第6章植物原生质体培养及体细胞杂交
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胼胝质酶：
主要用于分离花粉小孢子的原生质体。
蜗牛酶：
从蜗牛胃液中分离的酶的粗制剂，含多种解离酶，对孢 粉素、木质素有一定的分解能力，用于分离花粉母细胞、 四分体细胞或从较老的组织分离原生质体。
崩溃酶：
是一种粗制酶，同时具有纤维素酶和果胶酶等多种酶的活 性，在与果胶酶混合使用时，对分离培养细胞及根尖细胞 有加速解离的效果。
在低速下离心后原生质体沉到管底,其余细胞碎 片等物多数漂浮在溶液中。
特点：简单方便，丢失少，但纯度不够高。
3.界面法（梯度离心法）
原理：选两种不同渗透浓度的溶液，其中一种溶液的密度大 于原生质体的密度，另一种溶液的密度小于原生质体的密 度，经离心后使完整无损的原生质体处于两种溶液的界面 之间，而细胞碎片等杂质沉于管底，高度净化完整原生质 体可在这两相系统的界面上收集到。
酶液的配制及pH值
酶液的配制： 按已确定使用的酶和稳定剂的量称取酶和各种
稳定剂,并把它们逐步溶解，配制成酶液之后，酶 液用孔径为0.45μm的微孔滤膜过滤灭菌后备用。 酶液的pH值：
分离原生质体时一般将酶液的pH调节在5～6之 间。
酶浓度和酶解时间
酶浓度： 纤维素酶：一般为0.5～5％ 果胶酶：一般为0.1％～1％ 蜗牛酶和胼胝质酶：一般为0.5～2.0％
温度：一般25～30℃。 湿度：100%。
4、原生质体发育和植株再生
10h以上
再生细胞壁
植株再生
诱导器官发生 诱导形成胚状体
圆变为 椭圆形
荧光增白剂 （卡氏白)
愈伤组织
第一次分裂 第二次分裂
肉眼可见的细胞团
第N次分裂
2~3周，植板率
小细胞团
5. 原生质体培养过程中的管理
及时添加新鲜培养基 逐步降低培养基的渗透压 及时调整培养基中的激素成份
酶溶剂及其渗透压
酶溶剂：原生质体培养基 渗透压调节剂：
作用：代替细胞壁对原生质体起保护作用。 糖醇类：甘露醇、山梨醇、葡萄糖、蔗糖等。 使用浓度：0.2～0.8mol/L
质膜稳定剂：
溶液中加入一些盐类，可以保护细胞膜、提高 原生质体稳定性和活力。
常用的有：CaCl2（0.7～1.0mol/L）、KH2PO4、 KCl、MgSO4·7H2O、MES（2-氮吗啉乙烷磺酸） 和葡聚糖硫酸钾等。
原生质体活力＝ 有活力原生质体数 观察原生质体数 ×100％
1.形态识别：形态完整，富 含细胞质，颜色新鲜，正 常球形 。
2.相差显微镜观察法：观察 细胞质环流、核的正常与 否。
3.酚藏花红染色法（0.1%) ：有 活力原生质体不被染色，而无 活力的被染成红色 。
4.伊凡蓝染色法(0.025%) ：活 力受损或死细胞才能摄取这种 染料，活细胞不摄取。
（2）无机盐:
大量元素：一般较愈伤组织培养中的浓度低 NO3- / NH4+的比例高 Ca++ 、Mg++需求高
（3）有机成分：种类齐全
（4）激素：生长素与细胞分裂素对诱导细胞 壁的形成和细胞分裂、分化是必需的。
（5）pH值及灭菌：一般pH值以5.6-6.0为宜， 过滤灭菌。
2. 原生质体培养方法
↓2周 转移到MS基本培养基上促进苗产生根,最后长成完整植株
四、影响原生质体培养的主要因素
1、原生质体的活力 2、原生质体的起始密度 3、原生质体的营养和环境 4、基因型
1. 原生质体的活力
细胞壁降解酶的种类和组合 渗透压稳定剂 质膜稳定剂 温度因子的影响 植物材料的类型及生理状态
2. 原生质体的起始密度
密度过高时，有可能造成培养物营养不足或细胞 代谢产物过多而妨碍再生细胞的正常生长
密度过低时，再生细胞不能进行持续分裂
一般原生质体培养时，起始密度为104-105个 /ml，低密度下的培养使用较复杂的培养基和特殊 的培养方法。
3. 原生质体的营养和环境条件
•硝酸盐和铵盐比例高
特点：可以收集大量、纯净的原生质体，同时避免收集过程 中原生质体因相互积压而破碎。
常用系统：PEG（6000）-Ficoll（40000）系统，
甘露醇（182.17 ）-Ficoll系统，
蔗糖（342.3 ）-甘露醇系统等。
13%甘露醇溶液 25%蔗糖溶液
纯化后的原生质体
四、原生质体的活力测定
第二节 原生质体培养
一、原生质体培养的意义
1.建立单细胞无性系 2.为细胞融合奠定基础 3.遗传工程的理想受体 4.原生质体是多种基础理论研究的实验系统
二、原生质体培养
1. 培养基 （1）渗透压：与细胞渗透压等渗或稍低。 渗透压调节剂：甘露醇、山梨醇、蔗糖、麦芽糖 和葡萄糖等。 当原生质体再生细胞壁并开始分裂后,必须逐步 降低渗透压,直到与细胞培养基同样的水平。
0.5
0.5
Hale Waihona Puke 0.505.6 酶解方法
两步法：先用果胶酶离析植物组织后收 集植物细胞，洗涤后用纤维素酶解离细 胞壁。
一步法：把一定量纤维素酶和果胶酶组 成混合酶液,对材料进行一次性处理。
三、原生质体的纯化
纯化的含义： 一是从酶混合液中收集到的原生质体,在培养前必
须把酶液冲洗干净；二是得到纯净的原生质体。
的果胶质降解，把细胞从植物组织中单独释放出 来。 如：
Macerozyme R-10（Japan） Pectinase（USA） Pectolyase Y-23（Japan）
半纤维素酶：
主要由曲霉中提取，专门分解半纤维素。从愈伤组织分 离原生质体时，有时增加半纤维素酶。
如：Rhozyme HP-150（USA）、Hemicellulase（USA）
4. 基因型
植物形态发生受基因控制的，是一个复 杂的过程，不同基因型的原生质体的形态发 生能力不同。而且原生质体的不同生长发育 时期受不同基因所控制。
第三节、植物体细胞杂交
一、植物体细胞杂交的意义 二、原生质体诱导融合的方法和融合类型 三、杂种细胞的选择系统 四、体细胞杂种植株的鉴定 五、杂种细胞的发育及其特性
体细胞杂交（somatic hybridization）/ 原生质体融合(protoplast fusion)：
指把两种不同种或不同属、不同科生物的细胞的原生质 体分别分离出来,再用一定的技术而发生膜融合、胞质融合 和核融合并形成杂种细胞，进一步发育成完整植物体。也称 为细胞融合。
一、体细胞杂交的意义
原生质体(protoplast) ：去掉细胞壁的细胞或
是由质膜包裹的具有生活力的裸露细胞。
亚原生质体(subprotoplast)：在原生质体分离过程中，有
时会引起细胞内含物的断裂而形成一些较小的原生质体， 它可以具有细胞核或没有细胞核。
核质体(nuclearplast)：由原生质膜和薄层细胞质包围细
5.荧光素双醋酸酯染色法（0.01%）： 即FDA法， FDA能自由穿越完整细胞质膜，一旦进入原生 质体后受酯酶裂解形成有极性的物质—荧光素， 在紫外光照射下产生绿色荧光。
造粉体
五、影响原生质体数量和活力的因素
植物材料的类型及生理状态 酶的种类、浓度、组合及酶解时间、酶解方式等 渗透压稳定剂 质膜稳定剂 温度、光照及pH
纯化原生质体的方法 1.飘浮法 2.沉淀法 3.界面法
1.飘浮法
原理：利用原生质体和其他组分密度的不同，酶 解处理中使用相对分子质量较大的物质（蔗糖、 葡聚糖），离心后使原生质体漂浮在溶液表面， 细胞碎片等杂质下沉到管底的方法。
特点：操作简单，但数量上损失较多。
2.沉淀法
原理：酶解处理中使用相对分子质量较小的物 质（甘露醇），原生质体的比重大于溶液时，
第六章 植物原生质体培养与体细胞杂交
第一节 原生质体的分离和纯化 第二节 原生质体培养 第二节 植物体细胞杂交
第一节 原生质体的分离和纯化
一、植物原生质体的概念 二、原生质体的分离 三、原生质体的纯化 四、原生质体的活力测定 五、影响原生质体数量和活力的因素
一、植物原生质体的概念
1880年，Hanstein：质壁分离时，能够与细胞 壁分开的那部分细胞物质。
培养基
•与原生质体质膜稳定有利的物质 用量比较高。如CaCl2、KH2PO4
•渗透压的特点：含有高浓度的甘露醇，或 以葡萄糖和蔗糖代替甘露醇。应根据原生 质体再生细胞的发育状态和需要,调节各发 育时期的营养和碳源的成份。
环境条件
光照：原生质体分裂诱导不需要光，暗培养 温度：25℃～30℃ 湿度：100％
1972年：Carlson等获得第一个种间植物细胞杂 种（粉蓝烟草和郎氏烟草）。
1974年：Kao等建立了聚乙二醇（PEG）诱导植物 细胞融合的技术。
1978年：Melcher等获得了第一个属间细胞杂种（番茄+和 马铃薯）。 1981年：Zimmerman等发明了电融合仪，并首次提出了电融 合概念。 1990年：来源于体细胞杂交的第一个商品化的烟草栽培品 种释放。 1995年：获得第一个烟草-老鼠杂种植物。
⑤ 饲养层培养
方法一：X-射线杀死 原生质体，与生活力 正常的原生质体混合， 加入0.6%琼脂，制成 混合液，培养于培养 皿中。
方法二：X-射线杀死原生 质体，与0.6%琼脂混合， 在培养皿中铺成平板，作 为饲养层，再将生活力正 常的原生质体与0.6%琼脂 混合，培养于饲养层上。
3.培养条件
光照：新分离处理来的原生质体应在散射光 下或黑暗中培养。
例：
烟草叶肉原生质体培养中液体培养中渗透压的改变步骤
原生质体培养在8ml内含9%甘露醇的培养基中 ↓2周
加入2ml内含6%甘露醇 ↓2周
加入2ml内含3%甘露醇的培养基 ↓2周
加入2ml无甘露醇的培养基 ↓2周
将形成的较大的细胞团或愈伤组织转移到固体培养基 (内含2.0mg/L IAA和1mg/L 6-BA)上培养促进芽的形成
突破物种间生殖隔离，创造新物种 培育作物新种质和新品种 细胞质杂种的获得 细胞膜和细胞器行为的研究、细胞器的互作研究 染色体行为的研究
1960年：酶法分离原生质体的诞生，打开了利用 原生质体作为实验材料的许多重要研究领域。
1970年：Power首次用硝酸钠做诱变剂，可使燕 麦、玉米等根原生质体有较大量的融合。
常用材料： 幼叶、胚轴、子叶、茎、叶； 愈伤组织、胚状体和悬浮细胞。
（2）材料预处理
目的：改变细胞和细胞壁的生理状态，提高酶解效 率，提高原生质体的活力和分裂频率。
方法： 低温处理、 暗处理、 预培养等。
（3）酶解
分离原生质体的酶类 纤维素酶 半纤维素酶 果胶酶 胼胝质酶 蜗牛酶
2. 酶解法分离原生质体
借助酶解液的作用降解细胞壁，获得大量有活力的原生 质体的方法。
主要特点： （1）产量高，适用范围广； （2）对活细胞的损伤较轻； （3）原生质体可能会受到酶的某些不利影响。
（1）材料选择
选择依据： 具有良好的形态发生潜力； 量大、质地均一； 经酶解后原生质体稳定性好、活性高。
胞核形成的小原生质体。
胞质体（cytoplast）：不含细胞核而仅含有部分细胞质
的原生质体。
二、原生质体的分离
1.机械法 2.酶解法
1.机械法分离原生质体 借助利器（如刀等）或机
械磨损等措施使细胞壁破损， 促使原生质体释放的方法。
机械法分离原生质体的主要特点： 产量低； 高度液泡化的贮藏组织； 排除外加酶的有害影响。
酶解时间：30min～20h，一般<24小时。 温度：一般在25-28℃，兼顾原生质体及酶活性。 酶解过程：一般是在黑暗、静止条件下进行。 酶量：材料和酶量的比例一般为1g：10ml。
一些作物所用的酶解液
材料
CaCl·2H KH2P
2O
O4
MES (mg/
纤维素 酶%
(mg/L) (mg/L) L)
纤维素酶：
从绿色木霉中提取的一种复合酶制剂。作用是降解 纤维素，得到裸露的原生质体 。
如： Cellulase Onozuka R-10（Japan） Cellulase Onozuka RS （Japan） Cellulysin（USA） 纤维素酶EA-867（上海植生所）
果胶酶/离析酶： 是从根霉或曲霉中提取出来的，使细胞间
果胶 酶%
离析 酶%
半纤 维素 酶%
甘露醇 （mol/L）
pH
小麦悬 浮细胞
1470
95
600
RS 2.0
Y-23 0.2
—— ——
0.55
5.6
水稻悬 浮细胞
1470
95
600
R-10 0.1、
RS 0.5
Y-23 0.1
1.0
——
0.40
5.6
玉米悬 浮细胞
1470
95
600
RS 3.0
Y-23 0.1
主要用于分离花粉小孢子的原生质体。
蜗牛酶：
从蜗牛胃液中分离的酶的粗制剂，含多种解离酶，对孢 粉素、木质素有一定的分解能力，用于分离花粉母细胞、 四分体细胞或从较老的组织分离原生质体。
崩溃酶：
是一种粗制酶，同时具有纤维素酶和果胶酶等多种酶的活 性，在与果胶酶混合使用时，对分离培养细胞及根尖细胞 有加速解离的效果。
在低速下离心后原生质体沉到管底,其余细胞碎 片等物多数漂浮在溶液中。
特点：简单方便，丢失少，但纯度不够高。
3.界面法（梯度离心法）
原理：选两种不同渗透浓度的溶液，其中一种溶液的密度大 于原生质体的密度，另一种溶液的密度小于原生质体的密 度，经离心后使完整无损的原生质体处于两种溶液的界面 之间，而细胞碎片等杂质沉于管底，高度净化完整原生质 体可在这两相系统的界面上收集到。
酶液的配制及pH值
酶液的配制： 按已确定使用的酶和稳定剂的量称取酶和各种
稳定剂,并把它们逐步溶解，配制成酶液之后，酶 液用孔径为0.45μm的微孔滤膜过滤灭菌后备用。 酶液的pH值：
分离原生质体时一般将酶液的pH调节在5～6之 间。
酶浓度和酶解时间
酶浓度： 纤维素酶：一般为0.5～5％ 果胶酶：一般为0.1％～1％ 蜗牛酶和胼胝质酶：一般为0.5～2.0％
温度：一般25～30℃。 湿度：100%。
4、原生质体发育和植株再生
10h以上
再生细胞壁
植株再生
诱导器官发生 诱导形成胚状体
圆变为 椭圆形
荧光增白剂 （卡氏白)
愈伤组织
第一次分裂 第二次分裂
肉眼可见的细胞团
第N次分裂
2~3周，植板率
小细胞团
5. 原生质体培养过程中的管理
及时添加新鲜培养基 逐步降低培养基的渗透压 及时调整培养基中的激素成份
酶溶剂及其渗透压
酶溶剂：原生质体培养基 渗透压调节剂：
作用：代替细胞壁对原生质体起保护作用。 糖醇类：甘露醇、山梨醇、葡萄糖、蔗糖等。 使用浓度：0.2～0.8mol/L
质膜稳定剂：
溶液中加入一些盐类，可以保护细胞膜、提高 原生质体稳定性和活力。
常用的有：CaCl2（0.7～1.0mol/L）、KH2PO4、 KCl、MgSO4·7H2O、MES（2-氮吗啉乙烷磺酸） 和葡聚糖硫酸钾等。
原生质体活力＝ 有活力原生质体数 观察原生质体数 ×100％
1.形态识别：形态完整，富 含细胞质，颜色新鲜，正 常球形 。
2.相差显微镜观察法：观察 细胞质环流、核的正常与 否。
3.酚藏花红染色法（0.1%) ：有 活力原生质体不被染色，而无 活力的被染成红色 。
4.伊凡蓝染色法(0.025%) ：活 力受损或死细胞才能摄取这种 染料，活细胞不摄取。
（2）无机盐:
大量元素：一般较愈伤组织培养中的浓度低 NO3- / NH4+的比例高 Ca++ 、Mg++需求高
（3）有机成分：种类齐全
（4）激素：生长素与细胞分裂素对诱导细胞 壁的形成和细胞分裂、分化是必需的。
（5）pH值及灭菌：一般pH值以5.6-6.0为宜， 过滤灭菌。
2. 原生质体培养方法
↓2周 转移到MS基本培养基上促进苗产生根,最后长成完整植株
四、影响原生质体培养的主要因素
1、原生质体的活力 2、原生质体的起始密度 3、原生质体的营养和环境 4、基因型
1. 原生质体的活力
细胞壁降解酶的种类和组合 渗透压稳定剂 质膜稳定剂 温度因子的影响 植物材料的类型及生理状态
2. 原生质体的起始密度
密度过高时，有可能造成培养物营养不足或细胞 代谢产物过多而妨碍再生细胞的正常生长
密度过低时，再生细胞不能进行持续分裂
一般原生质体培养时，起始密度为104-105个 /ml，低密度下的培养使用较复杂的培养基和特殊 的培养方法。
3. 原生质体的营养和环境条件
•硝酸盐和铵盐比例高
特点：可以收集大量、纯净的原生质体，同时避免收集过程 中原生质体因相互积压而破碎。
常用系统：PEG（6000）-Ficoll（40000）系统，
甘露醇（182.17 ）-Ficoll系统，
蔗糖（342.3 ）-甘露醇系统等。
13%甘露醇溶液 25%蔗糖溶液
纯化后的原生质体
四、原生质体的活力测定
第二节 原生质体培养
一、原生质体培养的意义
1.建立单细胞无性系 2.为细胞融合奠定基础 3.遗传工程的理想受体 4.原生质体是多种基础理论研究的实验系统
二、原生质体培养
1. 培养基 （1）渗透压：与细胞渗透压等渗或稍低。 渗透压调节剂：甘露醇、山梨醇、蔗糖、麦芽糖 和葡萄糖等。 当原生质体再生细胞壁并开始分裂后,必须逐步 降低渗透压,直到与细胞培养基同样的水平。
0.5
0.5
Hale Waihona Puke 0.505.6 酶解方法
两步法：先用果胶酶离析植物组织后收 集植物细胞，洗涤后用纤维素酶解离细 胞壁。
一步法：把一定量纤维素酶和果胶酶组 成混合酶液,对材料进行一次性处理。
三、原生质体的纯化
纯化的含义： 一是从酶混合液中收集到的原生质体,在培养前必
须把酶液冲洗干净；二是得到纯净的原生质体。
的果胶质降解，把细胞从植物组织中单独释放出 来。 如：
Macerozyme R-10（Japan） Pectinase（USA） Pectolyase Y-23（Japan）
半纤维素酶：
主要由曲霉中提取，专门分解半纤维素。从愈伤组织分 离原生质体时，有时增加半纤维素酶。
如：Rhozyme HP-150（USA）、Hemicellulase（USA）
4. 基因型
植物形态发生受基因控制的，是一个复 杂的过程，不同基因型的原生质体的形态发 生能力不同。而且原生质体的不同生长发育 时期受不同基因所控制。
第三节、植物体细胞杂交
一、植物体细胞杂交的意义 二、原生质体诱导融合的方法和融合类型 三、杂种细胞的选择系统 四、体细胞杂种植株的鉴定 五、杂种细胞的发育及其特性
体细胞杂交（somatic hybridization）/ 原生质体融合(protoplast fusion)：
指把两种不同种或不同属、不同科生物的细胞的原生质 体分别分离出来,再用一定的技术而发生膜融合、胞质融合 和核融合并形成杂种细胞，进一步发育成完整植物体。也称 为细胞融合。
一、体细胞杂交的意义
原生质体(protoplast) ：去掉细胞壁的细胞或
是由质膜包裹的具有生活力的裸露细胞。
亚原生质体(subprotoplast)：在原生质体分离过程中，有
时会引起细胞内含物的断裂而形成一些较小的原生质体， 它可以具有细胞核或没有细胞核。
核质体(nuclearplast)：由原生质膜和薄层细胞质包围细
5.荧光素双醋酸酯染色法（0.01%）： 即FDA法， FDA能自由穿越完整细胞质膜，一旦进入原生 质体后受酯酶裂解形成有极性的物质—荧光素， 在紫外光照射下产生绿色荧光。
造粉体
五、影响原生质体数量和活力的因素
植物材料的类型及生理状态 酶的种类、浓度、组合及酶解时间、酶解方式等 渗透压稳定剂 质膜稳定剂 温度、光照及pH
纯化原生质体的方法 1.飘浮法 2.沉淀法 3.界面法
1.飘浮法
原理：利用原生质体和其他组分密度的不同，酶 解处理中使用相对分子质量较大的物质（蔗糖、 葡聚糖），离心后使原生质体漂浮在溶液表面， 细胞碎片等杂质下沉到管底的方法。
特点：操作简单，但数量上损失较多。
2.沉淀法
原理：酶解处理中使用相对分子质量较小的物 质（甘露醇），原生质体的比重大于溶液时，
第六章 植物原生质体培养与体细胞杂交
第一节 原生质体的分离和纯化 第二节 原生质体培养 第二节 植物体细胞杂交
第一节 原生质体的分离和纯化
一、植物原生质体的概念 二、原生质体的分离 三、原生质体的纯化 四、原生质体的活力测定 五、影响原生质体数量和活力的因素
一、植物原生质体的概念
1880年，Hanstein：质壁分离时，能够与细胞 壁分开的那部分细胞物质。
培养基
•与原生质体质膜稳定有利的物质 用量比较高。如CaCl2、KH2PO4
•渗透压的特点：含有高浓度的甘露醇，或 以葡萄糖和蔗糖代替甘露醇。应根据原生 质体再生细胞的发育状态和需要,调节各发 育时期的营养和碳源的成份。
环境条件
光照：原生质体分裂诱导不需要光，暗培养 温度：25℃～30℃ 湿度：100％
1972年：Carlson等获得第一个种间植物细胞杂 种（粉蓝烟草和郎氏烟草）。
1974年：Kao等建立了聚乙二醇（PEG）诱导植物 细胞融合的技术。
1978年：Melcher等获得了第一个属间细胞杂种（番茄+和 马铃薯）。 1981年：Zimmerman等发明了电融合仪，并首次提出了电融 合概念。 1990年：来源于体细胞杂交的第一个商品化的烟草栽培品 种释放。 1995年：获得第一个烟草-老鼠杂种植物。
⑤ 饲养层培养
方法一：X-射线杀死 原生质体，与生活力 正常的原生质体混合， 加入0.6%琼脂，制成 混合液，培养于培养 皿中。
方法二：X-射线杀死原生 质体，与0.6%琼脂混合， 在培养皿中铺成平板，作 为饲养层，再将生活力正 常的原生质体与0.6%琼脂 混合，培养于饲养层上。
3.培养条件
光照：新分离处理来的原生质体应在散射光 下或黑暗中培养。
例：
烟草叶肉原生质体培养中液体培养中渗透压的改变步骤
原生质体培养在8ml内含9%甘露醇的培养基中 ↓2周
加入2ml内含6%甘露醇 ↓2周
加入2ml内含3%甘露醇的培养基 ↓2周
加入2ml无甘露醇的培养基 ↓2周
将形成的较大的细胞团或愈伤组织转移到固体培养基 (内含2.0mg/L IAA和1mg/L 6-BA)上培养促进芽的形成
突破物种间生殖隔离，创造新物种 培育作物新种质和新品种 细胞质杂种的获得 细胞膜和细胞器行为的研究、细胞器的互作研究 染色体行为的研究
1960年：酶法分离原生质体的诞生，打开了利用 原生质体作为实验材料的许多重要研究领域。
1970年：Power首次用硝酸钠做诱变剂，可使燕 麦、玉米等根原生质体有较大量的融合。
常用材料： 幼叶、胚轴、子叶、茎、叶； 愈伤组织、胚状体和悬浮细胞。
（2）材料预处理
目的：改变细胞和细胞壁的生理状态，提高酶解效 率，提高原生质体的活力和分裂频率。
方法： 低温处理、 暗处理、 预培养等。
（3）酶解
分离原生质体的酶类 纤维素酶 半纤维素酶 果胶酶 胼胝质酶 蜗牛酶
2. 酶解法分离原生质体
借助酶解液的作用降解细胞壁，获得大量有活力的原生 质体的方法。
主要特点： （1）产量高，适用范围广； （2）对活细胞的损伤较轻； （3）原生质体可能会受到酶的某些不利影响。
（1）材料选择
选择依据： 具有良好的形态发生潜力； 量大、质地均一； 经酶解后原生质体稳定性好、活性高。
胞核形成的小原生质体。
胞质体（cytoplast）：不含细胞核而仅含有部分细胞质
的原生质体。
二、原生质体的分离
1.机械法 2.酶解法
1.机械法分离原生质体 借助利器（如刀等）或机
械磨损等措施使细胞壁破损， 促使原生质体释放的方法。
机械法分离原生质体的主要特点： 产量低； 高度液泡化的贮藏组织； 排除外加酶的有害影响。
酶解时间：30min～20h，一般<24小时。 温度：一般在25-28℃，兼顾原生质体及酶活性。 酶解过程：一般是在黑暗、静止条件下进行。 酶量：材料和酶量的比例一般为1g：10ml。
一些作物所用的酶解液
材料
CaCl·2H KH2P
2O
O4
MES (mg/
纤维素 酶%
(mg/L) (mg/L) L)
纤维素酶：
从绿色木霉中提取的一种复合酶制剂。作用是降解 纤维素，得到裸露的原生质体 。
如： Cellulase Onozuka R-10（Japan） Cellulase Onozuka RS （Japan） Cellulysin（USA） 纤维素酶EA-867（上海植生所）
果胶酶/离析酶： 是从根霉或曲霉中提取出来的，使细胞间
果胶 酶%
离析 酶%
半纤 维素 酶%
甘露醇 （mol/L）
pH
小麦悬 浮细胞
1470
95
600
RS 2.0
Y-23 0.2
—— ——
0.55
5.6
水稻悬 浮细胞
1470
95
600
R-10 0.1、
RS 0.5
Y-23 0.1
1.0
——
0.40
5.6
玉米悬 浮细胞
1470
95
600
RS 3.0
Y-23 0.1