间接免疫荧光法测ANA

【ANA 由 来】
均质体
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中性粒细胞 DNP(DNA-Histone) + 抗DNP + 补体 LE细胞
LE细胞：并非SLE特有，PM、SD、RA、SS等结缔组织病，药物 过敏，慢活肝等亦可阳性。抗DNP取代LE细胞的检测
ANA的筛选：间接免疫荧光法
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抗原
抗体（血清） 抗原—抗体
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第二抗体
的 筛 选 ： 间 接 免 疫 荧 光 法
滴度定义：与相同稀释倍数的阴性血清相比，能观察 到特异性荧光反应的最高稀释度
【临床意义】
总的ANA检测在临床诊断与鉴别诊断中是一 个极为重要的筛选试验。绝大多数自身免疫 性疾病均可呈阳性。ANA阳性者进一步检测 各亚类ANA抗体对明确诊断、临床分型、病 情观察、预后及治疗评价有重要意义。 未经治疗的、活动性SLE的阳性率为80%－ 100%。药物性狼疮100%、全身硬皮病、混 合性结绨组织病、狼疮性肝炎、原发性胆汁 性肝硬化等。 干燥综合症（SS）、类风关、桥本甲状腺炎 等。
与相同稀释倍数的阴性血清相比能观察到特异性荧光反应的最高稀释度总的ana检测在临床诊断与鉴别诊断中是一个极为重要的筛选试验
间接免疫荧光法 检测抗核抗体（ANA）
抗核抗体
【自身抗体】：指抗自身组织、器官、细 胞及其成分的抗体 【ANA】：指抗细胞核成分（DNA，RNA，蛋 白质和酶）的抗体。ANA存在一个谱 ANA新概念：抗核酸（Nucleic acid）和核 蛋白（Nucleoprotein）抗体的总称 某些核抗原成分在核仁和胞浆内比核质内 更丰富
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ANA
实验原理：
生物薄膜载片上的IgA、IgG、IgM类 特异性抗体可以与抗核抗原反应；随 后，结合抗体可与标记荧光的二抗进
行反应，并可在荧光显微镜下观察。
实验原理：
FITC标记的抗人抗体 FITC
FITC
人特异性抗体
抗原 载片
生物薄片马赛克TM技术
【实验步骤】
实验步骤一：准备
检查加样板是否反应区亲水而周边疏水？ 如果不是，可用湿纸巾擦拭，必要时可使 用家用洗涤剂，再用水彻底冲洗。需要消 毒时，可于3％的Sekusept Extra （汉高公 司）中浸泡1小时。 只有当载片平衡到室温后方可打开袋子。 不要触及生物薄片。按照要求用记号笔对 玻片进行标记。
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实验步骤四：孵育

将载片盖在加样板对应的凹槽里，反应即 开始。确保每个标本均能够与生物薄片相 接触，而标本之间不相互接触。室温（1825℃）温育30分钟。
实验步骤五：冲洗

用烧杯盛PBS-Tween缓冲液，流水冲洗载 片，然后立即放入装有PBS-Tween缓冲液 的小杯中浸洗至少5分钟。

实验步骤十：结果判断
荧光显微镜下观察荧光。
结果判读：
荧光显微镜下观察 细胞核发黄绿色荧光为阳性染色细胞，不 发荧光为阴性。 抗原片中出现阳性染色细胞为ANA阳性， 否则为阴性。 阳性待检血清可作进一步稀释后测定效价。

【均质型】 细胞核呈均匀一致的荧光Leabharlann 【核仁型】 核仁部分呈现荧光

实验步骤八：冲洗
用烧杯盛PBS-Tween缓冲液，流水冲洗载 片，然后立即放入装有PBS-Tween缓冲液 的小杯中浸洗至少5分钟。 可在每150ml磷酸盐缓冲液中加10滴(150 µl) 伊文氏蓝进行复染。

实验步骤九：封片
在盖玻片上滴加甘油/PBS。 封片体积: 10 µl/反应区(5 x 5 mm) 从PBS-Tween 清洗缓冲液中取出一张载片， 用纸擦干背面和四边，注意不要擦拭反应 区间隙。 将载片的生物薄片朝下置于准备好的盖玻 片上，立即检查盖玻片是否放入载片的凹 槽里，如有必要，需调整位置，正确放置。 然后再进行下一个载片的操作。

活动性SLE （95-100%） 非活动性SLE （80-100%） 药物诱导的红斑狼疮 （ 100% ） 混合结缔组织病 （ 100% ） 类风湿关节炎 （ 20-40% ） 其他风湿性疾病 （ 20-50% ） 进行性系统硬化症 （ 85-95% ） 多肌炎、皮肌炎 （ 30-50% ） 干燥综合征 （ 70-80% ） 慢性活动性肝炎 （ 30-40% ） 溃疡性结肠炎 （ 26% ）
实验步骤二：样品准备
1:100稀释血清标本。每次实验均 需加入阳性和阴性对照。对照血清 使用前必须混匀。
实验步骤三：加样
在加样板的每个反应区加入稀释血清，避 免产生气泡。滴加完所有待测标本后才开 始温育。使用聚苯乙烯加样板。 加样体积: 25 µl/反应区(5 x 5 mm)

样品1 样品2 样品3 阳性对照 阴性对照
Nuclear Antigen, ENA） 抗核仁（Nucleolus）
几种ENA的由来及同义词
Sm：病人名：Smith RNP: u1 RNP或nRNP Nuclear




Ribonucleoprotein SSA: RO Sjogren’s syndrome A SSB: La, Ha, Sjogren’s syndrome B Jo-1: 病人John ScL-70: Scleroderma

ANA检测的意义
有助于疾病的诊断 如抗Sm是SLE标记抗体； 抗ScL-70 是SD的标记抗体； 抗Jo-1是PM/DM的标记抗体； 观察疾病活动度和治疗反应 研究发病机理

【ANA分类】
抗DNA（dsDNA,ssDNA) 抗组蛋白（Histone)
抗非组蛋白（Nonhistone,Extractable
【斑点型】(颗粒型) 细胞核内呈现斑点状荧光
【胞浆型】
【着丝点型】
混合型：存在两种以上的类型
ANA结果判断
1：100 阴性 1：100 阳性 阴性，标本中未检测到抗核抗体 微量 对于核均质性、着丝点、核点型等荧光模 式，提示某种风湿性疾病或其他疾病 阳性 提示某种风湿病或其他疾病
1：320 阳性
实验步骤六：加样

将20μl荧光标记的抗人球蛋白（荧光二 抗）加入洁净加样板的每个反应区。完 全加完所有的二抗后，方可继续温育 （最多可加50个载片）。建议使用连续 加样器。加样前应使用加样器混匀。为 节约时间，可在第一步温育的同时滴加 酶结合物至另一个加样板的反应区中。
实验步骤七：孵育
从PBS-Tween 清洗缓冲液中取出一张载片， 5秒钟内用吸水纸擦一下背面和边缘后，立 即将载片覆有生物薄片的一面朝下，盖在 加样板的凹槽里。 注意：为防止破坏基质，不要擦拭反应区 的间隙。 检查生物薄片是否与液滴接触良好，然后 继续下一张。 从现在开始，注意避免阳光直射载片。 室温温育30分钟。