产β-甘露聚糖酶Aspergillus sp. LQ21的分离、鉴定及发酵条件的研究

产β-甘露聚糖酶Aspergillus sp. LQ21的分离、鉴定及发
酵条件的研究
赵伟;郑甲;周洪波
【摘要】β-甘露聚糖酶是一类能够水解甘露聚糖、葡甘露聚糖、半乳甘露聚糖的半纤维素酶类,广泛存在于动植物和微生物中,此酶在食品、医药、饲料、造纸、石油等方面已得到广泛应用;近年来,其作为食品和饲料添加剂方面倍受关注.对采自土壤和树皮的样品通过富集培养、平板初筛和摇瓶复筛,得到1株具产β-甘露聚糖酶能力的曲霉属菌株LQ21,结合形态特征、培养特征及18S rRNA基因序列分析,将该菌株鉴定为Aspergillus sp.真菌.考察了培养时间、起始pH、培养温度、碳源和氮源对该菌株产酶的影响.初步确定了其最适产酶培养基组成:魔芋粉0.5%,蛋白胨1%,NaNO3 0.2%,K2HPO4 0.1%,KCl 0.05%,MgSO4·7H2O
0.05%,FeSO4·7H2O 0.001%;最适培养条件:初始pH 4.5,温度35 ℃,转速200
r/min,培养60 h发酵液上清中酶活达到最高.
【期刊名称】《微生物学杂志》
【年(卷),期】2010(030)005
【总页数】7页(P12-18)
【关键词】β-甘露聚糖酶;曲霉属;18S rRNA
【作者】赵伟;郑甲;周洪波
【作者单位】中南大学,生物冶金教育部重点实验室,湖南,长沙,410083;中南大学,资源加工与生物工程学院,湖南,长沙,410083;中南大学,资源加工与生物工程学院,湖南,
长沙,410083;中南大学,生物冶金教育部重点实验室,湖南,长沙,410083;中南大学,资源加工与生物工程学院,湖南,长沙,410083
【正文语种】中文
【中图分类】Q93-331
植物半纤维素是继纤维素之后自然界最丰富的多糖类化合物。

甘露聚糖是植物半纤维素的主要成分,也是许多豆科植物胚乳和一些非豆科植物成熟种子的成分之一(Viikari et al.,1992)。

β-1,4-D-甘露聚糖酶(β-1,4-D-mannan mannanohydrolase,EC.3.2.1.78),是一类能够水解含有β-1,4-D-甘露糖苷键的甘
露寡糖、甘露多糖(包括均一甘露聚糖、半乳甘露聚糖、葡甘露聚糖等)的水解内切酶,属于半纤维素酶类(Schombug&Salzmann,1991),广泛存在于动植物和微生物
中[1-4]。

不同来源的β-甘露聚糖酶性质差异较大,微生物来源的β-甘露聚糖酶因
具有较宽的作用温度和pH范围而备受关注。

其中细菌和放线菌来源β-甘露聚糖
酶最适pH多近中性或偏碱性,真菌来源的最适pH多偏酸性且耐酸性较强。

该酶
已广泛用于食品、医药、饲料、造纸、纺织、石油开采等方面[5-7],近年来酸性β-甘露聚糖酶作为饲料添加剂而成为研究的热点[8-9]。

真菌来源的β-甘露聚糖酶多为酸性,因而许多研究者集中到真菌来源的β-甘露聚糖酶的研究。

近年来,一些真菌来源的β-甘露聚糖酶被报道和发现,部分β-甘露聚糖酶基因被克隆和表达[10-12]。

本研究从长沙岳麓山土壤和坏死枯树上取样,以魔芋粉为底物筛选到1株产甘露聚
糖酶的Aspergillussp.LQ21菌株,以期获得适合用作饲料添加剂的酸性β-甘露聚
糖酶。

1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 采样地点长沙市岳麓山。

1.1.2 培养基①查氏培养基：NaNO30.2%,K2HPO40.1%,KCl
0.05%,MgSO4·7H2O 0.05%,FeSO4·7H2O 0.001%;②富集培养基：查氏母液,魔芋粉0.5%,调pH值到5,121℃灭菌20 min;③平板分离培养基(初筛培养基)：查氏母液,魔芋精粉0.5%,琼脂糖1%,调pH值到5.0,121℃灭菌20 min;④液体发酵培养基(复筛培养基)：查氏母液,魔芋粉0.5%,蛋白胨1%,酵母粉0.5%,调pH值到4.5,121℃灭菌20 min;⑤斜面种子培养基(马铃薯培养基)：去皮土豆300 g,葡萄糖30.0 g,琼脂粉15.0 g,单篜水1 L。

1.1.3 主要试剂①DNS：3,6-二硝基水杨酸钠3.15 g,氢氧化钠溶液20 g,四水酒石酸钾钠91.0 g,苯酚
2.50 g,无水亚硫酸钠2.50 g,水1 L;②原碘液：碘5.0 g,碘化钾50.0 g,单蒸水1 L;③稀碘液：取原碘液用蒸馏水稀释100倍。

所用化学试剂均为分析纯,PCR试剂均购自MB I公司,DNA纯化回收试剂盒(E.Z,N,AT M Gel Extraction Kit)购自OMEGA公司,魔芋粉购自青岛魔芋粉有限公司,刺槐豆角(Sigma0753)购自Sigma公司。

1.2 方法
1.2.1 产β-甘露聚糖酶菌株的初筛初筛所用培养基为选择性培养基,即以魔芋精粉作为唯一碳源。

初筛时,其产酶能力大小由其碘液染色后水解圈的大小来衡量。

①样品处理：称取样品1、样品2各10 g分别放入2个250 mL的灭菌三角瓶中,加入50 mL富集培养基,30℃富集培养48 h;②稀释涂平板：取富集培养液梯度稀释到106倍。

取稀释104～106倍的菌悬液各0.2 mL涂平板,每个梯度涂3个平皿,3个土样共涂27个平皿,30℃恒温培养2 d。

初筛平板长出后,向初筛平板中加入碘液,覆盖菌落,染色5 min后倒出碘液,用无菌水小心地将残留的染液洗下,将其置于4℃冰箱放置一段时间。

待菌落周围有透明的水解圈出现,测量菌落直径与水解圈直径。

1.2.2 产β-甘露聚糖酶菌株的复筛初筛菌株用接种针挑取单菌落孢子于5 mL(50 mL摇瓶)的液体发酵培养基中30℃,200 r/min摇床培养3 d。

然后,转接50 mL
液体发酵培养基(250 mL摇瓶)中30℃,200 r/min摇床培养3 d。

取发酵液用
DNS[13]法测酶活力,选取酶活力较高菌株。

1.2.3 菌种的表型鉴定依据菌落特征,个体形态特征对菌种进行初步的鉴定。

采用
点种培养的方法,吸取微量的孢子悬液点种于平板分离培养基的中央,点接3个平板。

在30℃下培养,间隔一定时间观察结果,肉眼直接观察菌落的形态及生长变化。

在培养3 d后,油镜下观察菌丝体及孢子形态。

1.2.4 18S r DNA基因的PCR扩增与系统发育分析采用简化的CTAB法[14]提取基因组DNA后扩增18S rRNA基因。

PCR扩增正向引物：18SF,5′-CCTGGTTGATCCTGCCAG-3′;反相引物：18SR,5′-TTGATCCTTCTGCAGGTTCA-3′。

PCR扩增体系：基因组DNA,2μL引物18SR,2μL;引物18SF,2μL;10×PCR Buffer,5μL;MgCl2(25 mmol/L),5μL;dNTP(10 mmol/L),1μL;Taq酶,2μL;双蒸水,31μL。

PCR扩增条件：95℃5 min,95℃1 min,55℃1 min,72℃1.5 min,32个
循环,72℃10 min,4℃保存。

PCR产物送上海桑尼生物科技有限公司测序。

18S r DNA基因序列程序后,利用Blast在线比对服务(http：
///Blast.cgi)进行相似搜索,调出相关有效序列,用
ClustalX2.0进行序列比对,随后用Mega4.0软件构件系统发育树。

1.2.5 不同培养时间对产酶的影响取1.295×106/mL的菌株LQ-21孢子悬液按1%的接种量接种于50 mL液体发酵培养基中,3个平行,35℃,200 r/min下培养,每隔12 h取样测定酶活。

1.2.6 起始pH对产酶的影响配制2 L液体发酵培养基,用2 mol/L的硫酸和2 mol/L的NaON调pH值分别到4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0。

取1.295×106/mL的菌株LQ-21孢子悬液按1%的接种量
接种于上述pH的50 mL液体发酵培养基中,每个3个平行样。

35℃200 r/min下
培养,培养60 h测定发酵液酶活力。

1.2.7 温度对产酶的影响取1.295×106/mL的菌株LQ-21孢子悬液按1%的接种量接种于50mL液体发酵培养基中,每个3个平行样。

分别置于24～26℃、29～31℃、34～36℃、39～41℃的摇床中,200 r/min恒温培养60 h测定发酵液酶活力。

1.2.8 不同碳源对产酶的影响在查氏母液中加入1%蛋白胨,0.5%酵母粉,再分别加入1%的魔芋粉、槐豆胶、葡萄糖、甘露糖、蔗糖。

取1.295×106/mL的菌株LQ-21孢子悬液按1%的接种量接种于上述50 mL液体发酵培养基中,每个3个平行样。

35℃,200 r/min恒温培养60 h测定发酵液酶活力。

1.2.9 不同氮源对产酶的影响分别用硝酸钠、硫酸铵、氯化铵、硝酸铵、硝酸钠和蛋白胨、硝酸钠和蛋白胨及酵母膏作为氮源的查氏液体发酵培养基;硝酸钠的加入量为0.2%,硫酸铵、氯化铵、硝酸铵的加入量分别为0.16%、0.125%、0.094%以保证培养基中含氮量一致;蛋白胨和酵母膏的加入量分别为1%和0.5%。

并加入前一步确定的最佳碳源。

取1.295×106/mL的菌株LQ-21孢子悬液按1%的接种量接种于上述50 mL液体发酵培养基中,每个3个平行样。

35℃,200 r/min恒温培养60 h测定发酵液酶活力。

2 结果
2.1 初筛结果
从富集培养液的106稀释倍数下挑选14株菌株测量其菌落直径与水解圈直径并进入复筛。

其中从样品1中挑取7个菌落,样品2中7个菌落,初筛结果见表1。

表1 产β-甘露聚糖酶菌株初筛结果Table 1 The result of plate screening菌株编号菌落直径C/cm水解圈直径H/cmC/H 1-14048.51.212 1-24049.51.238 1-340501.250 1-440501.250 1-541.5481.157 1-642491.167 1-742.549.51.165 2-140491.225 2-243491.140 2-34250.51.202 2-442501.190 2-543.5511.172
2-648.5551.134 2-741491.195
从初筛平板上挑取10株生长速度快、水解圈较大的菌株进入摇瓶复筛,选取表1中编号为1-1、1-2、1-3、1-4、1-6、2-1、2-3、2-4、2-5、2-7的10个菌株进行摇瓶复筛。

2.2 复筛结果
复筛结果如图1,菌株2-1摇瓶发酵产酶活较高且生长速度较快,选择菌株2-1为研究的出发菌株,命名为LQ21。

图2为菌株2-1菌落经碘液染色的水解圈照片,左为菌落正面照片,右为背面水解圈照片。

2.3 菌株LQ21的表型鉴定结果
LQ21菌株在平板分离培养基上生长较快,菌落质地较为疏松,呈丝绒状至絮状。

在30℃下培养3 d后开始产生孢子,孢子为黑色。

其形态特征见表2和图3。

表2 黑曲霉LQ21菌株的形态特征Table 2 Morphological characteristics ofAspergillussp.LQ21名称形态特征菌落菌落在平板分离培养基上30℃培养2 d,菌落直径在4～5 cm,质地疏松,丝绒状。

菌落颜色初为白色,3 d后变为淡黄色,产生孢子之后变为黑色。

菌落中央菌丝生长形成突起边缘不整齐,菌落背面呈淡黄色孢子头孢子头呈球形至放射状,直径约为200～400μm孢子梗长1～3 mm,直径20～25μm,壁光滑,无横隔,无色分生孢子球形,黑色,直径5.0～6.0μm,壁粗糙,有刺状突起菌丝菌丝透明无色,有横隔,一部分伸入培养基内,一部分形成气生菌丝,菌丝顶端膨大形成分生孢子梗
查阅曲霉表型鉴定相关文献[15-16],LQ21菌株的上述特征基本上与曲霉属的黑曲霉和泡盛曲霉的分类特征相符,因此将菌株LQ21初步鉴定为曲霉属真菌。

2.4 菌种的18S rRNA基因序列分析
用18S rRNA基因通用引物对菌株LQ21基因组DNA进行PCR扩增,扩增得到产
物经1%琼脂糖凝胶电泳检测如图4,回收胶纯化后送上海桑尼生物科技有限公司进行测序。

取得上述序列后,将上述序列一起在NCB I数据库进行BLASTN比对,登陆号为HM536999。

以18S r DNA序列同源性构建系统发育树(图5)。

表明菌株Aspergillussp.LQ21与Aspergillus awam ori HB-03(GU226429)、Aspergillusawam ori07-02(EU667995)和Aspergillus niger IMT(GQ338836)的18S rRNA基因的相似性为99%,因此将该菌株鉴定为曲霉属真菌。

图5 菌株Aspergillussp.LQ21基于18S rRNA基因序列同源性构建的系统发育树Fig.5 Phylogenetic tree of Aspergillussp.LQ21 based on the 18S rRNA gene homology
2.5 培养时间对产酶的影响
由图6可以看出,菌株LQ21的酶活力在60 h达到最高,之后开始下降,72～84 h酶活力有小幅度上升,推测是在培养的后期魔芋粉碳源的消耗殆尽使得菌体进入衰退期并发生自溶,释放部分胞内β-甘露聚糖酶。

图6 菌株Aspergillussp.LQ21随培养时间产酶变化曲线Fig.6 The effect of cultural time on the β-mannanase production ofAspergillussp.LQ21
2.6 起始pH对产酶的影响
由图7可以看出,pH对目的菌株产β-甘露聚糖酶的影响比较明显,该菌的最适产酶pH为4.5。

从实验中培养物的表观形态来看,菌株培养60 h后其颜色从pH 4.0～8.0逐渐变化,pH 4.0及4.5时为亮黄色,7.0～8.0时为黄褐色,中间的为米黄色。

与所测酶活力对比,可得亮黄色的培养物酶活力较高,可能由于菌体生长状况不同或其代谢产物所致,有待以后实验研究。

图7 培养基初始pH对Aspergillussp.LQ21产酶的影响Fig.7 The effect of
initial cultural pH on β-mannanase production of Aspergillussp.LQ21
2.7 温度对产酶的影响
结合表中的数据,由图8可以看出,培养温度对β-甘露聚糖酶产生菌的产酶的影响比较明显,该菌的最适产酶温度在35℃左右。

图8 培养温度对Aspergillussp.LQ21产酶的影响Fig.8 The effect of cultural temper ature on β-mannanase production of Aspergillussp.LQ21
由图9可知,实验中培养物的表观形态在温度为24～26℃、28～30℃、34～36℃、40～42℃的培养条件下,发酵培养物均形成规则的菌丝球。

28～30℃下的培养物颜色为亮黄色,34～36℃下为黄褐色,24～26℃及40～42℃下得培养物为米黄色,而
在44～46℃下菌体未形成菌丝球,较透明。

说明在此温度范围内,不适合菌体的生长。

这些也可能由于菌体生长状况不同或其代谢产物所致,有待以后实验研究。

图9 不同培养温度下Aspergillussp.LQ21菌株培养物Fig.9 Morphological character of Aspergillussp.LQ21 cultured in different temperature
2.8 不同碳源对产酶的影响
由图10可以看出,几种碳源对该菌株产酶的影响较大,魔芋粉和槐豆胶的影响非常
接近,葡萄糖优于甘露糖,单糖优于双糖。

由培养物的表观形态看,碳源为甘露糖及葡萄糖时培养集中最先出现菌丝体。

培养60 h后,含甘露糖的培养基中出现较大的菌丝团;含葡萄糖的培养基中出现较大的菌丝团和直径约5 cm菌丝球;含蔗糖的培养
基中有较大的菌丝团和直径约3 cm的菌丝球;含魔芋粉与槐豆胶的培养基中出现
直径约0.5 cm的菌丝球,培养基呈糊状。

图10 不同碳源对Aspergillussp.LQ21产酶的影响Fig.10 The effect of carbon source on β-mannanase production ofAspergillussp.LQ21
2.9 不同氮源对产酶的影响
由图11可以看出,氯化铵和硝酸铵、硫酸铵和硝酸钠对该菌株产酶的影响非常接近,
硫酸铵作为无机氮源略好于其他3种。

培养基中加入蛋白胨后发酵摇瓶中酶活显著提高,同时加入蛋白胨与酵母膏酶活反而下降,可能由于氮源过于丰富菌体生长较好,反而产酶降低。

图11 不同氮源对Aspergillussp.LQ21产酶的影响Fig.11 The effect of nitrogen source on β-mannanase production ofAspergillussp.LQ21
3 讨论
本文通过水解圈法筛选和摇瓶复筛得到酶活力较高的1株β-甘露聚糖酶产生菌LQ21,通过表型特征、培养特征和18S rRNA基因序列相似性分析,将该菌株初步定为黑曲霉。

通过摇瓶液体培养单因素实验发现,菌株LQ21的最适产酶时间是60 h,最适产酶初始pH值为4.5,最适产酶培养温度是35℃。

本研究发现几种碳源对黑曲霉LQ21产酶的影响较大,魔芋粉和槐豆胶的影响相当,葡萄糖优于甘露糖,单糖优于双糖。

从数据上来看,魔芋粉为该菌株的最适产酶碳源。

从实验中培养物的表观形态来看,碳源为甘露糖及葡萄糖时培养集中最先出现菌丝体。

培养60 h后,含甘露糖的培养基中出现较大的菌丝团;含葡萄糖的培养基中出现较大的菌丝团和菌丝球,直径约5 cm;含蔗糖的培养基中出现较大的菌丝团,和直径约为3 cm的菌丝球;魔芋粉与槐豆胶作碳源的培养基中则出现直径0.5 cm的菌丝球,培养物呈糊状。

由此现象结合上表中的数据可知,黑曲霉LQ21产β-甘露聚糖酶为诱导酶,虽然葡萄糖、甘露糖和蔗糖更利于菌体的生长,但并不利于其产酶。

诱导底物魔芋粉和槐豆胶相比,前者具有略好的诱导效果。

考察硝酸钠、硫酸铵、氯化铵、硝酸铵作为查氏液体发酵培养基的唯一氮源发现,硫酸铵作为唯一无机氮源略好于另外3种,加入蛋白胨后酶活表达水平显著提高,这表明有机氮源更利于菌体利用。

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