三种不同固定液对肺组织冷冻切片染色质量的影响

三种不同固定液对肺组织冷冻切片染色质量的影响
发布时间：2023-02-14T07:14:46.592Z 来源：《医师在线》2022年9月18期作者：陈丽娟江徐程瑶梁莹莹毕嘉欣余学问
[导读]
三种不同固定液对肺组织冷冻切片染色质量的影响
陈丽娟 江徐 程瑶 梁莹莹 毕嘉欣 余学问
（深圳市中医院病理科；广东深圳 518000）
【摘要】术中快速病理诊断在决定手术方式等方面的作用至关重要。

快速冷冻染色切片的质量好坏，直接影响病理报告的速度和准确性。

冷冻切片质量容易受到多种因素的影响，其中固定液的选择尤其重要，为了选择出肺组织最佳的固定液，本文选择了三种不同的固定液进行对比实验，经过几个方面的评判后，发现改良AFA固定液对肺组织冷冻切片染色效果最好。

【关键词】固定液；冷冻切片；HE染色；肺组织
随着临床科室手术的发展，要求送检手术中病理诊断的病例逐年增多，术中快速病理诊断不仅可判定病变的性质，还决定了患者手术的方式，其作用至关重要。

快速冷冻染色切片的质量好坏，直接影响病理报告的速度和准确性，这要求病理技术员能够熟练掌握冷冻病理切片技术，为病理医师快速诊断提供优质的冷冻切片。

冷冻切片质量容易受到多种因素的影响，其中最为重要的是冷冻切片固定液的选择，为了选择出肺组织最佳的固定液，本文选择了三种不同固定液进行对比实验。

1 材料与方法
1.1 材料收集2022年3-5月深圳市中医院病理科临床手术新鲜肺组织15例。

1.2 方法对冷冻切片进行固定、HE染色、对比染色质量。

①取材：临床医师进行组织取材，组织块大小薄厚适宜，一般切取2 cm×2 cm×0.3 cm。

②包埋：在样本托上加少量OCT包埋剂，使其预冷呈半凝固状，把组织块平放于其上，在组织周围滴加适量的OCT将组织包埋。

③冷冻切片④固定：将冷冻切片立即分别放入三种不同固定液内进行固定1 min。

⑤HE染色：苏木素液染色2 min，饱和碳酸锂溶液蓝化后流水冲洗，放入醇溶性伊红染色10-25 s，梯度乙醇脱水，二甲苯透
明，中性树胶封片。

作者单位：518000 深圳市中医院病理科
1.3 固定液 A：95% 乙醇；B：冷甲醇；C：改良AFA固定液（无水乙醇75 mL、40%甲醛溶液10 mL、冰醋酸5 mL、丙酮10 mL）。

1.4 评分标准和结果判定冷冻组织切片经过3种不同固定液固定后染色交由2名不同医师评阅，在光镜下观察组织清晰度、胞核染色效果、胞浆染色效果、核浆染色对比度4个方面，对切片进行统一评价打分，单项分数最佳10分，最差0分，计算15例标本的平均分为最终得分。

1.5 统计学方法实验数据以均数±标准差（mean±SD)表示，数据组间比较采用SPSS（Version 16.0）软件进行单因素方差分析（one-way ANOVE），实验统计结果p<0.05即具有显著性差异。

2 结果
15例肺组织在经过三种不同固定液固定后，按照上述评分标准对进行染色效果评分，得分情况记录如下（表1），改良版AFA固定液在组织清晰度、胞浆染色、胞核染色、核浆对比度均得分均优于其他两种固定液，其中核浆对比度尤为显著。

3种不同固定液染色效果积分情况经过单因素方差分析结果如图1所示，分别为21.97±2.77、28.00±1.41、32.40±2.47，改良版AFA固定液的得分明显高于其他两组固定液，差异具有显著性（p<0.001）。

图A、B、C是用三种不同固定液固定后的肺肿瘤组织染色效果图，其中C图肺组织细胞收缩较小，肺泡结构更加完整，细胞染色均匀一致，核浆染色对比较强，核膜、核仁和核内的结构清晰可见。

图1-3A：肺泡结构不清晰，肺泡上皮脱落，肿瘤细胞肿胀明显，核质对比度差，细胞核内结构难以辨认（H E×10）。

图1-3B：肺泡结构模糊可见，肺泡上皮脱落，肿瘤细胞肿胀现象轻度改善，但核质对比度仍较差，细胞核内结构仍不够清晰（H E×10）。

图1-3C：肺泡结构清晰，肿瘤细胞肿胀不明显，核质对比度好，细胞核完整，核仁清晰可见（H E×10）。

3 讨 论
在肺组织相关疾病中，肺癌是起源于肺部支气管黏膜或腺体的恶性肿瘤，发病率和死亡率增长较快，是对人体健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一。

世界卫生组织国际癌症研究机构（IARC）发布的2020年全球癌症统计数据显示，2020年全球癌症死亡病例996万例，其中
肺癌死亡180万例，位居癌症死亡人数第一[1]。

在临床病理诊断中，手术后肿瘤组织经石蜡切片的常规病理结果是诊断肿瘤性质的金标准，
但由于常规石蜡制作所需时间较长，无法及时为正在进行的手术提供参考依据。

而术中冷冻诊断报告能使外科医生在手术过程中快速了解病变的性质，便于及时确定手术范围和调整最佳手术方式，为手术方案的确立提供证据参考。

因此，对于临床手术患者的术中快速病理诊断，冷冻切片具有重要的意义。

因为时间紧迫、送检标本局限性、新鲜标本水分对细胞形态的影响等原因会导致送检标本的染色质量降低，因此我们要在可控范围内尽量避免因试剂或其他技术问题造成的染色不佳等情况。

而固定液的选择是制片过程的关键，良好的固定液可以最大限度地缩小冷冻切片
与石蜡切片的差异性[2]。

通常使用的固定液有乙醇、甲醇、丙酮、冰醋酸、甲醛等。

95%乙醇是兼有脱水作用的固定液，渗透能力弱，固
定速度较慢，易造成细胞严重收缩，细胞结构欠清晰，但是对糖蛋白固定效果较好，能溶解脂类 [3]。

冷甲醇有收缩固定作用，但收缩性比
乙醇小，细胞内液经冷冻后体积略有膨胀，基本能抵消甲醇的收缩作用，因此能基本保持正常的细胞形态，细胞结构清晰、核浆对比鲜明[4]。

改良版AFA固定液主要在乙醇（A）甲醛（F）冰醋酸（A）的基础上再加了丙酮固定液，其中无水乙醇的脱水作用比较强；甲醛有较好的组织收缩作用，穿透力强，固定均匀，同时可以与乙醇协同固定与脱水；冰醋酸虽不能沉淀白蛋白，但能沉淀核蛋白，对细胞核固定效
果好，助于染色 [5]
；丙酮能迅速固定蛋白质，对组织穿透性强，其中丙酮跟冰醋酸都能使组织膨胀，联合应用既抵消乙醇固定引起的组织
收缩和硬化，又能加快固定，还具备快速脱水作用。

为了更好地提高肺组织冷冻切片的染色质量，保证组织细胞与正常形态的相似性，本实验采用以上3种不同的固定液（95% 乙醇、冷甲醇、改良AFA 固定液）对肺组织进行HE染色，结果显示，采用改良AFA固定液固定的肺组织结构更加完整、清晰；细胞染色均匀一致，核染色清晰，胞质红染均匀，核浆染色对比清楚、鲜艳，此外，经改良AFA固定液固定的肺组织，总体染色得分均高于其他两种固定液。

综上所述，改良AFA固定液固定过的肺冷冻组织切片染色效果更加显著，不但能够显著提升病理组织染色质量，也能让病理诊断医师更加准确地进行疾病诊断，是一种较理想的肺组织的冷冻切片固定液。

参 考 文 献
[1] Sung H, Ferlay J, Siegel RL, et al. Global Cancer Statistics 2020: GLOBOCAN Estimates of Incidence and Mortality Worldwide for 36 Cancers in 185 Countries[J]. CA Cancer J Clin, 2021,71(3):209-249.
[2] 王鸿，周晟，代鹏. 5种固定液对淋巴结冷冻切片HE及免疫组化染色效果的影响[J]. 临床与实验病理学杂志, 2020, 36(8):3. DOI：10.13315/ki.cjcep.2020.08.028
[3] 张洪兰，赵永刚，张春芳，等. 探讨一种混合固定液在乳腺癌冷冻切片诊断中的应用及意义[J]. 诊断病理学杂志, 2020, 27(4):3. DOI：CNKI:SUN:ZDBL.0.2020-04-019
[4]余鑫鑫，陈 阳，阎红琳，等. 肾移植穿刺标本冷冻切片制作方法及体会[J]. 中国组织化学与细胞化学杂志, 2018, 27(4):4. DOI：10.16705/ki.1004-1850.2018.04.011 [5] 董 愉，梁英杰，吴惠群，等. 不同固定液对不同组织冷冻切片 HE 染色效果的探讨[J]. 临床医学工程, 2011,10(18):1584. DOI：10.3969/j.issn.1674-4659.2011.10.1584。