M-MLV逆转录酶 说明书

单体的分子量约为73kD，具有RNase H活性，无RNase的污染，可用于5kb以下第一链cDNA的合成。
产品来源：重组E.coli菌株,含有从莫洛尼氏鼠中克隆的莫洛尼氏鼠白血病病毒（M-MLV，Moloney
Murine Leukemia Virus）逆转录酶基因。
活性定义： 以poly(rA)为模板、oligo (dT) 为引物，在37°C条件下，10分钟内催化掺入1nmol的dTTP
3. 离心数秒使反应液聚集于PCR管底部。
4. 继续向上述反应液中加入以下试剂：
5×RT Buffer
4ul *注：也可以使用相对便宜的化学类试剂RNasafe（TIANGEN）
0.1 M DTT RNasin(40U/ul)*
2ul 代替RNasin，效果相同；由于RNasafe只在高温下起作用，需 1ul 在第一步中70℃保温之前加入，本体系中加入1ul即可。
产品纯度：200U的本酶和1ug的16S，23S rRNA在37℃下反应1小时，RNA的电泳条带不发生变化。 反应缓冲液：[5×RT Buffer] 250 mM Tris-HCl（PH 8.3），15 mM MgCl2，375 mM KCl. 反应条件：
z cDNA第一链的合成（反转录反应）：
1. 在无RNAase污染的PCR管中加入以下试剂，全量12ul：
Beijing Protein Institute (BPI) B-8 Airport Industrial Zone, Beijing, China, 101300
Tel: 86-10-80493132, Fax: 86-10-80485460
Oligo (dT)12-18(1ug/ul) 或随机引物（50-250ng）
1 ul
或基因特异引物（2pmol）
total RNA（10ng-5ug）或mRNA（1-500ng）
x ul
dNTP (10mM each)
1 ul
DEPC ddH2O 2. 70℃保温10分钟后迅速冰浴2-10分钟。
12-x ul
上步骤得到的cDNA溶液*① Taq DNA polymerase（5U/ul） 10×Taq Buffer（含15mM Mg2+）*② dNTP Mixture（2.5 mM each） Primer 1（10 µM） Primer 2（10 µM） ddH2O
xul 0.5ul
2ul 1.6ul 0.5ul 0.5ul up to加入量通常为 0.1--1ul（20ul体系），过量会抑制反应 *注②：Mg2+反应最适浓度可根据模板及引物特点 做相应调整
2. PCR反应条件：
94℃ 94℃ 55℃ 72℃ 72℃
5 min
30 sec
30 sec
30 Cycles
1 min（1 min / kb）
M-MLV Reverse Transcriptase(RNase H+) 使 用 说 明 书
Part No.: EM-005-B 包装量：M-MLV逆转录酶(200U/ul)10000U，50ul；5×RT Buffer，500ul；0.1 M DTT，200ul。 贮存条件：-20°C，保质期两年。 产品说明：M-MLV逆转录酶能以RNA或单链DNA为模板由引物起始合成一条互补的DNA链。此酶
10 min
Beijing Protein Institute (BPI) B-8 Airport Industrial Zone, Beijing, China, 101300
Tel: 86-10-80493132, Fax: 86-10-80485460
所需要的酶量定义为一个活性单位（U）。
产品浓度：200U/ul. 产品应用：
z 第一链cDNA的合成
z RT-PCR一步法反应
储存缓冲液：20 mM Tris-HCl(PH7.5)，100 mM NaCl，0.25 mM EDTA，0.01% NP-40（或Triton X-100）
(v/v)，2.5 mM DTT，50%甘油（v/v）.
5. 轻轻吸打混匀反应液后，42℃保温2分钟（Oligo (dT)12-18或基因特异引物）；如果是随机引物则 25℃保温10分钟。 6. 加入1ul M-MLV逆转录酶，轻轻吸打混匀后42℃保温50分钟。 7. 70℃ 保温15分钟后置冰上冷却，得到的cDNA溶液可直接进行cDNA第二链的合成或PCR扩增反 应等，也可以置于-20℃保存。 z PCR反应（例） 1. PCR反应体系（20ul）：