生物化学实验七：蛋白质含量的测定
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厦门 翔安 2016年03月31日
Xiamen University
商务部《出口鳗鱼技术指南》项目 水产饲料企业高级管理干部培训班
基本原理： 碱性条件下，蛋白将Cu2+还原为Cu+， Cu+与
BCA试剂形成紫颜色的络合物，测定其在562nm 处的吸收值，并与标准曲线对比，即可计算待测 蛋白的浓度。
Xiamen University
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微量凯氏定氮法
• 被测的天然含氮化合物与浓硫酸共热时分解出氨， 氨与硫酸反应生成硫酸铵。在凯氏定氮仪中加入 强碱消化液，使硫酸铵分解出氨。用水蒸汽蒸馏 法将氨蒸入无机酸溶液中，然后再用标准酸溶液 进行滴定，滴定所用无机酸的量(mol)相当于被测 样品中氨的量(mol)，根据所测得的氨量即可计算 样品的含氮量。
厦门 翔安 2016年03月31日
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商务部《出口鳗鱼技术指南》项目 水产饲料企业高级管理干部培训班
蛋白质概述
(6) 光合作用：叶绿体蛋白。 (7)保护作用：毛发、肌腱、韧带、软骨等。 (8) 凝血作用：凝血蛋白。 (9)通透作用：生物膜，表皮内在蛋白。 (10)毒素作用：肉毒毒素等。 (11)遗传讯息调控：受体蛋白、视觉蛋白、味觉蛋白。 (12)精神蛋白：预测 (13)重要的能量来源
蛋白质概述 • 蛋白质是生物体最重要的生化物质之一。
• 功能：
(1) 催化：酶是蛋白质，决定了代谢的类型。 (2) 激素：多肽激素，有调控作用
如胰岛素调节血糖浓度。 (3) 载体：如血红蛋白，可运载O2和CO2；
无脊椎动物的血蓝蛋白功能一样； 在6000m高山上发现有蓝血人； (4) 运动：肌肉中的肌球肌动蛋白，伸缩功能。 (5) 免疫：引起免疫的抗体是蛋白质，称免疫球蛋白。
280 nm
540 nm
0.1-1.0 mg 1-10 mg
简便
较简便
纯度高样品
快速但不十 分精确
Folin-酚法
考马斯亮蓝 法
650 nm
595 nm
25-250µg 10-100 µg
较简便
较简便
受多种因素干 扰
干扰较少
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蛋白质的测定方法分两大类：
一类是利用蛋白质 的共性即含氮量 、肽键和折射率 等测定蛋白质含 量；
另一类是利用蛋白 质中的氨基酸残 基、酸性和碱性 基因以及芳香基 团等测定蛋白质 含量。
• 碘化二汞铵溶液呈黄色，可用752型分光光度计490nm波长测定。
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仪器：
仪器及试剂
30ml微量凯式烧瓶6支；玻璃研钵1副；50ml量瓶1
个；10ml离心管2支；10ml试管10支；电炉1台；
CO2+SO2+H2O+NH3 ↑ (NH4)2SO4
H2O+Na2SO4+NH3↑
NH4HB4O7+H2O
滴 NH4HB4O7+HCl+H2O 定
NH4Cl+H3BO3
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10mg
540 nm
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Folin-酚试剂法(Lowry法)
• Folin酚反应是在双缩脲反应的基础上，引进Folin 试剂(磷钼酸-磷钨酸试剂)，蛋白质-铜络合物能还 原磷钼酸-磷钨酸试剂，生成蓝色物质。在一定条 件下，蓝色强度与蛋白质的量成正比例。本法的 优点是操作简便、灵敏度高(20-250g)、较紫外吸 收法灵敏10-20倍，较双缩脲法灵敏100倍。其不 足之处是此反应受多种因素干扰。
•准确灵敏：BCA试剂的蛋白质测定范围是20-2000g/mL； Micro BCA试剂测定范围是0.5-20 g/mL
•快速：45min内完成测定，比经典的Lowry法快4倍而且更加 方便 •经济实用：除试管外，测定可在微孔板中进行，大大节约样 品和试剂用量 •不受样品中离子型和非离子型去污剂影响 •检测不同蛋白质分子的变异系数小于考马斯亮蓝
消化炉
蒸馏单元及电位滴定仪
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双缩脲法
原理：当脲加热至180oC时，两分子脲缩合，放出一分子氨而 形成双缩脲。双缩脲在碱性条件下能与硫酸铜生成紫红色络合 物，即发生双缩脲反应。蛋白质分子中含有肽键，与双缩脲结 构相似，故蛋白质与碱性硫酸铜也能形成紫红色络合物,在一 定条件下其颜色深浅与蛋白质浓度成正比，可用来进行蛋白质 定量。最大波长位于540nm处。本法测定蛋白质范围为1-
吸管数支；移液管数支；752型分光光度计(公用)
试剂：
浓H2SO4(分析纯)、20%三氯醋酸、H2O2、2N氢氧 化钠溶液、奈氏试
剂、标准硫酸铵溶液
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实验步骤
1)准确称取鱼肉3.0g，剪碎，至研钵中研磨成匀浆，用蒸馏水 反复 多次冲洗研钵，其液体注入50ml量瓶并稀释至刻度，为 匀浆液。
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紫外分光光度法
• 由于蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含 有共轭双键，因此蛋白质具有吸收紫外线的性质， 吸收高峰在280 nm波长处。在此波长范围内，蛋 白质溶液的光吸收值(OD280)与其含量呈正比关系， 可用作定量测定。
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具体测定方法：
商务部《出口鳗鱼技术指南》项目 水产饲料企业高级管理干部培训班
•凯氏定氮法:最常用的， 国内外应用普遍。
染料结合反应
凯氏定氮常量法、 半微量法和微量法
双缩脲反应
•国外： 红外分析仪
•酚试剂法
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• 定义
蛋白质概述
蛋白质是含氮的有机化合物，分子量很大。
主要由C、H、O、N、S五种元素组成。某些
蛋白质中还含有微量的 P、Cu、Fe、I 等。
蛋白质的含氮量比较恒定，平均为16%，因
此可通过测定样品的含氮量进而推算蛋白质
含量。
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4)将消化管置于消化架上，使管颈与架成30°倾斜，在通
风橱内进行消化，消化过程应常转动消化管，待白色烟 雾消失后，加入2-3滴H2O2，消化至溶液透明(约2-3h)即可。 注意：加H2O2是必须停火，冷却，然后H2O2由管壁
• 蛋白质含氮量通常在16 %左右，将凯氏定氮法测 得的含氮量乘上蛋白质换算系数6.25，便得到该 样品的蛋白质含量。
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消 化
N +浓H2SO4
NH3+H2SO4
蒸
馏 (NH4)2SO4+NaOH
吸
收
NH3+H3BO3
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2)取1支10ml离心管，加1ml匀浆液和1ml20%三氯醋酸，搅拌， 离心3min，上清液用作测定非蛋白质氮。
3)取2支消化管，注明号码，按下表分别加入样品和试剂：
项目 总蛋测定 非蛋白氮测定
号码 1 2
样 品(ml) 匀浆液1ml
上清液
H2SO4(ml)
1 与上清液等体
积
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实验目的要求
学习和掌握使用奈氏试剂来测定生物材料中蛋白质 含量的原理和操作技术。
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商务部《出口鳗鱼技术指南》项目 水产饲料企业高级管理干部培训班
基本原理
含氨有机物在适当催化剂作用下，与浓硫酸共热 而被分离(消化)后，而含碳化物氧化成二氧化碳 逸散，其中的氮全部以氨的形式游离出来与硫酸 结合成不挥发的硫酸铵而存在于消化液中，硫酸 铵与氨氧化钠作用，产生氢氧化铵和硫酸钠，在 有氢氧化钠存在的情况下，氢氧化铵与奈氏试剂 (Nesslers reagent，含 HgI2和KI)作用产生碘化二汞 铵溶液。
Hg
• NH4OH+2(HgI2·2KI)+3NaOH
O
NH2I + 4KI+3NaI+3H2O (3)
Hg
(中间化合物)
此中间化合物很不稳定，易分解成碘化二汞铵：
Hg
•
O NH2I
Hg
(中间化合物)
因此可将反应式合并，写成：
Hg2NI + H2O
NH4OH+2(HgI2·2KI)+3NaOH
Hg2NI + 4KI+3NaI+4H2O
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Xiamen University
商务部《出口鳗鱼技术指南》项目 水产饲料企业高级管理干部培训班
• 关于氮-pro换算系数
• 对于氮含量换算成pro含量的系数，历来采用6.25， 这个数值是以pro平均含氮而导出的数值。
• 一般手册上列出了一部分换算系数，用时可查， 蛋=6.25，肉=6.25，牛乳=6.38，稻米=5.95，大麦 =5.83，玉米=6.25，小麦=5.83，麸皮=6.31，面粉 =5.70，如果手册上查不到的样品则可用6.25，一 般在写报告时要注明采用的换算系数以何物代替。
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催化剂 Xiamen University
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加热
• 含氮样品+H2SO4
(NH4)2SO4 +CO2 + SO2 +H2O (1)
• (NH4)2SO4 + 2NaOH ==Na2SO4+2NH4OH (2)
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Coomassie Dye-Based 蛋白质定量
O CH2CH3
PROTEIN
Coomassie G-250
NH
+
CH3
CH3
C
+ CH3CH2 N
CH2
N CH2CH3 CH2
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Xiamen University
商务部《出口鳗鱼技术指南》项目 水产饲料企业高级管理干部培训班
考马斯亮蓝染色法
• 考马斯亮蓝在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和 染料结合符合比尔定律 ，因此可以通过测定染料 在595nm处光吸收的增加量得到与其结合的蛋白 质量。该法简单、迅速、干扰物质少、灵敏度高 10－100 g (比Lowry法灵敏4倍)。
• 利用紫外吸收法测定蛋白质含量的优点是迅速、 简便、不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定。
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总蛋白定量分析－BCA(Bicinchoninic acid， 二辛可宁酸、二羧基二喹啉)
SO3-
SO3Na
Acid
BLUE
Amax = 595nm
Pr年03月31日
Xiamen University
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蛋白质含量的测定
检测 波长 检测 范围 繁琐 程度
应用
紫外吸收法 双缩脲法
XXiaiammeennUUnnivievresristyity
生物化学实验 商务部《出口鳗鱼技术指南》项目
水产饲料企业高级管理干部培训班
实验七、蛋白质含量的测定
厦门 20翔16安年03月203116日年0厦3月门31日
Xiamen University
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缓缓滴入瓶内以防烧瓶破裂。
5)消化液分别倒入2支10ml有刻度离心管(或试管)中，用少量 蒸馏水多次洗涤烧瓶，溶液分别倒回离心管(或试管)中， 用少量蒸馏水多次洗涤烧瓶，溶液分别倒回离心管(或试 管)中，并稀释至刻度，即得待测液。
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基本原理： 碱性条件下，蛋白将Cu2+还原为Cu+， Cu+与
BCA试剂形成紫颜色的络合物，测定其在562nm 处的吸收值，并与标准曲线对比，即可计算待测 蛋白的浓度。
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微量凯氏定氮法
• 被测的天然含氮化合物与浓硫酸共热时分解出氨， 氨与硫酸反应生成硫酸铵。在凯氏定氮仪中加入 强碱消化液，使硫酸铵分解出氨。用水蒸汽蒸馏 法将氨蒸入无机酸溶液中，然后再用标准酸溶液 进行滴定，滴定所用无机酸的量(mol)相当于被测 样品中氨的量(mol)，根据所测得的氨量即可计算 样品的含氮量。
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蛋白质概述
(6) 光合作用：叶绿体蛋白。 (7)保护作用：毛发、肌腱、韧带、软骨等。 (8) 凝血作用：凝血蛋白。 (9)通透作用：生物膜，表皮内在蛋白。 (10)毒素作用：肉毒毒素等。 (11)遗传讯息调控：受体蛋白、视觉蛋白、味觉蛋白。 (12)精神蛋白：预测 (13)重要的能量来源
蛋白质概述 • 蛋白质是生物体最重要的生化物质之一。
• 功能：
(1) 催化：酶是蛋白质，决定了代谢的类型。 (2) 激素：多肽激素，有调控作用
如胰岛素调节血糖浓度。 (3) 载体：如血红蛋白，可运载O2和CO2；
无脊椎动物的血蓝蛋白功能一样； 在6000m高山上发现有蓝血人； (4) 运动：肌肉中的肌球肌动蛋白，伸缩功能。 (5) 免疫：引起免疫的抗体是蛋白质，称免疫球蛋白。
280 nm
540 nm
0.1-1.0 mg 1-10 mg
简便
较简便
纯度高样品
快速但不十 分精确
Folin-酚法
考马斯亮蓝 法
650 nm
595 nm
25-250µg 10-100 µg
较简便
较简便
受多种因素干 扰
干扰较少
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蛋白质的测定方法分两大类：
一类是利用蛋白质 的共性即含氮量 、肽键和折射率 等测定蛋白质含 量；
另一类是利用蛋白 质中的氨基酸残 基、酸性和碱性 基因以及芳香基 团等测定蛋白质 含量。
• 碘化二汞铵溶液呈黄色，可用752型分光光度计490nm波长测定。
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仪器：
仪器及试剂
30ml微量凯式烧瓶6支；玻璃研钵1副；50ml量瓶1
个；10ml离心管2支；10ml试管10支；电炉1台；
CO2+SO2+H2O+NH3 ↑ (NH4)2SO4
H2O+Na2SO4+NH3↑
NH4HB4O7+H2O
滴 NH4HB4O7+HCl+H2O 定
NH4Cl+H3BO3
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10mg
540 nm
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Folin-酚试剂法(Lowry法)
• Folin酚反应是在双缩脲反应的基础上，引进Folin 试剂(磷钼酸-磷钨酸试剂)，蛋白质-铜络合物能还 原磷钼酸-磷钨酸试剂，生成蓝色物质。在一定条 件下，蓝色强度与蛋白质的量成正比例。本法的 优点是操作简便、灵敏度高(20-250g)、较紫外吸 收法灵敏10-20倍，较双缩脲法灵敏100倍。其不 足之处是此反应受多种因素干扰。
•准确灵敏：BCA试剂的蛋白质测定范围是20-2000g/mL； Micro BCA试剂测定范围是0.5-20 g/mL
•快速：45min内完成测定，比经典的Lowry法快4倍而且更加 方便 •经济实用：除试管外，测定可在微孔板中进行，大大节约样 品和试剂用量 •不受样品中离子型和非离子型去污剂影响 •检测不同蛋白质分子的变异系数小于考马斯亮蓝
消化炉
蒸馏单元及电位滴定仪
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双缩脲法
原理：当脲加热至180oC时，两分子脲缩合，放出一分子氨而 形成双缩脲。双缩脲在碱性条件下能与硫酸铜生成紫红色络合 物，即发生双缩脲反应。蛋白质分子中含有肽键，与双缩脲结 构相似，故蛋白质与碱性硫酸铜也能形成紫红色络合物,在一 定条件下其颜色深浅与蛋白质浓度成正比，可用来进行蛋白质 定量。最大波长位于540nm处。本法测定蛋白质范围为1-
吸管数支；移液管数支；752型分光光度计(公用)
试剂：
浓H2SO4(分析纯)、20%三氯醋酸、H2O2、2N氢氧 化钠溶液、奈氏试
剂、标准硫酸铵溶液
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实验步骤
1)准确称取鱼肉3.0g，剪碎，至研钵中研磨成匀浆，用蒸馏水 反复 多次冲洗研钵，其液体注入50ml量瓶并稀释至刻度，为 匀浆液。
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紫外分光光度法
• 由于蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含 有共轭双键，因此蛋白质具有吸收紫外线的性质， 吸收高峰在280 nm波长处。在此波长范围内，蛋 白质溶液的光吸收值(OD280)与其含量呈正比关系， 可用作定量测定。
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Xiamen University
具体测定方法：
商务部《出口鳗鱼技术指南》项目 水产饲料企业高级管理干部培训班
•凯氏定氮法:最常用的， 国内外应用普遍。
染料结合反应
凯氏定氮常量法、 半微量法和微量法
双缩脲反应
•国外： 红外分析仪
•酚试剂法
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• 定义
蛋白质概述
蛋白质是含氮的有机化合物，分子量很大。
主要由C、H、O、N、S五种元素组成。某些
蛋白质中还含有微量的 P、Cu、Fe、I 等。
蛋白质的含氮量比较恒定，平均为16%，因
此可通过测定样品的含氮量进而推算蛋白质
含量。
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4)将消化管置于消化架上，使管颈与架成30°倾斜，在通
风橱内进行消化，消化过程应常转动消化管，待白色烟 雾消失后，加入2-3滴H2O2，消化至溶液透明(约2-3h)即可。 注意：加H2O2是必须停火，冷却，然后H2O2由管壁
• 蛋白质含氮量通常在16 %左右，将凯氏定氮法测 得的含氮量乘上蛋白质换算系数6.25，便得到该 样品的蛋白质含量。
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消 化
N +浓H2SO4
NH3+H2SO4
蒸
馏 (NH4)2SO4+NaOH
吸
收
NH3+H3BO3
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2)取1支10ml离心管，加1ml匀浆液和1ml20%三氯醋酸，搅拌， 离心3min，上清液用作测定非蛋白质氮。
3)取2支消化管，注明号码，按下表分别加入样品和试剂：
项目 总蛋测定 非蛋白氮测定
号码 1 2
样 品(ml) 匀浆液1ml
上清液
H2SO4(ml)
1 与上清液等体
积
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实验目的要求
学习和掌握使用奈氏试剂来测定生物材料中蛋白质 含量的原理和操作技术。
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基本原理
含氨有机物在适当催化剂作用下，与浓硫酸共热 而被分离(消化)后，而含碳化物氧化成二氧化碳 逸散，其中的氮全部以氨的形式游离出来与硫酸 结合成不挥发的硫酸铵而存在于消化液中，硫酸 铵与氨氧化钠作用，产生氢氧化铵和硫酸钠，在 有氢氧化钠存在的情况下，氢氧化铵与奈氏试剂 (Nesslers reagent，含 HgI2和KI)作用产生碘化二汞 铵溶液。
Hg
• NH4OH+2(HgI2·2KI)+3NaOH
O
NH2I + 4KI+3NaI+3H2O (3)
Hg
(中间化合物)
此中间化合物很不稳定，易分解成碘化二汞铵：
Hg
•
O NH2I
Hg
(中间化合物)
因此可将反应式合并，写成：
Hg2NI + H2O
NH4OH+2(HgI2·2KI)+3NaOH
Hg2NI + 4KI+3NaI+4H2O
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• 关于氮-pro换算系数
• 对于氮含量换算成pro含量的系数，历来采用6.25， 这个数值是以pro平均含氮而导出的数值。
• 一般手册上列出了一部分换算系数，用时可查， 蛋=6.25，肉=6.25，牛乳=6.38，稻米=5.95，大麦 =5.83，玉米=6.25，小麦=5.83，麸皮=6.31，面粉 =5.70，如果手册上查不到的样品则可用6.25，一 般在写报告时要注明采用的换算系数以何物代替。
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加热
• 含氮样品+H2SO4
(NH4)2SO4 +CO2 + SO2 +H2O (1)
• (NH4)2SO4 + 2NaOH ==Na2SO4+2NH4OH (2)
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Coomassie Dye-Based 蛋白质定量
O CH2CH3
PROTEIN
Coomassie G-250
NH
+
CH3
CH3
C
+ CH3CH2 N
CH2
N CH2CH3 CH2
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考马斯亮蓝染色法
• 考马斯亮蓝在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和 染料结合符合比尔定律 ，因此可以通过测定染料 在595nm处光吸收的增加量得到与其结合的蛋白 质量。该法简单、迅速、干扰物质少、灵敏度高 10－100 g (比Lowry法灵敏4倍)。
• 利用紫外吸收法测定蛋白质含量的优点是迅速、 简便、不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定。
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总蛋白定量分析－BCA(Bicinchoninic acid， 二辛可宁酸、二羧基二喹啉)
SO3-
SO3Na
Acid
BLUE
Amax = 595nm
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蛋白质含量的测定
检测 波长 检测 范围 繁琐 程度
应用
紫外吸收法 双缩脲法
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商务部《出口鳗鱼技术指南》项目 水产饲料企业高级管理干部培训班
缓缓滴入瓶内以防烧瓶破裂。
5)消化液分别倒入2支10ml有刻度离心管(或试管)中，用少量 蒸馏水多次洗涤烧瓶，溶液分别倒回离心管(或试管)中， 用少量蒸馏水多次洗涤烧瓶，溶液分别倒回离心管(或试 管)中，并稀释至刻度，即得待测液。