rmhTNF-α联合吉西他滨杀伤人肺腺癌细胞A549作用研究

rmhTNF-α联合吉西他滨杀伤人肺腺癌细胞A549作用研究古翠萍;张沂平;冯建国;马胜林;陆琰君;洪丹;陈金麟
【摘要】背景与目的目前,晚期非小细胞肺癌患者化疗效果已达平台,生物治疗与化疗联合使用可明显改善此类患者的治疗效果.本课题旨在研究rmhTNF-α联合吉西他滨对人肺腺癌细胞A549的杀伤作用及其作用机制.方法应用CCK-8法检测不同浓度rmhTNF-α及吉西他滨对A549细胞抑制率,应用细胞生长曲线描述经rmhTNF-α、吉西他滨干预过的A549细胞增殖情况,应用流式细胞仪检测各药物处理组48 h的细胞周期分布及凋亡率,并用光学显微镜及透射电子显微镜观察
A549细胞形态及超微结构.结果 CCK-8检测结果及细胞生长曲线均提示rmhTNF-α不仅具有抑制A549细胞生长作用,而且可以增强吉西他滨对A549细胞杀伤作用;FCM显示两药联合组可促使A549细胞阻滞在S期,降低G2/M期比率;凋亡比率以吉西他滨+rmhTNF-α组最明显,光镜及电镜下观察结果均能明显观察到A549细胞呈凋亡形态学改变.结论 rmhTNF-α通过诱导人肺腺癌细胞A549细胞凋亡及细胞周期阻滞,从而增强吉西他滨对其的杀伤作用.
【期刊名称】《中国肺癌杂志》
【年(卷),期】2008(011)004
【总页数】5页(P495-499)
【关键词】rmhTNF-α吉西他滨;肺肿瘤;凋亡;细胞周期
【作者】古翠萍;张沂平;冯建国;马胜林;陆琰君;洪丹;陈金麟
【作者单位】310022,杭州,浙江省肿瘤医院;310022,杭州,浙江省肿瘤医院;310022,杭州,浙江省肿瘤医院;310022,杭州,浙江省肿瘤医院;200092,上海,同济大学基础医学院;310053,杭州,浙江中医药大学;310053,杭州,浙江中医药大学
【正文语种】中文
【中图分类】R734.2
肺癌是目前世界最常见的恶性肿瘤之一，在我国其发病率和病死率呈上升趋势，其中NSCLC约占肺癌总发病人数的80%，初次就诊多为局部晚期及晚期，有效的
治疗方法有限，预后极差。

由于内缘性或获得性耐药，大多数此类患者死于肿瘤进展[1]。

ECOG 1594研究结果提示尽管新的化疗药物不断问世，第3代含铂方案
仍不能明显改善晚期肺癌患者的生存期，中位生存时间为7.4-8.3个月，1年生存率为31%-36%。

周清华等及我院临床研究结果发现rmhTNF-α联合GP治疗非
小细胞肺癌患者疗效显著优于单纯化疗[2]。

ECOG 4 599临床研究也预示着肺癌
化疗标准治疗模式已经发生变化，生物治疗与化疗联合使用成为肺癌治疗研究热点。

重组人肿瘤坏死因子（rmhTNF-α），是以基因重组技术生产的TNF-α变构体，
具有增强化疗效果的机理尚未明确，故本实验采用rmhTNF-α、吉西他滨为研究
药物，进行对A549细胞杀伤作用及其可能机制研究。

1 材料与方法
1.1 主要材料
1.1.1 细胞株及其培养人肺腺癌A549细胞株来自浙江省肿瘤医院研究所细胞库。

常规方法细胞培养，实验细胞均处于对数生长期，消化计数，制成细胞悬液，设计对照组、吉西他滨、rmhTNF-α、吉西他滨+rmhTNF-α4组，每组设3个平行组。

1.1.2 药品吉西他滨，生产厂家：LILLY FRANCES.A，剂型：200 mg/支，批号：
FF6B59J。

rmhTNF-α（重组改构人肿瘤坏死因子），生产厂家：上海赛达生物药业，剂型：5 000 000IU/支，批号：20041102。

1.1.3 器材及试剂小牛血清为自杭州四季青生物工程有限公司生产；RPMI-1640
培养基为Gibico公司产品；Cell counting kit-8（CCK-8）试剂为日本同仁化学
研究所生产，是MTT法改良试剂；姬姆萨为上海生工生物工程有限公司产品；Cycle plus DNA-kit试剂盒为美国BD公司产品；细胞培养瓶和培养板：美国BDFALCAN公司。

1.2 方法
1.2.1 CCK-8法检测药物对A549细胞抑制率以4 000个细胞/100 μL/孔接种于96 孔板，设置空白、对照组，贴壁24 h，置4 ℃冰箱同步化过夜，加药，吉西他滨：1 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL、1 000 ng/mL，rmhTNF-α：50 U/mL、100 U/mL、500 U/mL、1 000 U/mL、5 000 U/mL、10 000 U/mL，继续培养48 h，每孔加入10 μL CCK-8试剂，培养3 h，用酶联免疫仪检测450 nm波长、参比波长630 nm处的各孔吸光度（OD值）。

计算
抑制率=（1-实验组测定值/空白对照组测定值）×100 %。

计算吉西他滨及rmhTNF-α各自的IC50和IC30。

用上述方法检测不同浓度吉西他滨即1 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、50 ng/mL各孔均加或不加rmhTNF-α的IC30（1 000
U/mL）各孔吸光度值，计算抑制率=（1-实验组测定值/空白对照组测定值）
×100 %。

1.2.2 细胞生长曲线将细胞接种6.5×104/培养瓶，贴壁24 h，根据方法1检测
结果，以吉西他滨（5 ng/mL）、rmhTNF-α（1 000 U/mL）为研究药物浓度，
分别收集24 h 、48 h、72 h时间点细胞，计数各瓶细胞数并绘制散点图。

1.2.3 流式细胞仪测定细胞周期及凋亡每瓶接种细胞10×104个A549细胞，贴
壁24 h，加药，继续培养，用Hanks清洗1次，胰酶过消化，1500 rpm离心6
min，48 h时间点细胞，经PBS液漂洗两次后，缓慢加入75%冰冻酒精固定，并充分震荡混匀，置4 ℃冰箱过夜，按照美国BD公司Cycle plus DNA-kit试剂盒
操作说明操作，上机检测细胞凋亡情况。

1.2.4 光学显微镜及透射电子显微镜观察细胞形态将已处理48 h各组细胞：①在光学显微镜下观察各组细胞形态并摄片。

②用Hanks清洗1次，胰酶过消化，用
4 ℃离心机收集细胞，用0.1 mmol/L PBS液漂洗两次，细胞悬浮于2.5%戊二醛
中固定30 min，0.1 mmol/L PBS液漂洗两次，细胞悬浮于1%锇酸中固定1 h，再0.1 mmol/L PBS液漂洗两次，4%醋酸铀水溶液染色30 min，50%、70%、90%乙醇依次脱水，各15 min1次，100%乙醇脱水20 min1次，100%丙酮脱
水20 min两次，将细胞置于无水丙酮：包埋剂（1:1）中置换30 min，并震荡2 h，包埋剂纯浸2 h，纯包埋剂包埋，并置烘箱内聚合，37 ℃、24 h，45 ℃、24 h，60 ℃、48 h。

超薄切片（约120 nm），4%醋酸铀染色20 min，构橼酸铅
染色5 min。

再高压80 KV透射电子显微镜下观察、照相。

1.2.5 统计学分析应用SPSS11.0统计软件，计量资料用均数±标准差
（Mean±SD）表示，检验方差齐性，均数间两两比较q检验（Newman-Keuls 法），多组均数间比较用方差分析，F检验，均以P＜0.05为具有统计学差异。

2 结果
2.1 CCK-8法检测A549细胞的抑制率 rmhTNF-α单药对A549细胞的生长具有抑制作用，在50 000 U/mL浓度以下，呈剂量相关性，但尚未达到半数抑制浓度，计算IC30为1000 U/mL。

低浓度吉西他滨对A549细胞生长抑制明显，而50
ng/mL以上浓度对A549细胞的抑制率无明显升高，计算IC50为9.87 ng/mL，IC30是4.83 ng/mL （表1）。

rmhTNF-α（1000 U/mL）+吉西他滨处理组各
组别的OD值均明显低于吉西他滨单药组，即rmhTNF-α联合吉西他滨对A549
细胞的抑制作用高于吉西他滨单药组，经统计学分析，具有显著差异性（P＜0.01）
（表2）。

2.2 细胞生长曲线从图1中，可以观察到不同时间点，各组A549细胞生长速度
不同，用药各组A549细胞生长均较对照组缓慢，以48 h、72 h，rmhTNF-α+
吉西他滨组细胞最为缓慢，经统计学分析，具有统计学意义（P＜0.05）。

表 1 不同浓度rmhTNF-α及吉西他滨对A549细胞的抑制率Tab 1 Inhibitory ratio of different concentration of rmhTNF-α and Gemcitabine on
A549rmhTNF-α Gemcitabine Concentration (U/mL) OD value
(Mean±SD) Inhibition ratio (%) Concentration (ng /mL) OD value
(Mean±SD) Inhibition ratio (%)0 1.52±0.08 0 0 1.39 ±0.12 0 50 1.36±0.05 10.6 1 1.20±0.12 13.7 100 1.35±0.07 11.2 5
0.90±0.03 35.3 500 1.16±0.05 23.7 10 0.67±0.02 51.8 1 000
1.06±0.08 30.3 50 0.62±0.02 54.4 5 000 1.04±0.02 31.6 100
0.54±0.02 61.2 10 000 0.96±0.07 36.9 1 000 0.45±0.04 67.7
表 2 不同浓度吉西他滨联合rmhTNF-α作用48 h后对A549细胞的抑制作用（Mean±SD）Tab 2 Comparison of the inhibitory ratio between gemcitabine and gemcitabine combined with rmhTNF-α＊P＜0.01 vs controlGemcitabine (ng/mL) rmhTNF-α（1000 U/mL）No (OD value) Yes (OD value )0 1.39 ±0.12 —1 1.20±0.12 1.04±0.08＊5 0.90±0.03 0.77±0.02＊10 0.67±0.02 0.62±0.01＊50 0.62±0.02 0.50±0.01＊
图 1 各组A549细胞不同时间点增殖情况Fig 1 The proliferation of four groups in different time
2.3 流式细胞仪测定细胞凋亡在FCM结果可以观察到在作用24 h前各时间点各组A549细胞未见明显细胞凋亡，24 h、48 h各组均可看到不同程度的细胞凋亡，
以作用48 h、吉西他滨+rmhTNF-α最明显（表3）。

2.4 光学显微镜观察细胞形态上述结果可以推测rmhTNF-α通过诱导A549细胞凋亡抑制其增殖。

在光镜下可以观察到各组细胞形态学改变：对照组细胞数量多，形态梭形或圆形，透亮，颗粒少，提示对照组细胞比各药物组生长旺盛；rmhTNF-α组细胞数目有所减少，细胞多形性，颗粒较多，不透亮；吉西他滨组
细胞数量明显降低，圆形，细胞肿胀明显，体积增大，透亮；吉西他滨
+rmhTNF-α组细胞数量最少，细胞肿胀，颗粒明显增多，体积较大，形态不规则，甚至成片状（图2）。

2.5 透射电子显微镜观察细胞形态从透射电子显微镜摄片观察各组细胞超微结构：对照组细胞形态大小正常，胞核大且完整，染色质无浓缩、边聚，细胞质无浓缩，细胞器增多，胞膜表面皱褶较多；rmhTNF-α组细胞呈现凋亡形态学改变，细胞
体积缩小，胞质浓缩，细胞器减少，核固缩、碎裂，染色质边聚，核膜成新月状，胞浆有空泡化，胞膜表面皱褶减少；吉西他滨组细胞体积增大，肿胀明显，可见核碎片，核膜不规则，胞膜完整，胞浆空泡化，细胞器较少；吉西他滨+rmhTNF-α组细胞肿胀，胞膜不完整，胞浆空泡化明显，细胞器明显减少，核膜不规则，染色质凝聚，核着边，呈现明显凋亡改变（图3）。

3 讨论
我们前期研究发现rmhTNF-α可抑制MCF-7/Adr细胞核内的RelA/p65活性，
降低细胞内抗凋亡基因mRNA水平，同时可抑制抗凋亡因子P21的活性，有效诱导caspase-8分泌，提高多柔比星抗肿瘤活性，从而增强MCF-7/Adr多药耐药
细胞的细胞毒效应[3,4]。

RmhTNF-α是基因重组技术生产的 TNF-α变构体，具
有杀伤A549细胞作用，与诱导肿瘤细胞凋亡关。

TNF-α与肿瘤细胞膜上TNFR1的胞外区结合后，TRADD（TNFR1 associated death domain protein）抑制蛋白被释放，TRADD与TNFR1死亡结构域结合，形成TNFR1/TRADD复合体，该
复合体招募一系列相关蛋白，引发不同的下游信号通路，促使细胞程序性凋亡。

机制一为TNF-α诱导经典的和非经典的caspase依赖型细胞凋亡[5-7]；机制二为TNF-α调节NF-κB信号通路增强细胞凋亡[3,4]。

表 3 48 h各组A549细胞周期分布情况（Mean±SD）Tab 3 The cell cycle proportion of A549 cells treated for 48 hcompared with control group：
▲▲P＜0.01；compared with gemcitabine：▼▼P＜0.01Groups G0/G1 stage S stage G2/M stage Apoptosis ratio control group 70.02±2.35 22.16±1.11 5.49±1.34 0.13 rmhTNF-α 62.18±0.95▲▲ 29.58±0.29▲▲ 8.24±0.73 3.35 gemcitabine 25.7±0.00▲▲ 50.97±0.00▲▲
23.32±0.00▲▲ 2.47 gemcitabine+rmhTNF-α 23.57±2.69▲▲▼▼
66.23±0.79▲▲▼▼ 10.19±2.64▲▲▼▼ 11.28
图 2 光学显微镜下各组A549细胞形态学变化Fig 2 The changes of every group cell morphology observed by light microscopeA: control group； B: rmhTNF-α group； C: gemcitabine group； D: gemcitabine +rmhTNF -α group
图 3 透射电子显微镜下各组细胞超微结构变化Fig 3 The changes of cell ultramicro-morphology observed by transmission electron microscope.A: control group； B: rmhTNF-α group； C: gemcitabine group； D: gemcitabine +rmhTNF-α group
吉西他滨属抗代谢类药物，具有较高的抗肿瘤活性，于1996年被美国FDA批准为非小细胞肺癌一线化疗药物，它是细胞周期特异性药物，主要作用于 DNA合成期，即S期细胞[8]。

基础研究表明吉西他滨可促使多种肿瘤细胞株细胞周期阻滞在S期[9,10] 。

吉西他滨诱导肿瘤细胞凋亡途径与rmhTNF-α相似。

如Jones[11]等研究发现吉西他滨可促使线粒体膜通透性增加，细胞色素c释放，更多的
caspases 3和9激活，从而使NSCLC细胞系NF-κB缺失（H157I）凋亡更加明显；Kurdow[12]研究发现吉西他滨可诱导KNS62肺癌细胞caspase非依赖型DNA断裂，激活线粒体凋亡信号通路中下游信号分子，诱导细胞凋亡；Xu[13]等研究TRAIL和gemcitabine同时处理胰腺癌细胞系，可以增加Caspase-8 and -3活性，具有协同抑制作用，可以成为胰腺癌新的治疗方案；同时吉西他滨诱导肿瘤细胞凋亡与Smase、Bax有关[14,15]。

本实验从CCK-8检测结果发现rmhTNF-α不仅单独可以抑制A549细胞增殖，而且可以明显增强吉西他滨对肿瘤A549细胞的杀伤作用。

FCM结果明确观察到rmhTNF-α促使A549细胞阻滞在S期，而且可以增强吉西他滨组A549细胞S 期阻滞，同时降低G2/M期比率，两者具有统计学意义（P＜0.05）。

从细胞形态学及超微结够明确观察到rmhTNF-α可明诱导A549细胞凋亡，而且两药联合组凋亡更为明显。

我们考虑rmhTNF-α可增强吉西他滨对A549细胞杀伤作用有以下途径：促使细胞周期阻滞在S期，增强A549细胞对吉西他滨的敏感性；通过增加Caspase酶分泌及活性诱导经典的caspase依赖型细胞凋亡；通过激活线粒体信号通路诱导非经典的caspase 依赖型细胞凋亡；调节NF-κB信号通路增强细胞凋亡。

总之，以上结果表明rmhTNF-α不仅单独可以抑制A549细胞增殖，而且可以明显增强吉西他滨对肿瘤A549细胞的杀伤作用，机制与促使细胞周期阻滞，诱导细胞凋亡有关。

此研究为临床rmhTNF-α联合化疗治疗肺癌提供有利依据，尚需在此基础上继续凋亡相关分子（如P21、NF-κB、caspases酶等）的研究，进一步阐明rmhTNF-α增强化疗药物对肺癌细胞杀伤作用机制。

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