拟南芥MeIAA抗性突变体的筛选和初步图位克隆分析(1)

植物学报Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｂｕｌｌｅｔｉｎ　ｏｆ　Ｂｏｔａｎｙ ２００９，　４４　（１）：　５２−５８，　ｗｗｗ．ｃｈｉｎｂｕｌｌｂｏｔａｎｙ．ｃｏｍ
收稿日期：　２００８－０６－２２；　接受日期：　２００８－０６－２６
基金项目：　国家自然科学基金（Ｎｏ．　３０６２５００２和Ｎｏ．　３０６２８０１２）†共同第一作者。

＊　通讯作者。

Ｅ－ｍａｉｌ：　ｑｕｌｊ＠ｐｋｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
．研究论文．
拟南芥　ＭｅＩＡＡ抗性突变体的筛选和初步图位克隆分析
侯仙慧１†，　丁茂予１†，　刘赛男１，　李林川１，　瞿礼嘉１，　２＊
１
北京大学生命科学学院，　北京大学－耶鲁大学植物分子遗传和农业生物技术联合研究中心，　蛋白质工程和植物基因工程国家重点实验
室，　北京１００８７１；　２国家植物基因研究中心（北京），　北京１００１０１
摘要 生长素是最重要的植物激素之一，　参与了植物生长发育的各个方面。

植物体内游离的ＩＡＡ是生长素的主要活性形式，在ＩＡＡ甲基转移酶１（ＩＡＭＴ１）的作用下，　ＩＡＡ可以转变为ＩＡＡ甲酯　（ＭｅＩＡＡ）。

ＭｅＩＡＡ本身没有活性，　在植物体内的ＭｅＩＡＡ酯解酶作用下可以重新转变为ＩＡＡ。

　ＭｅＩＡＡ是非极性分子，　能够在植物体内自由扩散。

利用ＭｅＩＡＡ的这种特殊性质筛选突变体，　可以分离到ＭｅＩＡＡ代谢途径或者ＩＡＡ途径中新的成分。

我们对拟南芥种子进行ＥＭＳ诱变，　通过观察黑暗下下胚轴的生长情况，　筛选ＭｅＩＡＡ的抗性突变体。

我们成功分离到了８株可能的抗性突变体，　并对其中的一个Ｍｅｔｈｙｌ－ＩＡＡ　ｒｅｓｉｓｔａｎｔ　１　（ｍｉｒ１）　突变体进行了深入分析。

ＭｅＩＡＡ抗性突变体的筛选将为进一步了解ＭｅＩＡＡ的代谢、ＩＡＡ稳态调控和响应机理提供新的材料。

关键词 生长素，　图位克隆，　ＭｅＩＡＡ，　抗性突变体
侯仙慧，　丁茂予，　刘赛男，　李林川，　瞿礼嘉　（２００９）．　拟南芥　ＭｅＩＡＡ抗性突变体的筛选和初步图位克隆分析．　植物学报　４４，　５２−５８．
生长素（ａｕｘｉｎ）是由荷兰科学家Ｆ．　Ｗ．　Ｗｅｎｔ通过燕麦胚芽鞘弯曲实验法　（Ａｖｅｎａ　ｃｕｒｖａｔｕｒｅ　ｔｅｓｔ）　首次分离出来的（Ｗｅｎｔ，　１９２６）。

随后人们提取并鉴定得到了第１种生长素——吲哚－３－乙酸（ＩＡＡ）。

大量的实验表明ＩＡＡ在高等植物中广泛存在，　是植物体内主要的生长素（Ｔｅａｌｅ　ｅｔ　ａｌ．，　２００６）。

ＩＡＡ调控植物体内生长发育的许多过程，　如促进侧根形成、维管组织分化、胚胎发育、顶端优势及植物向性反应等（Ｗｏｏｄｗａｒｄ　ａｎｄ　Ｂａｒｔｅｌ，２００５ａ）。

　生长素在体内主要通过色氨酸依赖途径进行生物合成，　可以与糖、氨基酸、肽以及醇形成缀合物进行贮存或运输，　也可以通过氧化失去激素活性　（Ｌｊｕｎｇ　ｅｔａｌ．，　２００１）。

　生长素是一种极性分子，　是目前发现的唯一需要极性运输的激素，　ＰＩＮ蛋白家族是主要的生长素输出载体，　而ＡＵＸ１蛋白是生长素输入载体，　ＰＩＮ和ＡＵＸ１蛋白在细胞膜上具有不对称分布，　受到囊泡运输的调控（Ｌｅｙｓｅｒ，　２００３；　Ｈｏｂｂｉｅ，　２００６）。

　生长素信号转导主要是由ＳＣＦＴＩＲ１介导的蛋白泛素降解途径，　高浓度的ＩＡＡ促进其受体ＴＩＲ１和转录抑制因子ＡＵＸ／ＩＡＡ家族蛋白的
结合而使ＡＵＸ／ＩＡＡ家族蛋白泛素化降解，　从而解除了对转录因子ＡＲＦ家族蛋白的转录抑制，　进而激活或者抑制下游基因的表达　（Ｗｏｏｄｗａｒｄ　ａｎｄ　Ｂａｒｔｅｌ，　２００５ｂ；　Ｔａｎｅｔ　ａｌ．，　２００７）。

本实验室发现拟南芥ＩＡＡ　ｃａｒｂｏｘｙｌ　ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎ－ｓｆｅｒａｓｅ１（ＩＡＭＴ１）基因的一个功能获得性突变体ｉａｍｔ１－Ｄ具有叶片上卷表型　（Ｑｉｎ　ｅｔ　ａｌ．，　２００５）。

　当通过ＲＮＡｉ降低ＩＡＭＴ１的表达时，　转基因植株叶片下卷。

而且，ＩＡＭＴ１的表达在叶片发育过程中受到严格的时空调控。

叶片卷曲程度和ＩＡＭＴ１表达水平相关表明，　生长素的稳态调控对于扁平叶片的形成起重要作用　（Ｑｉｎ　ｅｔ　ａｌ．，２００５）。

　在体外，　ＩＡＭＴ１蛋白能够把ＩＡＡ转化为ＩＡＡ甲酯　（ＭｅＩＡＡ）。

Ｌｉ等通过研究ａｕｘｉｎ　ｒｅｓｉｓｔａｎｔ　１　（ａｕｘ１）突变体对ＭｅＩＡＡ、ＩＡＡ和ＮＡＡ的不同响应，　发现ＭｅＩＡＡ与其它ＩＡＡ缀合物一样，　也是没有活性的。

但是由于ＭｅＩＡＡ是非极性的，　所以其进入细胞同ＮＡＡ一样不需要载体协助　（Ｌｉ　ｅｔ　ａｌ．，　２００８ａ）。

ＭｅＩＡＡ的运动性暗示它与ＩＡＡ糖、氨基酸缀合物不同，　不是作为贮存或者降
５３侯仙慧等：　拟南芥　ＭｅＩＡＡ抗性突变体的筛选和初步图位克隆分析
解的形式，　而是通过微调ＩＡＡ的分布，　从而影响植物发育过程，　如叶片的形态等　（Ｌｉ　ｅｔ　ａｌ．，　２００８ａ）。

Ｙａｎｇ等研究表明ＭｅＩＡＡ进入细胞后，　通过细胞内的一个或几个可能的酯解酶酯解后重新转变为ＩＡＡ起作用（Ｙａｎｇ　ｅｔａｌ．，　２００８）。

他们鉴定了拟南芥ＡｔＭＥＳ１７基因，　其编码一个ＭｅＩＡＡ酯解酶，　在体外该蛋白能够将ＭｅＩＡＡ转变为ＩＡＡ。

ＡｔＭＥＳ１７的缺失突变体表现出对ＭｅＩＡＡ的显著抗性，　而过量表达ＡｔＭＥＳ１７的转基因植株则对ＭｅＩＡＡ具有更强的敏感性，　同时这两种株系对ＩＡＡ的响应正常　（Ｙａｎｇ　ｅｔ　ａｌ．，　２００８）。

利用激素突变体来研究激素代谢及其分子机制已有不少成功的范例，　突变体分析不仅可以对某一复杂生物学过程提出合理的假设，　而且可更进一步精确找出研究生理和发育问题的新方法。

由于在黑暗下ＭｅＩＡＡ比ＩＡＡ具有更强的下胚轴抑制能力，　利用ＭｅＩＡＡ筛选生长素抗性突变体将更加简单易行。

本实验通过筛选经ＥＭＳ诱变产生的拟南芥突变体种子，　外源施加一定浓度的ＭｅＩＡＡ，　在黑暗下观察下胚轴生长，　筛选对ＭｅＩＡＡ具有抗性的突变体，　并做进一步的遗传和基因定位分析，　为深入了解ＩＡＡ的甲基化过程在ＩＡＡ信号转导和稳态调控中的作用提供新的方法。

１ 材料与方法
１．１ 植物材料和培养条件
本研究中所用的拟南芥（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ）除用于图位克隆的为Ｌａｎｄｓｂｅｒｇ　（Ｌｅｒ）　野生型外，　其余的都为Ｃｏ－ｌｕｍｂｉａ　（Ｃｏｌ－０）　背景。

处理方法和培养条件见Ｌｉ等论文　（Ｌｉ　ｅｔ　ａｌ．，　２００８ｂ）。

１．２ ＥＭＳ诱变
将２．５　ｇ拟南芥种子均分在２个５０　ｍＬ的Ｆａｌｃｏｎ试管中，　加入４０　ｍＬ去离子水室温过夜。

向每个试管中加入１２０　µＬ　ＥＭＳ　（Ｓｉｇｍａ），　使ＥＭＳ终浓度为０．３％。

在通风橱内翻转摇匀１５个小时。

再用４０　ｍＬ去离子水漂洗种子６次以上，　最后将种子用０．１％　琼脂均匀悬浮，　铺在约２０个培养箱中。

单箱收获得到Ｍ２代种子，　编号，室温保存。

１．３ ＭｅＩＡＡ抗性突变体的筛选
将表面消毒后的种子点播在含有２．５　µｍｏｌ
．Ｌ－１　ＭｅＩＡＡ（Ｓｉｇｍａ）的ＭＳ培养基上，　用锡箔纸包裹避光。

４°C春化２天，　然后放入２２°C培养箱中培养４天，　挑取下胚轴长度远远超过平均值的小苗（图１），　转移到ＭＳ培养基上，恢复培养５天，　再转移到土中。

一个月后单收种子，　在ＭｅＩＡＡ培养基上鉴定该抗性是否可以遗传。

１．４ 突变体温度转移实验
将种子表面消毒后，　铺在ＭＳ培养基上，　４°C春化２天，然后转到２２°C，　水平萌发３天。

转移大约２０棵小苗到新的ＭＳ平板上，　共转移２块。

将其中一块仍然放在２２°C条件下，　另一块转至２９°C，　垂直培养３天。

比较２个生长条件下的植株下胚轴长度，　并统计。

１．５ 图位克隆
图位克隆（ｍａｐ－ｂａｓｅｄ　ｃｌｏｎｉｎｇ）参考Ｌｕｋｏｗｉｔｚ　等（２０００）描述的方法。

实验中所用Ｍａｒｋｅｒ均来自拟南芥网站（ｗｗｗ．ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ．ｏｒｇ）。

２ 结果与分析
２．１ＭｅＩＡＡ抗性突变体筛选条件的确定
在进行大规模突变体筛选之前，　我们首先比较了ＩＡＡ和ＭｅＩＡＡ对黑暗下生长的拟南芥幼苗的下胚轴抑制程度。

在０．１－２５　µｍｏｌ
．Ｌ－１浓度范围内，　随着激素浓度的升高，ＩＡＡ和ＭｅＩＡＡ对下胚轴的抑制程度都增强，　但是ＭｅＩＡＡ的抑制能力更强，　两者在２．５－１０　µｍｏｌ
．Ｌ－１范围内差异最为显著（图１Ａ）。

在２．５　µｍｏｌ
．Ｌ－１　ＭｅＩＡＡ浓度下，　拟南芥幼苗下胚轴长约为ＭＳ培养基上的１０％。

在大于２．５　µｍｏｌ
．Ｌ－１的浓度下，　ＭｅＩＡＡ对下胚轴的抑制程度随浓度变化很小（图１Ａ）。

综合上述两种现象，　我们选取２．５　µｍｏｌ
．Ｌ－１的ＭｅＩＡＡ处理经ＥＭＳ诱变的Ｍ１代种子进行筛选。

野生型幼苗在２．５　µｍｏｌ
．Ｌ－１　ＭｅＩＡＡ培养基上暗培
54植物学报 ４４（１） ２００９
养３天后，　下胚轴和主根生长几乎完全被抑制，　顶端钩消失（图１Ｂ）。

将下胚轴长至少为野生型２倍以上的幼苗定义为候选ＭｅＩＡＡ抗性突变体（ｃａｎｄｉｄａｔｅ　ＭｅＩＡＡ　ｒｅ－ｓｉｓｔａｎｔ　ｍｕｔａｎｔｓ）。

通过这种方法，　总共得到了约１５０个候选突变体单株。

然后将候选突变体转移到培养箱中，　单株收种子后，　重新在２．５　µｍｏｌ．Ｌ－１　ＭｅＩＡＡ培养基上暗处理３天，　验证其对ＭｅＩＡＡ抗性表型是否可以遗传。

最终共得到８株ＭｅＩＡＡ抗性突变体，　其中ｍｉｒ１、ｍｉｒ２、ｍｉｒ３和ｍｉｒ４如图１Ｂ所示。

ｍｉｒ１、ｍｉｒ２和ｍｉｒ３的下胚轴和主根对ＭｅＩＡＡ具有很强的抗性，　而ｍｉｒ４仅在下胚轴对ＭｅＩＡＡ具有中度抗性（图１Ｂ）。

２．２
部分ＭｅＩＡＡ抗性突变体对ＩＡＡ也具有抗性
由于ＭｅＩＡＡ是ＩＡＡ的非活性形式，　需要在体内的酯解酶作用下重新转变为ＩＡＡ起作用　（Ｌｉ　ｅｔ　ａｌ．，　２００８ａ；　Ｙａｎｇｅｔ　ａｌ．，　２００８）。

那么，　ＭｅＩＡＡ抗性突变体绝大部分都应表现出对ＩＡＡ的抗性。

和预期相一致，　ｍｉｒ１、ｍｉｒ２和ｍｉｒ３等在光下对ＩＡＡ也表现出了一定程度的抗性
（图２Ａ）。

有趣的是，　ｍｉｒ４在光下并没有显示出对ＩＡＡ的抗性（数据未显示），　推测它与ｍｉｒ１、ｍｉｒ２及ｍｉｒ３等具有不同的抗性机制。

拟南芥幼苗从正常温度（２２°C ）转移到高温下（２９°C ）生长时，　下胚轴会比正常条件下显著伸长　（Ｇｒａｙ　ｅｔ　ａｌ．，１９９８）。

进一步研究发现该现象主要是由于下胚轴中生长素的含量提高造成的，　而且该现象是生长素特异的反应。

当突变体生长素稳态调控或信号通路出现缺陷时，其下胚轴不能伸长　（Ｇｒａｙ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９８）。

　将野生型拟南芥和ＭｅＩＡＡ抗性突变体同时在２２°C 和２９°C 下培养，　在２９°C 下，　ＷＴ的下胚轴长度是２２°C 下的２倍左右，　而ｍｉｒ１、ｍｉｒ２和ｍｉｒ３的下胚轴没有明显的伸长（图２Ｂ），　暗示其体内生长素途径出现缺陷。

然而，　ｍｉｒ４的下胚轴能够正常响应高温变化，　进一步暗示其抗性机制和其它突变体不同。

２．３
ｍｉｒ１突变体的表型和遗传学分析
挑取ｍｉｒ１突变体作进一步表型分析。

在２．５　µｍｏｌ．Ｌ－１
图１ ＭｅＩＡＡ抗性突变体的获得
（Ａ）　黑暗下ＩＡＡ和ＭｅＩＡＡ对拟南芥幼苗下胚轴抑制曲线；　（Ｂ）　ＭｅＩＡＡ抗性突变体Ｆｉｇｕｒｅ　１ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃａｎｄｉｄａｔｅ　ＭｅＩＡＡ　ｒｅｓｉｓｔａｎｔ　ｍｕｔａｎｔｓ
（Ａ）　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ｃｕｒｖａｔｕｒｅ　ｏｆ　ｈｙｐｏｃｏｔｙｌｓ　ｂｙ　ＩＡＡ　ａｎｄ　ＭｅＩＡＡ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｄａｒｋ；　（Ｂ）　ＭｅＩＡＡ　ｒｅｓｉｓｔａｎｔ　ｍｕｔａｎｔｓ，　ｍｉｒ１，　ｍｉｒ２，　ｍｉｒ３　ａｎｄ　
ｍｉｒ４
５５
侯仙慧等：　拟南芥　ＭｅＩＡＡ抗性突变体的筛选和初步图位克隆分析
图２ ＭｅＩＡＡ抗性突变体生长素相关表型分析
（Ａ）　ＭｅＩＡＡ抗性突变体同样具有对ＩＡＡ的抗性；　（Ｂ）　ＭｅＩＡＡ突变体下胚轴在不同温度下的伸长情况
Ｆｉｇｕｒｅ　２ Ａｕｘｉｎ　ｒｅｌａｔｅｄ　ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ　ｏｆ　ＭｅＩＡＡ　ｒｅｓｉｓｔａｎｔ　ｍｕｔａｎｔｓ
（Ａ）　ＭｅＩＡＡ　ｒｅｓｉｓｔａｎｔ　ｍｕｔａｎｔｓ　ａｌｓｏ　ｓｈｏｗ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｔｏ　ＩＡＡ；　（Ｂ）　Ｈｙｐｏｃｏｔｙｌ　ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＭｅＩＡＡ　ｒｅｓｉｓｔａｎｔ　ｍｕｔａｎｔｓ　ａｔ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓ
ＭｅＩＡＡ培养基上黑暗下处理３天后，　ｍｉｒ１突变体的下胚轴和主根表现出显著的抗性（图３Ａ）。

有趣的是，　ｍｉｒ１突变体在ＭＳ培养基上黑暗下培养３天后，　下胚轴比野生型短，　顶端钩消失（图３Ｂ）。

在光下，　ｍｉｒ１突变体的子叶稍微上卷（图３Ｃ），　侧根数目显著少于野生型（图３Ｄ）。

ｍｉｒ１突变体成株表现出叶柄短，　叶片上卷（图３Ｅ），　而且植株矮化，　分枝数多于野生型，　但花和角果正常（图３Ｆ）。

为了研究ｍｉｒ１突变的分子本质，　我们对ｍｉｒ１突变体进行了深入的遗传学分析。

首先将ｍｉｒ１和Ｃｏｌ－０进行回交，　Ｆ１代幼苗在ＭｅＩＡＡ培养基上出现了抗性和感性的分离，　而且分离比例约为１：１　（表１），　暗示该突变是由一个显性单基因控制的。

同样的结果也出现在ｍｉｒ１和Ｌｅｒ杂交的Ｆ１代中（表１）。

单收ｍｉｒ１和Ｌｅｒ杂交的Ｆ１代种子，　点播后观察Ｆ２代的分离比，　发现抗性和感性植株的分离比约为３：１（表１），　进一步暗示ｍｉｒ１突变是由显性单基因突变所致。

２．４ ｍｉｒ１突变体的初步图位克隆
我们利用图位克隆方法对ｍｉｒ１突变进行基因定位。

提取突变体和Ｌｅｒ杂交Ｆ２代中的野生型表型苗的ＤＮＡ，　利用ＴＡＩＲ网站上的引物（ｍａｒｋｅｒ）信息，　进行初定位（ｆｉｒｓｔ－ｐａｓｓ　ｃｌｏｎｉｎｇ）。

经过初定位，　发现ｍｉｒ１突变与第１条染色体上端Ｍａｒｋｅｒ　ｎｇａ６３具有明显连锁，　重组率约为１５％；　在ｎｇａ６３两端分别设计引物进一步定位，　发现突变位点可能处于更靠近染色体顶端的２个ＭａｒｋｅｒＮＦ２１Ｂ７和ＮＴ１Ｇ１１之间。

这一位置具有已知的４个
表１ ｍｉｒ１突变体遗传学分析
Ｔａｂｌｅ　１ Ｇｅｎｅｔｉｃ　ｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＭｅＩＡＡ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｉｎ　ｍｉｒ１
Ｎｏ．　ｏｆ　ｐｌａｎｔｓ
ＣｒｏｓｓＲｅｓｉｓｔａｎｔＳｅｎｓｉｔｉｖｅＴｏｔａｌＸ２０．９５
ｍｉｒ１ × Ｃｏｌ－０　（Ｆ１）２２２６４８－
ｍｉｒ１ × Ｌｅｒ　（Ｆ１）３２３０６２－
ｍｉｒ１ × Ｌｅｒ　（Ｆ２）２７８９８３７６
０．２３　（３：１）
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图３ ｍｉｒ１表型分析
（Ａ）　黑暗下在含有２．５　µｍｏｌ．Ｌ－１ ＭｅＩＡＡ的培养基上生长３天的野生型和ｍｉｒ１的表型；
（Ｂ）　黑暗下在ＭＳ培养基上生长３天的野生型和ｍｉｒ１的表型；（Ｃ）　光下在ＭＳ培养基上生长７天的野生型和ｍｉｒ１的表型；（Ｄ）　２周大小的野生型和ｍｉｒ１的侧根表型；（Ｅ）　４周大小的野生型和ｍｉｒ１的叶片表型；（Ｆ）　６周大小的野生型和ｍｉｒ１的整体植株表型Ｂａｒ　＝　５　ｍｍ
Ｆｉｇｕｒｅ　３ Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ　ｏｆ　ｍｉｒ１
（Ａ）　ＷＴ　ａｎｄ　ｍｉｒ１　ｇｒｅｗ　ｏｎ　２．５　µｍｏｌ．Ｌ－１　ＭｅＩＡＡ　ｆｏｒ　３　ｄ　ｉｎ　ｔｈｅｄａｒｋ；
（Ｂ）　ＷＴ　ａｎｄ　ｍｉｒ１　ｇｒｅｗ　ｏｎ　ＭＳ　ｆｏｒ　３　ｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｄａｒｋ；（Ｃ）　ＷＴ　ａｎｄ　ｍｉｒ１　ｇｒｅｗ　ｏｎ　ＭＳ　ｆｏｒ　７　ｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｌｉｇｈｔ；
（Ｄ）　Ｌａｔｅｒａｌ　ｒｏｏｔ　ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ　ｏｆ　ＷＴ　ａｎｄ　ｍｉｒ１　ｏｆ　ｔｗｏ　ｗｅｅｋｓ　ｏｌｄ；（Ｅ）　Ｌｅａｆ　ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ　ｏｆ　ＷＴ　ａｎｄ　ｍｉｒ１　ｏｆ　ｆｏｕｒ　ｗｅｅｋｓ　ｏｌｄ；（Ｆ）　Ｗｈｏｌｅ　ｐｌａｎｔ　ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ　ｏｆ　ＷＴ　ａｎｄ　ｍｉｒ１　ｏｆ　ｓｉｘ　ｗｅｅｋｓ　ｏｌｄＢａｒ　＝　５　ｍｍ
图４ ｍｉｒ１在第１条染色体上端的初定位信息
图中由上至下依次标明所用Ｍａｒｋｅｒ的名称，　染色体序号，　各Ｍａｒｋｅｒ距该染色体最上端的物理距离，　各Ｍａｒｋｅｒ对应位置发生重组的植株数目及相应所检测染色体的数目，　最下方线段表示推测的突变位点所在位置。

Ｆｉｇｕｒｅ　４ Ｐｒｉｍａｒｙ　ｍａｐｐｉｎｇ　ｆｏｒ　ｍｉｒ１　ｏｎ　Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ　Ｉ
Ｔｈｅ　ｓｕｐｐｏｓｅｄ　ｍａｐｐｉｎｇ　ｐｏｓｉｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍｉｒ１
　ｉｓ　ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｎｏ．　ｏｆ　ｅａｃｈ　ｍａｒｋｅｒ　ｏｎ　ｔｈｅ　Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ　Ｉ．
５７侯仙慧等：　拟南芥　ＭｅＩＡＡ抗性突变体的筛选和初步图位克隆分析
Ａｕｘ／ＩＡＡ基因，　分别是ＩＡＡ３、ＩＡＡ１０、ＩＡＡ１２和ＩＡＡ１７。

我们将通过进一步精细定位和测序确定突变位点。

３ 讨论
对于大规模的筛选工作，　筛选方法是突变体筛选成败的关键。

越是专一的筛选条件，　就越有机会直接获得所期待的突变体。

常用的方法有正筛选和负筛选。

正筛选是设计一定的培养基或培养条件，　使得野生型不可以生长但突变体能生长；　而负筛选是野生型可以生长但突变体不能生长。

正筛选通常得到的是抗性突变体，　而负筛选通常得到超敏感突变体。

本研究中我们通过正筛选方法成功得到了ＭｅＩＡＡ抗性突变体。

该方法的２个关键点是ＭｅＩＡＡ的浓度和筛选指标的确定。

通过绘制ＭｅＩＡＡ和ＩＡＡ黑暗下对野生型幼苗下胚轴的抑制曲线，我们确定了２．５　µｍｏｌ
．Ｌ－１是ＭｅＩＡＡ和ＩＡＡ在区分度和对下胚轴的抑制程度上最佳的选择浓度。

下胚轴长短这一筛选指标，　简单易行，　为我们大规模筛选突变体带来很大方便，　能够满足饱和筛选的条件。

ＭｅＩＡＡ是在　ＩＡＡ羧甲基转移酶１　（ＩＡＭＴ１）的作用下由ＩＡＡ甲酯化生成（Ｑｉｎ　ｅｔ　ａｌ．，　２００５），　是非极性的ＩＡＡ缀合物，　能够在体内自由扩散。

同时，　ＭｅＩＡＡ是一种非活性的ＩＡＡ形式，　需要通过体内１个或多个ＭｅＩＡＡ酯解酶的作用重新转变为ＩＡＡ　（Ｙａｎｇ　ｅｔ　ａｌ．，　２００８）。

这两个性质导致ＭｅＩＡＡ具有不同于ＩＡＡ以及ＩＡＡ的其它缀合物的化学特性（Ｌｉ　ｅｔ　ａｌ．，　２００８ａ）， 所以用ＭｅＩＡＡ来筛选抗性突变体具有比ＩＡＡ更大的优势。

首先，　ＭｅＩＡＡ可以自由扩散，　所以筛选中能够排除部分生长素极性运输的影响，　得到的突变体可能仅与生长素的信号相关。

另一方面，　在黑暗下，　ＭｅＩＡＡ对下胚轴的抑制程度强于ＩＡＡ，　在ＩＡＡ筛选中的弱抗性突变体可能在ＭｅＩＡＡ上表型更加明显，　所以通过ＭｅＩＡＡ筛选能够得到原来很难分离到的生长素信号突变体。

此外，　ＭｅＩＡＡ代谢相关基因的突变也有可能通过这种方法得到。

在分离到的８个突变体中，　ｍｉｒ１、ｍｉｒ２和ｍｉｒ３对ＭｅＩＡＡ和ＩＡＡ都表现出抗性，　暗示这３个突变体应该是普通的生长素抗性突变体。

ｍｉｒ１突变体具有明显的生长素相关发育缺陷，　如顶端钩消失、侧根少、叶片上卷表型。

图位克隆分析表明，　ｍｉｒ１突变定位在第１条染色体上端的ＮＴ１Ｇ１１　Ｍａｒｋｅｒ附近。

而在这个Ｍａｒｋｅｒ附近集中了ＩＡＡ３、ＩＡＡ１０、ＩＡＡ１２和ＩＡＡ１７　４个典型的Ａｕｘ／ＩＡＡ基因　（Ｌｅｙｓｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，　１９９６；　Ｔｉａｎ　ａｎｄ　Ｒｅｅｄ，１９９９；　Ｈａｍａｎｎ　ｅｔ　ａｌ．，　２００２）。

　根据ｍｉｒ１的叶片表型和这些基因的已有报道相比较，　推测ｍｉｒ１可能是ＩＡＡ３的突变。

进一步的测序和遗传学鉴定工作正在进行中。

而ｍｉｒ４突变体具有对ＭｅＩＡＡ特异抗性，　而且这种抗性只特异地出现在下胚轴，　暗示该突变可能是ＭｅＩＡＡ特异突变，　为我们揭示ＭｅＩＡＡ代谢和活性调控提供了良好的材料。

参考文献
Ｇｒａｙ　ＷＭ，　Ｏｓｔｉｎ　Ａ，　Ｓａｎｄｂｅｒｇ　Ｇ，　Ｒｏｍａｎｏ　ＣＰ，　Ｅｓｔｅｌｌｅ　Ｍ　（１９９８）．Ｈｉｇｈ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ　ｐｒｏｍｏｔｅｓ　ａｕｘｉｎ－ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｈｙｐｏｃｏｔｙｌ　ｅｌｏｎｇａ－ｔｉｏｎ　ｉｎ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ．　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　９５，　７１９７－７２０２．Ｈａｍａｎｎ　Ｔ，　Ｂｅｎｋｏｖａ　Ｅ，　Ｂａｕｒｌｅ　Ｉ，　Ｋｉｅｎｔｚ　Ｍ，　Ｊｕｒｇｅｎｓ　Ｇ　（２００２）．Ｔｈｅ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ＢＯＤＥＮＬＯＳ　ｇｅｎｅ　ｅｎｃｏｄｅｓ　ａｎ　ａｕｘｉｎ　ｒｅ－ｓｐｏｎｓｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ　ＭＯＮＯＰＴＥＲＯＳ－ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｅｍｂｒｙｏｐａｔｔｅｒｎｉｎｇ．　Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ　１６，　１６１０－１６１５．
Ｈｏｂｂｉｅ　ＬＪ　（２００６）．　Ａｕｘｉｎ　ａｎｄ　ｃｅｌｌ　ｐｏｌａｒｉｔｙ：　ｔｈｅ　ｅｍｅｒｇｅｎｃｅ　ｏｆＡＸＲ４．　Ｔｒｅｎｄｓ　Ｐｌａｎｔ　Ｓｃｉ　１１，　５１７－５１８．
Ｌｅｙｓｅｒ　ＨＭ，　Ｐｉｃｋｅｔｔ　ＦＢ，　Ｄｈａｒｍａｓｉｒｉ　Ｓ，　Ｅｓｔｅｌｌｅ　Ｍ　（１９９６）．　Ｍｕ－ｔａｔｉｏｎｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ＡＸＲ３　ｇｅｎｅ　ｏｆ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｒｅｓｕｌｔ　ｉｎ　ａｌｔｅｒｅｄ　ａｕｘｉｎｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ　ｅｃｔｏｐｉｃ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ＳＡＵＲ－ＡＣ１ｐｒｏｍｏｔｅｒ．　Ｐｌａｎｔ　Ｊ　１０，　４０３－４１３．
Ｌｅｙｓｅｒ　Ｏ　（２００３）．　Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓｈｏｏｔ　ｂｒａｎｃｈｉｎｇ　ｂｙ　ａｕｘｉｎ．　ＴｒｅｎｄｓＰｌａｎｔ　Ｓｃｉ　８，　５４１－５４５．
Ｌｉ　Ｌ，　Ｈｏｕ　Ｘ，　Ｔｓｕｇｅ　Ｔ，　Ｄｉｎｇ　Ｍ，　Ａｏｙａｍａ　Ｔ，　Ｏｋａ　Ａ，　Ｇｕ　Ｈ，　ＺｈａｏＹ，　Ｑｕ　ＬＪ　（２００８ａ）．　Ｔｈｅ　ｐｏｓｓｉｂｌｅ　ａｃｔｉｏｎ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ　ｏｆ　ｉｎｄｏｌｅ－３－ａｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄ　ｍｅｔｈｙｌ　ｅｓｔｅｒ　ｉｎ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ．　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｐ　２７，５７５－５８４．
Ｌｉ　ＬＣ，　Ｑｉｎ　ＧＪ，　Ｔｓｕｇｅ　Ｔ，　Ｈｏｕ　ＸＨ，　Ｄｉｎｇ　ＭＹ，　Ａｏｙａｍａ　Ｔ，　Ｏｋａ　Ａ，Ｃｈｅｎ　Ｚ，　Ｇｕ　Ｈ，　Ｚｈａｏ　Ｙ，　Ｑｕ　ＬＪ　（２００８ｂ）．　ＳＰＯＲＯＣＹＴＥＬＥＳＳｍｏｄｕｌａｔｅｓ　ＹＵＣＣＡ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｔｏ　ｒｅｇｕｌａｔｅ　ｔｈｅ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｆｌａｔｅｒａｌ　ｏｒｇａｎｓ　ｉｎ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ．　Ｎｅｗ　Ｐｈｙｔｏｌ （ｉｎ　ｐｒｅｓｓ）
Ｌｊｕｎｇ　Ｋ，　Ｂｈａｌｅｒａｏ　ＲＰ，　Ｓａｎｄｂｅｒｇ　Ｇ　（２００１）．　Ｓｉｔｅｓ　ａｎｄ　ｈｏｍｅｏ－ｓｔａｔｉｃ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｏｆ　ａｕｘｉｎ　ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｉｎ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｄｕｒｉｎｇ　ｖｅｇ－
58植物学报 ４４（１） ２００９
Isolation and Positional Cloning of Methyl-Indole-3-Acetic
Acid Resistant Mutants in Arabidopsis
Xianhui Hou 1†, Maoyu Ding 1†, Sainan Liu 1, Linchuan Li 1, Lijia Qu 1, 2*
1
National Laboratory for Protein Engineering and Plant Genetic Engineering, Peking-Yale Joint Research Center for Plant Molecu-lar Genetics and AgroBiotechnology, College of Life Sciences, Peking University, Beijing 100871, China; 2The National Plant
Gene Research Center (Beijing), Beijing 100101, China
Abstract Auxin is one of the most important plant hormones in that it regulates almost all aspects of plant growth and development. In plants, free indole-3-acetic acid (IAA) is the major active auxin and can be converted to methyl-IAA (MeIAA) with the activity of an IAA carboxyl methyltransferase 1 (IAMT1). However, MeIAA is also an inactive form of IAA and can be converted to IAA catalyzed by several esterases. MeIAA is a non-polar IAA form and can diffuse between cells, so MeIAA is suitable for screening new components in MeIAA metabolism or IAA biology. Here, we screened ethyl-methane-sulphonate (EMS)-mutagensis seedlings on MeIAA medium in the dark, with longer hypocotyls used as a criterion. We isolated 8 putative MeIAA-resistant mutants and carried out further experiments on one mutant, mir1. These new mutants will help shed light on MeIAA metabolism and the action mechanism of IAA.
Key words auxin, map-based cloning, MeIAA, resistant mutant
Ｈｏｕ　ＸＨ，　Ｄｉｎｇ　ＭＹ，　Ｌｉｕ　ＳＮ，　Ｌｉ　ＬＣ，　Ｑｕ　ＬＪ　（２００９）．　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｏｆ　ｍｅｔｈｙｌ－ｉｎｄｏｌｅ－３－ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ　ｒｅｓｉｓｔａｎｔ　ｍｕｔａｎｔｓ　ｉｎＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ．　Ｃｈｉｎ　Ｂｕｌｌ　Ｂｏｔ　４４，　５２−５８．
†
　Ｔｈｅｓｅ　ａｕｔｈｏｒｓ　ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｄ　ｅｑｕａｌｌｙ　ｉｎ　ｔｈｉｓ　ｐａｐｅｒ．
＊　Ａｕｔｈｏｒ　ｆｏｒ　ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅ．　Ｅ－ｍａｉｌ：　ｑｕｌｊ＠ｐｋｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
（责任编辑：　刘慧君）
ｅｔａｔｉｖｅ　ｇｒｏｗｔｈ．　Ｐｌａｎｔ　Ｊ　２８，　４６５－４７４．
Ｌｕｋｏｗｉｔｚ　Ｗ，　Ｇｉｌｌｍｏｒ　ＣＳ，　Ｓｃｈｅｉｂｌｅ　ＷＲ　（２０００）．　Ｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ　ｃｌｏｎ－
ｉｎｇ　ｉｎ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ．　Ｗｈｙ　ｉｔ　ｆｅｅｌｓ　ｇｏｏｄ　ｔｏ　ｈａｖｅ　ａ　ｇｅｎｏｍｅ　ｉｎｉｔｉａ－ｔｉｖｅ　ｗｏｒｋｉｎｇ　ｆｏｒ　ｙｏｕ．　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ　１２３，　７９５－８０５．
Ｑｉｎ　Ｇ，　Ｇｕ　Ｈ，　Ｚｈａｏ　Ｙ，　Ｍａ　Ｚ，　Ｓｈｉ　Ｇ，　Ｙａｎｇ　Ｙ，　Ｐｉｃｈｅｒｓｋｙ　Ｅ，　Ｃｈｅｎ
Ｈ，　Ｌｉｕ　Ｍ，　Ｃｈｅｎ　Ｚ，　Ｑｕ　ＬＪ　（２００５）．　Ａｎ　ｉｎｄｏｌｅ－３－ａｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄｃａｒｂｏｘｙｌ　ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ　ｒｅｇｕｌａｔｅｓ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｌｅａｆｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　１７，　２６９３－２７０４．
Ｔａｎ　Ｘ，　Ｃａｌｄｅｒｏｎ－Ｖｉｌｌａｌｏｂｏｓ　ＬＩ，　Ｓｈａｒｏｎ　Ｍ，　Ｚｈｅｎｇ　Ｃ，　Ｒｏｂｉｎｓｏｎ
ＣＶ，　Ｅｓｔｅｌｌｅ　Ｍ，　Ｚｈｅｎｇ　Ｎ　（２００７）．　Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ　ｏｆ　ａｕｘｉｎ　ｐｅｒｃｅｐ－ｔｉｏｎ　ｂｙ　ｔｈｅ　ＴＩＲ１　ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ　ｌｉｇａｓｅ．　Ｎａｔｕｒｅ　４４６，　６４０－６４５．Ｔｅａｌｅ　ＷＤ，　Ｐａｐｏｎｏｖ　ＩＡ，　Ｐａｌｍｅ　Ｋ　（２００６）．　Ａｕｘｉｎ　ｉｎ　ａｃｔｉｏｎ：
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Ｙａｎｇ　Ｙ，　Ｘｕ　Ｒ，　Ｍａ　ＣＪ，　Ｖｌｏｔ　ＡＣ，　Ｋｌｅｓｓｉｇ　ＤＦ，　Ｐｉｃｈｅｒｓｋｙ　Ｅ　（２００８）．
Ｉｎａｃｔｉｖｅ　ｍｅｔｈｙｌ　ｉｎｄｏｌｅ－３－ａｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄ　ｅｓｔｅｒ　ｃａｎ　ｂｅ　ｈｙｄｒｏｌｙｚｅｄａｎｄ　ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｂｙ　ｓｅｖｅｒａｌ　ｅｓｔｅｒａｓｅｓ　ｂｅｌｏｎｇｉｎｇ　ｔｏ　ｔｈｅ　ＡｔＭＥＳｅｓｔｅｒａｓｅ　ｆａｍｉｌｙ　ｏｆ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ．　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ　（ｉｎｐｒｅｓｓ）。