RNAi介导的 IGF1R基因沉默对肝癌细胞生长、迁移与侵袭的影响

RNAi介导的 IGF1R基因沉默对肝癌细胞生长、迁移与侵袭
的影响
别彩群;黄秋燕;颜英;石珩;汤绍辉
【摘要】AIM:To investigate the effect of RNA interference (RNAi)-mediated insulin-like growth factor 1 receptor ( IGF1R) gene silencing on the growth , migration, and invasion of hepatocellular carcinoma
cells .METHODS:The most effective siRNA targeting IGF1R gene was designed and screened .After lentiviral expression vector pLVX-shR-NA2-IGF1R carrying the most effective siRNA sequence was constructed , it was transfected into 293T cells and packed into pLVX-shRNA2-IGF1R lentivirus.Huh7 and Hep3B cells were infected with the pLVX-shRNA2-
IGF1R lentivirus to screen the positive clone Huh7 cells and Hep3B cells with the lentivirus .These Huh7 cells and Hep3B cells were cultured to ana-lyze the mRNA level of IGF1R, cell proliferation, cell cycle, cell apoptosis, cell migration/invasion, and the protein levels of IGF1R, Ki-67, p-AKT, p-ERK1, Gli1,β-catenin, cyclin D1, p21 and BCL-XL.RESULTS:The mRNA expression of IGF1R in Huh7 cells and Hep3B cells with pLVX-shRNA2-IGF1R lentivirus was significantly reduced .The proliferation of these cells was remarkably inhibited , and the number in G 1 phase was increased significantly .The percentages of apop-totic cells were increased markedly , and the number of cell migration/invasion was decreased markedly .The protein levels of IGF1R, Ki-67, p-AKT, p-ERK1, Gli1,β-catenin, cyclin D1, p21 and BCL-XL were decreased significantly compared with the blank control
group and negative control group .CONCLUSION:The RNAi-mediated IGF1R gene silencing sig-nificantly suppresses the growth and the malignant biological characteristics of Huh 7 cells and Hep3B cells, which may be involved in the reduced protein levels of the above genes induced by down -regulation of IGF1R expression.%目的：研究RNA干扰（ RNAi）介导的胰岛素样生长因子1受体（ IGF1R）基因沉默对肝癌细胞生长、迁移与侵袭的影响。

方法：设计并筛选抑制IGF1R mRNA表达效率最高的siRNA序列，构建该序列的慢病毒表达载体，转染293T细胞进行病毒包装。

将包装好的慢病毒感染Huh7和Hep3B肝癌细胞，筛选沉默IGF1R基因表达的稳定细胞株。

将上述稳定细胞株扩大培养，检测细胞IGF1 R mRNA表达变化，细胞生长、迁移与侵袭能力变化，以及Ki－67、p－AKT、p－ERK1、Gli1、β－catenin、cyclin D1、p21、BCL－XL的蛋白表达水平变化。

结果：与空白及阴性对照组比较，感染携带IGF1R干扰序列慢病毒的Huh7和Hep3B肝癌细胞IGF1R mRNA表达水平显著下调，细胞增殖活性明显降低，细胞凋亡显著增加，细胞迁移和侵袭能力明显受到抑制，细胞中IGF1R、Ki－67、p－AKT、p－ERK1、Gli1、β－catenin、cyclin D1、p21及BCL－XL蛋白表达水平均显著降低。

结论：RNAi介导的IGF1R基因沉默可明显抑制Huh7和Hep3B肝癌细胞生长及恶性生物学特征，这可能与IGF1R表达水平显著下调而引起上述调控细胞增殖、抗凋亡基因以及相关信号通路基因的蛋白表达水平显著降低有关。

【期刊名称】《中国病理生理杂志》
【年(卷),期】2015(000)012
【总页数】8页(P2136-2143)
【关键词】RNA干扰;胰岛素样生长因子1受体;肝细胞癌
【作者】别彩群;黄秋燕;颜英;石珩;汤绍辉
【作者单位】广州医科大学附属深圳沙井医院消化内科，广东深圳518104;暨南
大学附属第一医院消化内科，广东广州510630;暨南大学附属第一医院消化内科，广东广州510630;暨南大学附属第一医院消化内科，广东广州510630;暨南大学
附属第一医院消化内科，广东广州510630
【正文语种】中文
【中图分类】R735;R730.23
胰岛素样生长因子1受体(insulin-like growth factor 1 receptor，IGF1R)是一种酪氨酸激酶跨膜蛋白，由2个α亚单位和2个β亚单位构成。

IGF1R广泛表达于多种类型的细胞表面，参与介导胰岛素样生长因子1(insulin-
like growth factor 1，IGF1)和主要的IGF2的生物学功能，与细胞的增殖分化、
胚胎的发育密切相关[1]。

近年研究表明，IGF1R在多种恶性肿瘤包括肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)中的表达水平明显上调，IGF1R的过表达可能成为恶性肿瘤基因治疗的新靶点[2-3]。

RNA干扰(RNA interference，RNAi)是指与靶基因序列同源的双链
RNA(double-stranded RNA, dsRNA)所诱导的一种特异性基因沉默现象。

本研
究构建针对IGF1R基因的小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)前体——短发夹RNA(short harpin RNA，shRNA)的慢病毒载体，感染Huh7和Hep3B
肝癌细胞，观察对肝癌细胞生长、迁移与侵袭能力的影响及其机制。

LipofectamineTM RNAiMAX转染试剂及LipofectamineTM 2000转染试剂购
于Invitrogen，SYBR Green PCR Master Mix购于TOYOBO，PLVX-shRNA2
载体购于Clontech，Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒和细胞周期检测试剂盒购于Keygen，TRIzol试剂及细胞增殖检测试剂购于Promega，Huh7和HepG3B肝癌细胞株、HL-7702、293T细胞株购自武汉大学中国典型培养物保藏中心，抗IGF1R、抗Ki-67、抗p-ERK1、抗Gli1、抗p-AKT、抗cyclin D1、抗β-catenin、抗p21、抗BCL-XL及抗GAPDH抗体购于Abcam。

分类资料的比较采用χ2检验，计量资料的比较采用ANOVA或独立样本t检验，应用SPSS 13.0统计软件进行分析，P<0.05为差异有统计学意义。

本研究设计并合成了3对siRNA，即IGF1R_001、IGF1R_002及IGF1R_003，分别转染Huh7肝癌细胞。

转染24 h后，荧光定量PCR检测结果显示，转染IGF1R_001、IGF1R_002及IGF1R_003的Huh7细胞中IGF1R mRNA表达量均有不同程度的降低，抑制效率约为31.7%～78.6%，其中IGF1R_002在
100 nmol/L浓度时抑制效率最高，达78.6%，将此siRNA用于后续研究。

根据筛选出的IGF1R_002，设计表达IGF1R_002的shRNA序列，克隆入pLVX-shRNA2 载体，构建成pLVX-shRNA2-IGF1R_002慢病毒载体，测序结果显示插入片段序列正确。

将构建好的慢病毒载体及2种病毒包装辅助质粒共转染293T细胞，转染后48 h，在荧光显微镜下观察细胞的转染效率，几乎所有293T细胞均发出较亮的绿色荧光，提示转染效率高，病毒包装成功，见图1。

采用倍比稀释法检测病毒滴度为2.78×1011 TU/L。

将包装好的慢病毒感染Huh7和Hep3B肝癌细胞，挑选荧光强度大的阳性克隆孔逐级扩大培养，得到了沉默IGF1R基因表达的稳定细胞株，见图2。

图3显示，与正常肝细胞HL-7702相比，Huh7和Hep3B肝癌细胞
IGF1R mRNA的表达水平显著上调；感染携带IGF1R干扰序列(IGF1R siRNA)的慢病毒后，与blank control及negative control组相比较，IGF1R siRNA 组Huh7和Hep3B肝癌细胞的IGF1R mRNA表达水平明显下调(P<0.01)。

与blank control及negative control组相比较，IGF1R siRNA 组Huh7和Hep3B肝癌细胞的增殖明显受到抑制，从转染后第1至第3天差异均有统计学意义(P<0.01)；G1期细胞比例显著增加，S期细胞比例显著减少(P<0.01)；早期、晚期及总凋亡均显著增加(P<0.01)，见图4～6。

与blank control及negative control组相比较，IGF1R siRNA 组Huh7和Hep3B肝癌细胞迁移能力和侵袭能力明显受到抑制，差异均有统计学意义
(P<0.01)，见图7、8。

与blank control及negative control组相比较，IGF1R siRNA 组Huh7和Hep3B肝癌细胞IGF1R、Ki-67、p-ERK1、p-AKT、 Gli1、β-catenin、
cyclin D1、p21和BCL-XL蛋白的表达水平均显著降低(P<0.01)，见图9。

胰岛素样生长因子轴由IGF1、IGF2、IGF1R、IGF2R、胰岛素受体及IGF结合蛋白组成，它们所介导的信号通路在细胞生长、增殖、分化、凋亡等方面发挥重要作用，其表达异常与多种恶性肿瘤的发生发展密切相关[4]。

IGF1R是细胞表面的酪氨酸蛋白激酶受体，它介导IGF1及主要的IGF2生物学功能[5]。

研究表明，在HCC中，IGFs的失衡主要表现为IGF2和IGF1R过表达，且IGF2 mRNA 与IGF1R mRNA的表达水平呈正相关。

IGF2与IGF1R结合后激活2条信号转导通路，即PI3K/Akt和MAPK，进而促进细胞有丝分裂, 诱导细胞增生，抑制凋亡, 促进肝细胞恶性转化[6-9]。

因此，抑制IGF2或IGF1R过表达，干预该通路的活化有可能成为HCC治疗的新靶点[10]。

目前，有关应用小分子抑制剂如靶向IGF1R 的RNAi，进行HCC基因治疗的研究非常少，且不够深入。

在本研究中，我们根据siRNA设计原则，设计并合成了3对靶向IGF1R的siRNA 序列，分别转染Huh7肝癌细胞，结果筛选出IGF1R_002的抑制效率最高，达78.6%。

将表达IGF1R_002的shRNA序列克隆入pLVX-shRNA2 载体，构建成pLVX-shRNA2-IGF1R_002慢病毒载体，经293T细胞包装成功后，检测病毒滴
度为2.78×1011TU/L。

将慢病毒感染Huh7和Hep3B肝癌细胞，挑选荧光强度大的阳性克隆孔逐级扩大培养，得到了沉默IGF1R基因表达的稳定细胞株。

将上述稳定细胞株扩大培养，一系列细胞实验结果显示，感染携带IGF1R干扰序列慢病毒的Huh7和Hep3B肝癌细胞IGF1R mRNA表达水平显著下调，细胞增殖活性明显降低，细胞周期阻滞于G1期，细胞凋亡显著增加，细胞迁移能力和侵袭能力明显受到抑制。

这些结果提示，应用RNA干扰技术沉默IGF1R基因表达可显著抑制Huh7和Hep3B肝癌细胞的生长，降低其恶性生物学特征。

进一步基因表达检测结果显示，感染携带IGF1R干扰序列慢病毒的Huh7和Hep3B肝癌细胞的IGF1R、细胞增殖相关蛋白Ki-67、PI3K/Akt和MAPK信号通路相关蛋白p-AKT 及p-ERK1、Hedgehog信号通路相关蛋白(Gli1)、Wnt/β-catenin 信号通路相关蛋白β-catenin、细胞周期调控相关蛋白cyclin D1及p21、细胞凋亡抑制相关蛋白BCL-XL的表达水平均显著降低。

此结果提示：(1)Ki-67、AKT、ERK1、Gli1、β-catenin、cyclin D1、p21及BCL-XL基因可能是IGF1R的下游调控靶基因，一般情况下IGF1R对其可能是正向调控；(2)Huh7和Hep3B肝癌细胞中IGF1R 的表达抑制可导致上述基因表达水平显著降低，进而引起Huh7和Hep3B肝癌细胞生长繁殖明显抑制，恶性生物学行为降低；(3)采用RNA干扰技术沉默IGF1R 基因表达可能成为HCC基因治疗的一个新靶点。

既往研究显示，多条细胞信号通路的异常活化参与了HCC的发生发展，这些信号通路包括PI3K/Akt、MAPK、Hedgehog、Wnt/β-catenin、IGFs等[11-15]。

此外，更为重要的是，在HCC的发生发展过程中，Hedgehog信号通路与
PI3K/Akt、MAPK及Wnt/β-catenin信号通路之间存在着重要的交叉对话[15]，PI3K/Akt信号通路又可调控Wnt/β-catenin通路[16]，而Wnt/β-catenin通路也与PI3K/Akt、MAPK通路之间存在着交叉对话[17]。

这些研究结果表明，在HCC中，PI3K/Akt、MAPK、Hedgehog、Wnt/β-catenin等信号通路之间相互
影响、相互调控，共同影响肝癌的发生发展。

在本研究中，沉默Huh7和Hep3B 肝癌细胞IGF1R基因的表达，结果导致上述信号通路中关键分子的表达水平显著下调，表明IGF1R可能调控PI3K/Akt、MAPK、Hedgehog、Wnt/β-catenin信号通路的活性，或提示IGF1R可能先影响上述一至二条信号通路的活性，再进一步通过交叉对话使其它通路的活性发生改变，共同促进肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭等生物学行为，目前国内外尚未见相似研究报道。