丙戊酸钠诱导髓系白血病细胞分化相关的分子标志物

急性髓细胞白血病（acute myeloid leukemia, AML）是最常见白血病类型，为具有异质性的克隆性疾病。

目前认为，其发病机制与基因突变和表观遗传调控异常相关[1-2],主要累及调控细胞增殖和生存的Ⅰ类基因（如FLT3、Ras等）和细胞分化相关的Ⅱ类基因（如CEBPA、MLL等）突变[1,3]，分别导致细胞增殖异常和分化受阻，导致白血病表型发生。

表观遗传学修饰异常包括DNA甲基化、组蛋白乙酰化、磷酸化、泛素化、糖基化等。

30%~40%的AML与染色体转位干扰包括CBP和P300在内的组蛋白乙酰化转移酶，此外白血病融合蛋白通过直接或与共抑制因子募集组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase,HDAC），最终导致转录抑制[4]。

上述研究均提示，涉及组蛋白乙酰化和（或）去乙酰化转录调节异常在白血病的发生、发展过程中起重要作用。

·论著·
丙戊酸钠诱导髓系白血病细胞分化
相关的分子标志物研究
王莹，诸江，胡炯
（上海交通大学医学院附属瑞金医院血液科上海市血液学研究所，上海200025）
[摘要]目的：研究组蛋白去乙酰化酶（HDAC）抑制剂丙戊酸钠（VPA）诱导髓系白血病细胞分化相关的分子标志物。

方法：采用流式细胞术检测细胞表面分化抗原的表达,采用实时定量PCR和蛋白印迹法检测细胞周期相关蛋白、凋亡相关蛋白、活性氧簇（ROS）相关蛋白及组蛋白甲基化调控蛋白的表达。

结果：VPA较低剂量（1mmol/L）即诱导HL-60细胞分化，K562细胞对VPA诱导分化不敏感。

VPA诱导细胞分化作用与组蛋白乙酰化基础水平及药物处理后调变间无显著相关性，VPA诱导分化与细胞周期相关蛋白、凋亡相关蛋白、ROS相关调控蛋白的表达无影响。

VPA诱导分化效应与细胞不同HDAC表达水平相关，K562细胞高表达HDAC6，对VPA诱导分化不敏感，且经VPA 处理后细胞组蛋白K9甲基化水平较HL-60细胞明显提高。

结论：VPA诱导白血病细胞分化的作用可能与细胞HDAC6的低水平表达及组蛋白K9甲基化水平调控有关，而与组蛋白乙酰化基础水平及细胞周期相关蛋白、ROS相关调控蛋白等无关。

关键词：急性髓细胞白血病；丙戊酸钠；组蛋白去乙酰化酶；机制
中图分类号：R733.7文献标识码：A文章编号：1671-2870（2011）05-0434-06
Molecular marker associated with valproate induced differentiation in myeloid leukemia cells WANG Ying,ZHU Jiang,HU Jiong.Department of Hematology,Shanghai Institute of Hematology,Ruijin Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai200025,China
[Abstract]Objective To investigate the molecular marker associated with valproate(VPA),a histone deacetylase (HDAC)inhibitor,induced differentiation in myeloid cells.Methods Expression of cell surface differentiation antigen was analyzed by flow cytometry,and real-time quantitative PCR and Western blot were used to detect cell cycle,apoptosis, ROS related proteins and histone methylation regulatory protein.Results VPA at low concentration(1mmol/L）can induce differentiation in HL-60cells,while K562cells were not sensitive to VPA induced differentiation.No significant relevance was detected between VPA induced differentiation and histone acetylation level before and after the treatment.
The expressions of cell cycle,apoptosis and ROS related proteins were similar in both HL-60and K562cells.Expression of HDAC was different in HL60and K562cells.The expression of HDAC6was significantly higher in K562cells than in HL-60cells.Upregulation of histone K9methylation was significantly higher in K562than in HL-60cells after treatment with VPA.Conclusions VPA can induce differentiation in HL-60cells,which might be associated with the low level of HDAC6and modulation of histone K9methylation,but not the level of acetylated histone protein and expressions of cell cycle,apoptosis and ROS related proteins.
Key words:Acute myeloid leukemia;Valproate;Histone deacetylase;Mechanism
基金项目：上海市优秀青年医师；上海市领军人才后备队计划
通讯作者：胡炯E-mail:hujiong@
丙戊酸钠（valproate,VPA）属短链脂肪酸盐，临床上用于抗惊厥和癫痫间治疗[5]。

近年来研究表明，VPA的抗肿瘤作用机制在于其能通过延长G
1期使恶性细胞发生周期阻滞，从而影响细胞增殖；促进肿瘤细胞分化，诱导细胞凋亡；抑制细胞运动，避免肿瘤细胞游移、播散到血管及周围组织，减少肿瘤转移；抗血管生成，直接阻断肿瘤组织的血供，使细胞存活减少。

既往研究证实，VPA抗肿瘤作用依赖于对HDAC的抑制[5-6]。

HDAC和组蛋白乙酰基转移酶（histone acetyltransferase,HAT）共同参与组蛋白乙酰化水平调节，可通过改变组蛋白乙酰化状态影响其与DNA的结合，激活或抑制靶基因转录，而下游靶基因涉及细胞周期调节、细胞分化、凋亡等重要生理过程，包括P21、P27、BCL2、survivin 等[5,7-8]。

VPA作为HDAC抑制剂（histone deacetylase inhibitor,HDACi）能提高组蛋白乙酰化水平，使组蛋白与DNA结合增强，进而促使靶基因转录，纠正基因表达调控异常，最终达到治疗肿瘤的目的。

VPA作为HADCi其作用谱较广，可抑制HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC4、HDAC5、HDAC7的功能（包括参与细胞周期调节，阻止细胞凋亡等）[5,9]。

在AML临床研究中，VPA单药或联合治疗反应率在5%~20%[5,10]，鉴于仅部分患者对药物敏感，进一步研究VPA治疗的作用机制，探索其诱导分化等作用相关性分子标志物，对今后在临床上有效筛选敏感患者，开展具有针对性靶向治疗具有重要参考价值。

资料与方法
一、资料
本研究选取HL-60和K562细胞株（上海市血液学研究所保存），以2×105个/mL的密度接种于含10%胎牛血清（GIBCO公司）的RPMI1640（Hyclone公司）培养液中常规培养。

磷酸盐缓冲液（PBS，Sigma公司）将VPA（Sigma公司）配制成4mol/L的储存液，置于－20℃保存。

实验时用RPMI1640稀释成工作液。

二、方法
1.流式细胞术检测细胞表面分化抗原：将HL-60和K562细胞分别按2×105个/mL每孔1mL铺12孔板，按0、1、2、4mmol/L浓度进行培养48h，收集细胞（至少1×105个），PBS洗涤，分别标记CD11b单克隆抗体（CD11b-PC5，Beckman公司），经EPICS XL流式细胞仪（美国Beckman Coulter 公司，Hialeah FL）检测细胞抗原表达的变化。

2.RNA抽提和反转：收集1×106个细胞，离心5000r×5min，加Trizol-A+（Tiangen公司）1mL振荡混匀，室温静置3~5min，加200μL氯仿振荡15s，12000r/min离心15min，取上层水相约500μL，加同体积异丙醇，室温静置20min，12000r/min 离心10min，去上清液，加75%无水乙醇1mL，5000r/min离心3min，去上清液，晾干，加DEPC （Sigma公司）水溶解RNA，－80℃保存。

取1μg RNA，用反转录试剂盒ReverTra Ace（Toyobo公司）试剂配成20μL体系，PCR仪（Eppendorf公司）中反转录，条件如下。

30℃10min，42℃40min，99℃5min，保持4℃，产物置于－80℃保存。

3.引物（5'-3'）：HDAC1，正向引物GGACCAGATTT-CAAGCTCCACA，反向引物GCGGCAGCATTCTAA-GGTTCT;HDAC2,正向引物CCATAAAGCCACTGCCGAA,反向引物TCGGTT-TAACTTCACAGCTCCA;HDAC3,正向引物GCATC-CTGGAGCTGCTCAAGTA,反向引物TGACCCG-GTCAGTGAGGTAGAA;HDAC4,正向引物TGTACATGTCCCTCCACCG-CTA,反向引物CAT-GTTGACGTTGAAACCCACG;HDAC6,正向引物CCAGCACAGTCTTATGGATGGC,反向引物TC-TACGATAAGGACCCTCCGGA;HDAC8,正向引物TTTGGATCTGCACCATGGA-GA,反向引物CC-TAGGCCAACATCAGACACGT;HDAC10,正向引物CGCCGGATATCACATTGGTTC,反向引物TAC-CACTGTTCACCTGCCCATC;TBP-2,正向引物CAGCAGTGCAAACAGACTTCG,反向引物TTCCA-GGTCTCATGATCACCAT;TRX,正向引物GATC-CATTTCCATCGGTCCT,反向引物TATCACCT-GCAGCGTCCAA;18S,正向引物CGCGGTTC-TATTTTGTTGGTTT,反向引物TTCGCTCTGGTC-CGTCTTG。

4.实时定量PCR检测目的基因mRNA表达：取1μL cDNA模板，加上相应量待检测基因的引物，使用实时定量PCR试剂盒（SsoFastEvaGreen Supermix with Low Rox，Bio-Rad公司）的supermix 配成20μL体系，于实时定量PCR仪（7500real-time PCR system)中反应，第一步95℃30s；第二步95℃5s，60℃34s，共40个循环；最后95℃15s,60℃1min。

5.蛋白印迹法检测蛋白表达：取1×106个细胞，PBS清洗，5000r/min离心5min，沉淀后加入
50μL5%SDS裂解液，充分混匀，在煮蛋白仪上热变性10min，－80℃保存备用。

采用Bio-Rad蛋白定量试剂盒测定蛋白量。

上样前加入6×上样缓冲液（1mmol/L Tris碱，pH值为6.8，SDS，溴酚蓝，甘油和β-巯基乙醇）至终浓度为1×，上样于SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，常规转膜，5%脱脂奶粉（0.1% Tween-20）室温封闭1h后，与相应的一抗按一定的稀释度室温孵育2h或4℃下过夜，经TBST缓冲液充分洗涤后与相应稀释度的二抗室温反应1h，TBST洗涤后经化学发光仪（富士公司LASK-400）显影。

抗乙酰化组蛋白H3（lys9）、H3（lys14）、H4（lys5）、H4（lys8）抗体和抗HDAC1、HDAC4、Hsp90、P21、survivin、Apaf-1、XIAP抗体及抗三甲基化组蛋白H3（lys4）、H3（lys9）抗体和内参actin均来自Cell signal公司，其中P21、survivin、actin为鼠抗，余均为兔抗。

抗bcl2、HDAC6、HDAC8、P27抗体来自Santa公司，其中HDAC6为鼠抗，余均为兔抗。

三、统计学分析
2组间比较采用团体t检验。

结果
一、VPA诱导HL-60细胞分化而对K562细胞无作用
采用不同浓度VPA（0、1、2、4mmol/L)处理细胞连续48h，采用流式细胞术分析，发现HL-60细胞在VPA浓度1mmol/L时，CD11b阳性率即明显升高，达84.2%（空白对照阳性率为9.74%)（P<0.05），随着VPA浓度增加，CD11b阳性率进一步提高至99.7%。

K562细胞在即使VPA浓度为4mmol/L 时，CD11b阳性率也仅为0.13%（空白对照阳性率为0.34%），提示VPA可诱导HL-60细胞髓系分化，对K562细胞无诱导分化作用（见图1）。

二、HL-60细胞和K562细胞基础的HDAC水平不同
实时定量PCR方法检测HL-60和K562细胞系HDAC mRNA表达水平，发现HL-60细胞系HDAC1、HDAC2、HDAC4、HDAC8、HDAC10表达水平均高于K562细胞，其中HDAC4、HDAC8差异有统计学意义（P值均<0.05），而K562细胞的HDAC6水平高于HL-60细胞，差异具有统计学意义（P<0.01）。

进一步行蛋白印迹法检测2个细胞系的HDAC蛋白水平表达，证实HADC4和HADC6蛋白水平在HL-60和K562细胞间的差异与实时定量PCR结果一致(见图2）。

三、细胞对VPA的敏感性与其组蛋白乙酰化水平的升高无关
采用1mmol/L浓度VPA处理HL-60和K562图2HL-60与K562细胞的HDAC 基础表达水平不同
图1不同浓度VPA处理对HL-60及K562细胞CD11b的影响
细胞系3~12h，蛋白印迹法检测药物处理前、后H3lys9、H3lys14、H4lys5、H4lys8位点的组蛋白乙酰化水平，随着药物作用时间延长，HL-60和K562细胞中上述4个常见组蛋白乙酰化位点乙酰化水平均呈现显著上升趋势（见图3）。

四、VPA对组蛋白甲基化的影响
用1mmol/L浓度VPA处理HL-60和K562细胞系3~12h后，检测药物处理前后细胞组蛋白H3lys4和H3lys9位点甲基化水平。

结果发现，HL-60和K562细胞中VPA诱导H3lys4甲基化水平增高，HL-60细胞中H3lys9位点甲基化未出现明显上升，且在VPA作用约6h出现下降，而K562细胞中，H3lys4和H3lys9甲基化均呈现持续上升趋势（见图4）。

五、VPA对细胞周期蛋白、凋亡相关蛋白的影响
用1mmol/L浓度的VPA处理HL-60和K562细胞系3~12h，检测药物处理前后P21、P27、bcl2、survivin、Apaf-1、XIAP、Hsp90等HADC调控的下游靶基因蛋白表达水平。

发现在HL-60和K562细胞中，细胞周期蛋白P21、P27随着药物作用时间延长均呈上升趋势，而凋亡相关蛋白survivin、XIAP、bcl2则未发现明显变化，Apaf-1在2个细胞系内均呈现表达增加趋势。

此外，与细胞内活性氧簇（ROS）调控相关的基因TBP-2、TRX在mRNA表达水平上均无显著差异（见图5）。

讨论
表观遗传学修饰异常在白血病研究中越来越受到重视，其中对HDACi的研究也备受瞩目。

在实体瘤和血液恶性肿瘤中，HDACi具有一定的抗肿瘤效应[11-12]。

如在常见的伴APC肿瘤抑制基因丢失的结肠癌研究中发现，VPA处理后的APC缺陷小鼠，可降低自发性肿瘤数量和体积[4]。

在膀胱癌、前列腺癌及乳腺癌中也有类似报道[7,13]。

在t（15；17）阳性的急性早幼粒细胞白血病细胞、t（8；21）AML 及MLL相关白血病中，抑制HDAC活性可导致细胞呈现不同程度的周期阻滞、细胞分化和（或）凋亡[5,14]。

在临床试验方面，多种HDACi已进入临床Ⅰ和Ⅱ期研究，并已获得一定的治疗反应率。

以AML为例，5%~20%的患者对VPA治疗有效，但多为血液学缓解，而真正完全缓解的比率仍较低[5,13]，提示AML对于HDACi作为靶向治疗的敏感性存在显著差异，研究HDACi敏感性相关的作用机制并筛选其相关分子标志物对于进一步开展临床研究、提高靶向治疗针对性具有重要参考意义。

本研究分析HL-60和K562这2个髓系白血
图31mmol/L VPA处理不同时间的细胞组蛋白
乙酰化水平变化
图41mmol/L VPA处理不同时间的
细胞组蛋白乙酰化水平变化
图51mmol/L VPA处理不同时间的细胞凋亡相关蛋白及细胞周期蛋白表达水平变化
病细胞株对VPA敏感性的差异及其相关分子标志物。

VPA能有效诱导HL-60细胞向髓系分化，而对K562细胞则无诱导作用。

为进一步筛选能显示细胞对VPA敏感性差异的重要分子标志物，本研究选择一系列文献报道中与HDACi调控细胞功能相关的分子标志物，并在基因和蛋白水平表达进行检测。

既往研究已明确，VPA作为HDACi，其抗肿瘤效应是否依赖组蛋白乙酰化水平调控仍存在一定的争议[15-16]。

本研究中选取4个最常见组蛋白乙酰化位点，比较药物处理前后组蛋白乙酰化水平，发现HL-60和K562细胞组蛋白乙酰化水平经VPA 处理后均显著上升，提示VPA诱导细胞分化效应与组蛋白乙酰化水平上调并无直接联系，或至少与最常见的组蛋白乙酰化位点无关。

文献报道，VPA诱导细胞周期阻滞、诱导细胞分化和凋亡与细胞周期分子表达调控有关。

近来也有研究提示，ROS相关蛋白可能参与HDACi的抗肿瘤作用[7,17]。

本研究中，针对细胞周期调控蛋白P21及P27和凋亡相关蛋白bcl2、survivin、Apaf-1、XIAP及ROS相关蛋白TBP-2、TRX进行检测，发现HL-60和K562细胞在VPA处理前后，上述基因mRNA或蛋白水平变化趋势基本一致或无显著变化，提示其与VPA诱导细胞分化的敏感性无直接关系。

由于VPA作为HDACi，对不同HDAC的抑制效应不完全相同，本研究分析HL-60和K562细胞中不同HDAC的基础表达水平，结果发现K562细胞HDAC6水平明显高于HL-60，而HDAC4水平则明显低于HL-60。

由于HDAC6是Hsp90的去乙酰化酶[18]，因此本研究进一步检测了Hsp90在HL-60和K562细胞株中表达及其受VPA调控的影响。

结果发现，Hsp90的表达水平在2种细胞中均未呈现明显的上升或下降趋势。

目前研究发现，HDAC6与其他HDAC的差异在于其具有特殊的泛素蛋白结合作用[19-20]。

研究证实，HDAC6是调节细胞对细胞毒药物等外界刺激反应的重要蛋白，因此可能也参与了白血病细胞对药物产生耐药的机制。

虽然，目前多数文献报道HDACi的作用与提高组蛋白乙酰化水平有关[13-16]，但本研究结果显示，除了HDAC4和HDAC6的表达在HL-60、K562细胞中存在显著差异外，还发现既往报道的HDACi导致的组蛋白乙酰化水平升高、组蛋白下游基因和(或)蛋白调变与VPA诱导细胞分化敏感性无关。

考虑其可能原因有以下几种。

①HDAC作用不仅限于对组蛋白调控，可能对细胞质各类蛋白乙酰化水平也具有调控作用，因此其抑制作用范围更广泛。

②组蛋白乙酰化水平仅提示HDACi对细胞蛋白整体乙酰化调控的影响，而并不能反映药物对细胞功能产生重要影响的个别蛋白乙酰化调控影响。

此外，本研究结果显示VPA能影响组蛋白甲基化状态，且H3lys9位点甲基化与VPA诱导细胞分化敏感性可能有一定关联[20-22]。

总之，HDACi的作用机制广泛且复杂，目前无法简单依赖组蛋白乙酰化水平变化等分子指标预测HDACi的疗效，有必要进一步深入研究其作用机制，尤其是组蛋白乙酰化与甲基化的协同对基因表达和细胞分化等效应的研究。

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（收稿日期：2011-07-21）
（本文编辑：褚敬申）。