10x miScript Primer Assay 或 10x miScript Precursor Assay时，先短暂离心，再添加550μlTE，Ph 8.0*，最后用漩涡震荡仪震荡4-6次。

这样可以得到100次50μl的引物。

我们要求对引物进行分装后再冻存，避免反复的冻融引物。

*具体请参见“用户提供的仪器和试剂”
介绍
miScript PCR System 是一个由三个部分组成的系统，它包含了miScript Reverse Transcription Kit, miScript SYBR Green PCR Kit, 和miScript Primer Assay。

这个系统能够敏锐的，特异的定量miRNA。

最重要的是确保用于miScript PCR System的RNA包含有miRNA。

QIAGEN提
供一系列的方案从总RNA中纯化长度在18以上的核苷酸。

我们推荐miRNeasy Mini Kit 或miRNeasy 96 Kit来纯化各种动物/人的组织和细胞中的RNA，或miRNeasy FFPE Kit来纯化FFPE中的组织切片中的RNA。

我们推荐在用于miScript PCR System之前，先对RNA进行柱上DNase消化步骤。

另外，miRNeasy Protect Animal Blood Kit能够从大鼠，小鼠和其他
小动物的血液中纯化RNA于RNAprotect Animal Blood Tube中。

PAXgene®miRNA Kits能够从固定在PAXgene Tissue Containers中的动物/人组织或PAXgene Blood RNA Tubes中人的血液组织中纯化miRNA和总RNA。

miScript Reverse Transcription Kit能有效的一步将miRNA,mRNA和其它非编码RNA转录成cDNA。

miScript Primer Assay和miScript SYBR Green PCR Kit一起运用可以通过SYBR Green实时定量miRNA。

（表一）相对于其他的系统，用miScript Reverse Transcription Kit生成cDNA
能用以检测多重miRNA。

一个cDNA可用于不同的miScript Primer Assays检测上百种miRNA，并进行综合性的表达谱分析。

miScript Reverse Transcription Kit也可用于miRNA前体，其它非编码RNA，和细胞mRNA。

通过合适的引物也可以用实时PCR检测它们。

（例如：miScript Precursor Assays用于前体检测，QuantiTect Primer Assays用于
mRNA检测）。

表一：miRNA,mRNA ,和其它小RNA检测
原理和步骤
反转录步骤
miScript Reverse Transcription Kit包括miScript Reverse Transcript ase Mix 和miScript RT Buffer。

miScript Reverse Transcriptase Mix是一种优化好的酶混合物，包含poly(A)聚合酶和反转录酶。

miScript RT Buffer 是专门为miScript Reverse Transcriptase Mix设计的。

此Buffer系统能最大化的激活两种酶。

miScript RT Buffer也包含Mg2+, dNTPs, oligo-dT primers, 和random primers。

不同于mRNA，miRNA没有多腺苷酸尾巴。

在反转录步骤中，miRNA会被加上
poly(A)尾巴。

反转录酶通过oligo-dT 和random primers转化RNA（包括miRNA前体，成熟miRNA，其它非编码小RNA和mRNA）成cDNA。

多腺苷酸化和反转录是在同一管中进行。

oligo-dT引物有一个universal tag sequence在5’端。

这个universal tag可用于实时PCR扩增。

（表二）
表二miScript principle。

miRNA和其它非编码RNA被poly(A) polymerase多腺苷酸化，
然后被oligo dT和反转录酶转化为cDNA。

mRNA被oligo-dT ,random primer和反转录酶反转录成cDNA。

cDNA被用于成熟miRNA的实时PCR定量检测（用miScript Primer Assay 和the miScript Universal Primer），miRNA前体（用miScript Precursor Assay），非编码RNA（用特异性miScript Primer Assay 和miScript Universal Primer），或mRNA（用QuantiTect Primer Assay）。

实时PCR步骤
一个样品制备的cDNA可以用于成熟和前体miRNA，mRNA和其它小RNA的多重实时PCR 定量检测。

成熟miRNA的检测，以cDNA为模板，用miRNA-specific miScript Primer Assay 和miScript SYBR Green PCR Kit进行。

用miScript Universal Primer （miScript SYBR Green PCR Kit中）来扩增miRNA，universal tag sequence
和miScript Primer Assay都是特异性的。

前体miRNA检测，以cDNA为模板，用miScript Precursor Assay和miScript SYBR Green PCR Kit进行。

用miScript Precursor Assay：包含前后引物，它们都与前体miRNA的茎环序列结合。

miScript Universa Primer为被使用。

miScript Precursor Assay结合的茎环序列在两种前体miRNA（pri-miRNA 和pre-miRNA）中都存在，所以miScript Precursor Assays同时对两种前体进行了定量。

mRNA检测，以cDNA为模板，用QuantiTect Primer Assay和miScript SYBR Green PCR Kit进行。

QuantiTect Primer Assay：包含前后引物。

miScript Universal Primer没有被使用。

参考基因，如GAPDH，miRNA的潜在目标mRNA，或其它mRNA可以被定量。

其它非编码小RNA检测，以cDNA为模板,用small-RNA–specific miScript Primer Assay和miScript SYBR Green PCR Kit进行实时PCR分析。

小RNA 用miScript Universal Primer（miScript SYBR Green PCR Kit中）扩增。

universal tag sequence和miScript Primer Assay是特异性的。

如果没有可使用的，miScript Primer Assays可以为感兴趣的小RNA传统设计。

(/miDesign)
用户提供的仪器和试剂
用化学试剂来工作，穿着合适的实验服，一次性的手套和防护眼镜。

更多信息，查阅合适的MSDSs，可向供应商购买。

稀释10x miScript Primer Assay或10x miScript Precursor Assay
TE,pH8.0 包含10 mM Tris·Cl和1 mM EDTA。

100ml的TE：
1 ml of 1 M Tris·Cl, pH 8.0 (autoclaved)
0.2 ml of 0.5 M EDTA, pH 8.0 (autoclaved)
98.8 ml of distilled water
稀释10x miScript Primer Assay或10x miScript Precursor Assay，短暂离心，加入550μlTE,pH8.0，漩涡震荡4-6次。

我们要求稀释后立刻分装。

反转录
塑料管（20μl反应体系）
冰
阻热块或水浴锅（可加热至95度）
漩涡振荡器
微型离心机
实时定量PCR
参考RNA阵列引物设计(访问/GeneGlobe 选择和定制感兴趣的基因引物)
重点
标准化control
为了精确和可重复的miRNA实时定量PCR结果，有必要用合适的内生性参照RNA对目的miRNA进行标准化。

此方法以相对定量而著称。

标准化可以校
正不利于准确定量的因素。

这些因素包括加入的RNA变异，RNA降解或RNA 抑制剂，和样品处理方式不同。

标准化后也可以对不同实验和样品的结果直接进行比较。

miScript PCR Controls是可以用miScript PCR System对miRNA进行实时PCR定量研究的引物。

它是snoRNAs and snRNAs，在设计时已经考虑了人，小鼠，大鼠中的序列同源性，这样它们就可以直接用于这三种物种。

所有的control的扩增效率将近100%。

更多信息和数据请访问
/miRNAControls
实验步骤：反转录反应
实验前重点
此方法优化了使用量为10pg至1μg的RNA。

如果使用量>1μgRNA，相应扩大反应体系。

此方法RNA最低使用量为10pg，可提供多于10pg的cDNA给后续的实时PCR反应。

但具体的用量参见miRNA和非编码RNA,前体miRNA或mRNA。

所有反应液的配制都应在冰上进行，是RNA的降解最小化。

可选：可添加RNase inhibitor
RT primers and dNTPs已经包含在试剂盒中，无需另外添加。

在反转录反应前无需单独的变性和热处理步骤。

反转录完成后，需要在95度孵育5分钟以灭火反转录酶。

如果第一次使用RNA，请阅读附件B
步骤
1、在冰上融化RNA，室温下(15–25ºC)融化5x miScript RT Buffer 和
RNasefree water 。

先轻弹每个小管使其充分混匀，然后短暂离心以收集管壁和管盖上的液体，最后放置在冰上。

重点：miScript Reverse Transcription Kit使用的总RNA必须包含后miRNA。

我们要求使用miRNeasy Kits。

要求在使用miRNeasy Kits纯化RNA时进
行柱上DNase消化。

这样可以去除任何微量的基因组DNA对结果的影响，特别是对于含量很低的前体miRNA的定量。

另外，PAXgene miRNA Kits可以从固定在PAXgene Tissue Containers中的组织或PAXgene Blood RNA Tubes中的血液中纯化miRNA和总RNA。

2、在冰上配制reverse-transcription master mix。

配好后混合并放置在冰上。

reverse-transcription master mix包含了第一
链cDNA合成的所有成分，除了模板RNA。

注意：miScript Reverse Transcriptase Mix是从-20°C冰箱拿出来的话，那么在
使用完毕后立刻放入冰箱。

注意：如果要配制多次反应，先在一个大管中准备Mix，并且多配制10%。

注意：此方法适用于10pg至1μgRNA。

如果>1μgRNA，相应扩大反应体系。

例如，如
果使用2μgRNA，配制2倍的反应体系，40μl
3、将miScript Reverse Transcriptase Mix分装到每个小管中，然后
加入RNA。

4、在37°C下孵育60分钟
5、在95°C下孵育5分钟以灭活miScript Reverse Transcriptase
Mix
6、如果马上进行PCR，将产物放置在冰上；如果不立刻做PCR，那么
将反转录产物放置在-20°C冰箱。

注意：成熟miRNA和前体miRNA要求不同量的cDNA模板。

实验步骤：Real-Time PCR检测miRNA或Noncoding RNA
开始前的重点
PCR必须从95度孵育15分钟开始，以激活HotStarTaq DNA Polymerase (包含在 2x QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix)。

每次运行的分析都要重新校正极限值。

当使用ABI PRISM®7000，强烈要求使用光学粘合盖以密封PCR板。

不要使最终反应体积小
于25μl。

开始前准备的物品
如果第一次使用miScript Primer Assay，先遵照“运输和储存”中的说明稀释。

（miScript Universal Primer已经是10x solution了，不用再稀释）
检测多重miRNA，非编码RNA,前体miRNA和mRNA，有必要将cDNA用RNase-free water 或 TE, pH 8.0稀释。

1、融化2x QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix，10x miScript
Universal Primer, 10x miScript Primer Assay, template cDNA, 和RNase-free water。

用前分别混匀各试剂。

2、按下表准备反应mix。

Reaction mix包含了模板cDNA以外的所有成分。

因为PCR反应是热启动反应，所以在配制体系和编辑实时定量仪程序时不须讲样品放置在冰上。

重点：cDNA的添加量不要超过PCR反应体系的10%。

有必要对cDNA进行稀释，以确保每个反应中的终浓度为1–3 ng，而且体积≤10%。

注意：无需优化Mg2+终浓度。

2x QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix中2.5mM Mg2+终浓度试已经优化好了的。

3、加入模板cDNA到每个小管中
注意：1-3 ng的cDNA模板通常可以做出成功的实时PCR。

如果需要可以稀释cDNA。

因为高浓度的模板cDNA会导致非特异性PCR产物，是结果难以解释。

然而，根据miRNA 的含量，也可以增加cDNA的量以优化结果。

另外，加入量也由实验的优化决定。

注意：如果平行检测miRNA和miRNA前体，miRNA的cDNA加入量就要和检测前体时的加入量相同（10-20ng），以便直接比较实验结果。

4、充分混合好反应mix然后分装到有cDNA的小管中。

5、短暂离心
6、按一下程序进行PCR反应
7、PCR反应。

如果使用Applied Biosystems 7500，要求调节默认的“Manual CT”极限值0.2到更低的值（如，0.02）以适合数据分析。

注意：在每次PCR反应中都要实施融解曲线，以确定反应的特异性和一致性。

注意：miRNA-specific PCR 产物的Tm值大概为74–77°C。

但它会因循环数的不同
而不同。

PCR产物的Tm值也跟buffer，盐离子浓度有关。

用QuantiTect SYBR Green PCR reagents获得的Tm值会不同于其它试剂。

注意：合成的单链miRNA可以用来作为内部的阳性对照。

和miRNA同时进行融解曲线
分析。

也可以进行cDNA合成后再进行标准曲线构建以确定miRNA的拷贝数。

实验步骤：Real-Time PCR for Detection of Precursor miRNA
miScript Reverse Transcription Kit合成的cDNA也可以用于检测前体miRNA。

此步骤可使用miScript Precursor Assays 和 the miScript SYBR Green PCR Kit有效的检测前体miRNA。

使用前的重点
PCR必须从95度孵育15分钟开始，以激活HotStarTaq DNA Polymerase (包含在 2x QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix)。

此步骤用miScript Precursor Assay来检测前体miRNA。

miScript Precursor Assay包含了miRNA前体特异性前后引物。

不要使用miScript Universal Primer。

检测前体miRNA，重点要避免有基因组DNA包含在RNA样品中。

通常前体miRNA的含量很少，任何基因组DNA在样品中都会在PCR中被扩增，导致不可信的结果。

RNA纯化步骤应该包括基
因组DNA处理，以去除任何微量的基因组DNA。

（如，miRNeasy Kits进行柱上DNase消化）另外，“no RT” control也应该被包括。

它是未添加miScript Reverse Transcriptase Mix
的反转录产物。

每次反应都要校正极限值。

当使用ABI PRISM®7000，强烈要求使用光学粘合盖以密封PCR板。

不要使最终反应体积小
于25μl。

开始前准备的物品
如果第一次使用miScript Primer Assay，先遵照“运输和储存”中的说明稀释。

（miScript Universal Primer已经是10x solution了，不用再稀释）
检测多重miRNA，非编码RNA,前体miRNA和mRNA，有必要将cDNA用RNase-free water 或 TE, pH 8.0稀释。

1、融化2x QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix,10x miScript Precursor Assay, template cDNA, 和RNase-free water。

并分别混匀。

2、按下表配制反应mix。

Reaction mix包含了模板cDNA以外的所有成分。

因为PCR反应是热启动反应，所以在
配制体系和编辑实时定量仪程序时不须讲样品放置在冰上。

重点：cDNA的添加量不要超过PCR反应体系的10%。

有必要对cDNA进行稀释，以确保
每个反应中的终浓度为1–3 ng，而且体积≤10%。

注意：无需优化Mg2+终浓度。

2x QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix中2.5mM Mg2+
终浓度试已经优化好了的。

注意：如果配制的总体积不是50 μl 或20 μl，调整反应混合物的体积至终浓度为
1X，但是保持cDNA终浓度为10–20 ng/reaction。

注意：如果平行检测miRNA和miRNA前体，miRNA的cDNA加入量就要和检测前体时的加
入量相同（10-20ng），以便直接比较实验结果。

3、分装模板cDNA（10-20ng/reaction）到每个小管中。

4、充分混匀反应mix后分装到每个小管。

5、短暂离心
6、按下列程序进行PCR反应
数据采集应该在延伸时进行。

7、PCR
如果使用Applied Biosystems 7500，要求调节默认的“Manual CT”极限值0.2到更低的值（如，0.02）以适合数据分析。

注意：在每次PCR反应中都要实施融解曲线，以确定反应的特异性和一致性。

注意：基因组DNA (1 ng/reaction)可用来作为阳性对照。

平行扩增基因组DNA和前体miRNA并比较两者的融解曲线，可确认融解曲线的重复性。

注意：前体miRNA和成熟miRNA可以用同一cDNA在同一次PCR中平行定量。

实验步骤：mRNA的实时PCR检测
miScript Reverse Transcription Kit合成的cDNA也可以用于检测任何mRNA。

此步骤可使用QuantiTect Primer Assays 和 the miScript SYBR Green PCR Kit有效的检测mRNA。

更多细节信息请参考QuantiTect Primer Assay Handbook (/HB/PrimerAssay)。

使用前的重点
PCR必须从95度孵育15分钟开始，以激活HotStarTaq DNA Polymerase (包含在 2x
QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix)。

此步骤用基因特异性前后引物（QuantiTect Primer Assay）来检测mRNA。

不要使用miScript
Universal Primer。

每次反应都要校正极限值。

当使用ABI PRISM®7000，强烈要求使用光学粘合盖以密封PCR板。

不要使最终反应体积小
于25μl。

开始前准备的物品
如果第一次使用QuantiTect Primer Assay，先遵照QuantiTect Primer Assay Handbook 中的说明稀释。

检测多重miRNA，非编码RNA,前体miRNA和mRNA，有必要将cDNA用RNase-free water 或 TE, pH 8.0稀释。

1、融化2x QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix，10x
QuantiTect Primer Assay, template cDNA, 和RNase-free
water.用前分别混匀各试剂。

2、按下表准备反应mix。

Reaction mix包含了模板cDNA以外的所有成分。

因为PCR反应是热启动反应，所以在配制体系和编辑实时定量仪程序时不须讲样品放置在冰上。

重点：cDNA的添加量不要超过PCR反应体系的10%。

有必要对cDNA进行稀释，以确保
每个反应中的终浓度为1–3 ng，而且体积≤10%。

注意：无需优化Mg2+终浓度。

2x QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix中2.5mM Mg2+终浓度试已经优化好了的。

3、加入模板cDNA (10–20 ng/reaction)到每个小管中
4、充分混合好反应mix然后分装到有cDNA的小管中。

5、短暂离心
6、按一下程序进行PCR反应
数据采集应该在延伸的时候进行
7、PCR反应。

如果使用Applied Biosystems 7500，要求调节默认的“Manual CT”极限值0.2到更低的值（如，0.02）以适合数据分析。

注意：在每次PCR反应中都要实施融解曲线，以确定反应的特异性和一致性。

注意：PCR 产物的Tm值跟buffer，盐离子浓度有关。

用QuantiTect SYBR Green PCR reagents获得的Tm值会不同于其它试剂。

注意：避免在RNA样品中有DNA污染。

根据RNA纯化的组织不同，“no RT” control也可能会有荧光信号。

当使用QuantiTect Primer Assays，有基因组DNA污染，假基因总是跟基因转录序列一样，确实内含子的基因也会在PCR循环后期产生信号。

当RNA从脾脏或胸腺纯化而来，又没有进行DNase I 消化，大量的基因组DNA污染存在。

为了避免这样的问题发生，在使用miRNeasy Mini Kit或miRNeasy 96 Kit纯化RNA时，强烈要求进行DNase消化（如，使用QIAGEN RNase-Free DNase Set, cat. no. 79254）
问题检测指南
更多内容访问技术支持中心的常见问题解答：
/FAQ/FAQList.aspx。

评论与建议
没有产物或产物信号推迟（问题发生在反转录反应）
a)移液错误或某个试剂忘加
检查每步使用的移液器。

每个试剂溶解后充分混匀，再次反转录。

b)反转录试剂配制错误
确定反转录在冰上配制
c)质量不好或反转录时模板RNA加入量不正确
在开始反转录前检查模板RNA的纯度，浓度和完整性。

模板RNA融解后充分混匀。

甚至微
量的RNase都能影响cDNA的合成和RT-PCR的灵敏度，特别是含量较少的RNA。

d)RNA浓度太高或太低
miScript Reverse Transcriptase Mix需要10 pg 至1 μg RNA。

如果>1μgRNA，按比例扩大反应体系。

不要使用RNA的量低于10pg。

e)RNA变性
模板RNA不需要变性。

如果变性，RNA的完整性会被影响。

f)孵育温度太高
反转录反应在37度进行。

高于此温度会减少cDNA产物的长度或miScript Reverse Transcriptase Mix的活性。

检查加热仪器的温度。

没有产物，或信号推迟，或只有引物二聚体被检测到（问题出现在实时PCR）a) 反转录产物添加量太高
在PCR mix中加入太多反转录产物会降低扩增效率和反应的线性。

通常，反转录产物的加入量不超过PCR反应体积的10%。

b) PCR退火时间太短
按操作说明设置退火温度。

c)PCR延伸温度太短
按操作说明设置退火温度。

d)移液错误或忘加某种试剂
检查试剂的浓度和储存条件，包括引物和cDNA。

e) HotStarTaq DNA Polymerase在热启动时没有被激活
确定循环程序包括了热启动步骤，仔细检查程序。

f)实时PCR中引物浓度没有优化
按实时PCR试剂盒要求的浓度使用引物。

g)循环数不足
增加循环数
h) PCR退火温度太高
按每次3度，逐步减低退火温度。

i)PCR退火温度太低
按每次2度，逐步升高退火温度。

j)没有检测信号
检查在程序中包含有荧光信号采集
k)错误的信号采集步骤
确定荧光信号采集的步骤是在PCR循环的延伸步骤。

l)实时PCR引物降解
用聚丙烯酰胺凝胶电泳检查怀疑的降解的引物
m)错误的染料过滤器
确保合适的过滤器被激活
n)起始模板不足
增加模板cDNA的量。

CT值比例/模板量的log值交点线性关系不好
a)模板量太高
不要超过最大的模板cDNA使用量。

细节请见操作步骤。

b)模板量太低
增加模板RNA的使用量
“No Template” control荧光信号值太高
a) 试剂有污染。