复方板蓝根提取工艺与靛玉红含量测定

福建畜牧兽医第33卷第5期2011年
复方板蓝根提取工艺与靛玉红含量测定
陈冬金1孙世坤1张红云2
(1.福建省农业科学院畜牧兽医研究所福州350013;2.福建农林大学动物科学学院福州350002)
摘要通过正交试验优选出复方板蓝根最佳的提取工艺,并建立反相高效液相色谱法(Reverse Phase High Performance Liquid Chromatography ,RP-HPLC )测定该复方的靛玉红含量。

含量测定采用外标法。

结果表明不同工艺的提取方法中,加10倍水,煎煮1次,煎煮时间为2h 的提取工艺,含量最高,达6.86μg/mL ;HPLC 法测定靛玉红,其线性范围在2.0~20.0μg/mL 内靛玉红的含量与峰面积相应值呈良好的线性关系(r=0.972),平均加样回收率为96.54豫(n=6),说明HPLC 方法简便、准确、重复性好,可作为该产品质量控制方法。

关键词复方板蓝根提取工艺靛玉红高效液相色谱
文献标识码:A
文章编号:1003-4331(2011)05-0008-03
Determination and distill of indirubin in the compound of radix isatidis
Chen Dongjin 1Sun Shikun 1Zhang Hongyun 2
(1.Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine,Fujian Academy of Agricultural Sciences,Fuzhou 350013
;
2.Animal College,Fujian Agriculture and Forestry university,Fuzhou 350002
)
Abstract To optimize the process of extraction and purification of compound of radix isatidis and develop a method to determine in
⁃
dirubin in the Compound of Radix isatidis by RP-HPLC
(Reverse Phase High Performance Liquid Chromatography ).Ascertain the
distill technology of the Compound.Contents were quantified with external standard method.The Result showed that in the different conlentration ,the method with adding water of 10times,one time,cook for 2hours is best,which the content of indirubin(6.86
μg/mL)
is most .Indirubin was determined by HPLC.A good linear relationship between the peak area and mass concentration of the Indirubin
within the range of 2.0~20.0μg/mL (r=0.972);The average recoverys was 96.54%(n=6).The method of HPLC was proved to be simple
,precise and specific.It was suitable to be applied for the product quality control.Key words Compound of Radix isatidis Distill Technology Indirubin HPLC
复方板蓝根是由板蓝根、大青叶等组成的中药复方口服液。

板蓝根为十字花科植物菘蓝的根,大青叶为菘蓝的叶,板蓝根主要化学成分为靛蓝、靛玉红,大青叶的主要化学成分有菘蓝苷、靛蓝、靛玉红、色胺酮,以及挥发油等。

大青叶与板蓝根味苦,性寒。

归心、胃经。

板蓝根、大青叶[1-2]有抗菌、抗病毒、抗内毒素活性、增强免疫系统功能的作用,该复方具有较强的抗菌抗病毒、增强免疫力等功效。

中药口服液体制剂与相应的颗粒剂相比较[3],因液体制剂分散度大,故吸收较快,利于治疗急症,作用缓和,能减少药物对胃肠道的局部刺激性,且毒副作用较低。

更适合于中兽药制剂的生产及在畜禽病害防治的规模化推广使用。

板蓝根与大青叶目前大部分是制成颗粒剂、冲剂、糖浆、片剂,尚未有复方板蓝根口服液的生产与使用。

本文拟探讨研究复方板蓝根口服液的提取工艺和含量测定方法,以其为该制剂在畜禽上的应用提供基础研究,为该复方生产工艺和质量控制提供科学依据。

1试验仪器与试剂
Waters 高效液相色谱仪;KQ3200DE 型医用数控超声波清洗器;Stattorius BP211D 电子天平(d=0.01mg );可控硅控温水浴锅GKC ;数显式电热恒温干燥箱;靛玉红对照品(中国药品生物制品检定所,批号:717-200204,供含量测定用);板蓝根、大青叶购自福建同春中药有限公司,其产地分别为湖北和内蒙古,产品批号分别为060816和060928;乙腈:色谱纯,美国HoneyWell 公司;甲醇:色谱纯;双蒸馏水;其余试剂均为分析纯。

2方法与结果
2.1复方板蓝根靛玉红提取工艺板蓝根600g 、大青叶900g ,按正交试验因素水平安排表进行提取制备(见表1),滤液浓缩至相对密度为1.30~1.33的稠膏,加水至规定量,搅匀,静置,滤过,灌封,即得复方板蓝根。

每个试验样本分装3瓶。

最终获得9个样品,编号为1、2、3、4、5、6、7、8、9。

2.2HPLC 法测定样品含量[4-5]
2.2.1色谱条件Hanbon C18柱,4.6mm ×250mm ,5μm ;流动相:乙腈-水(60:40);使用前0.45μm 滤
作者简介:陈冬金(1981-),女,硕士研究生,主要从事兽药研
发及畜禽遗传育种,E-mail:dongjin99@ 。

愿
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膜抽滤,超声脱气30min ;流速1.0mL/min ,检测波长544nm ,柱温30℃;进样20μL 。

2.2.2对照品与供试品溶液的制备取靛玉红对照品2.0mg ,于10mL 容量瓶中加甲醇,超声处理溶解定容为200μg/mL ,分别取0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL 至10mL 容量瓶中定容,制成靛玉红含量分
别为2、4、8、12、16、20μg/mL 的对照品溶液。

取本品
复方板蓝根2瓶,充分振摇,倾出内容物,混匀,精密量取20mL ,加饱和硫酸钠水溶液10mL ,用乙醚-正丁醇(1:1)混合溶液振摇提取4次,每次10mL ,合并提取液,蒸干,残渣加甲醇使溶解,转移至10mL 容量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,用微孔滤膜(0.45μm )滤过,即得。

2.2.3系统适应性试验依上述色谱条件,分别精密吸取对照溶液与供试品溶液20μL ,注入高效液相色谱仪,记录色谱图。

观察标准品和样品色谱图的峰形以及样品中靛玉红峰是否与其他组分的峰分离。

从图1、图2可见,靛玉红保留时间为8.399min 。

本试验条件下靛玉红以及靛玉红与其他组分分离完全,表明其他组分对测定无干扰,系统适应性良好。

靛玉红的理论塔板数不小于4000。

图1靛玉红标准品溶液色谱图
图2复方板蓝根HPLC 色谱图
2.2.4方法性能考察
1)线性关系的考察。

精密吸取靛玉红浓度为2、4、8、12、16、20μg/mL 的对照品溶液各20μL 注入
高效液相色谱仪,每个浓度各进3针,按上述色谱条件测定峰面积,求平均值。

以靛玉红浓度为横坐标,以峰面积值为纵坐标,进行回归分析得回归方程:Y=2.51×103X+6.17×103,R=0.972。

标准曲线见图3。

图3靛玉红标准曲线
2)精密度试验。

精密量取对照品溶液20μL ,重复进样5次,记录各进样峰面积值。

并根据回归方程和样品处理的稀释倍数,计算出各个浓度大小,求RSD 大小。

靛玉红峰面积RSD 为0.40%,表明精密度良好。

3)稳定性试验。

精密吸取同一供试品溶液20μL ,分别于0、2、4、8、12、24h 进样1次,测定靛玉红的含量,得出RSD 为0.91%,表明供试品溶液在室温下放置24h 下稳定。

4)重复性试验。

取同一供试品溶液5份,按照供试品溶液制备的操作制备样品溶液5份,按样品含量测定法测定靛玉红含量,求RSD 大小。

RSD 为0.15%,表明该方法重复性良好。

5)样品加样回收率试验。

取6份已知浓度为13.90μg/mL 的样品各9mL ,分别加入靛玉红对照品溶液2、4、8、12、16、20μg/mL 各1mL ,按样品测定法测定,计算回收率。

靛玉红平均回收率为96.54%。

2.2.5样品测定及数据处理分别吸取供试品溶液各20μL 注入高效液相色谱仪,每个样品共进3针,按上述色谱条件,求得峰面积平均值,以外标法计算含量。

靛玉红含量方差分析表表明[6],3个因素对靛玉红提取的影响都不显著(见表2)。

由于各因素对提取工艺的影响都不显著,不必再进行各因素水平间的多重比较。

此时,可直观地从表3中选择测定值大的水平A 2、B 1、C 3组合成最优组合A 2B 1C 3。

即加10倍水,煎煮1次,时间为2h 。

3讨论与结论
3.1提取工艺药典规定的板蓝根颗粒(1990-2005
表1正交试验表
水平因素
A 加水量(倍数)
B 煎煮次数
C 煎煮时间(h )
123
8
1012123
1.01.5
2.0
注:A 因素中的加水量倍数是指药材总量的倍数,即
1500g 的药材要加12000g 的水(8倍
)。

怨
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年版)的生产工艺采用水煎醇沉法,目前板蓝根制剂也多采用水醇法,靛玉红在板蓝根中以苷的形式存在,在热水中可溶出,但分子中含有酯键,易被水解为吲哚醇和糖酮酸,其溶解度降低,醇沉时易被沉淀物吸附和包裹而损失。

李影等[7]对板蓝根冲剂生产中靛玉红含量进行跟踪测定,结果表明,靛玉红的损失主要来自浓缩和醇沉两个环节。

所以,本试验采用水提方法筛选最优的水提工艺,从靛玉红含量方差分析表和正交试验数据可以得出:加10倍水,煎煮1次,煎煮时间为2h 的提取工艺为最佳工艺。

3.2检测方法近十年来,板蓝根制剂发展很快,但质量差异很大,有些产品根本检不出靛玉红含量。

究其原因:原药材质量差,工艺不合理,缺乏完善的
质量标准和统一的检测方法。

靛玉红含量的测定方法有氧化滴定法、直接比色测定法、薄层色谱法、柱色谱-比色法、反相高效液相色谱法等。

王邦林[8]等用高效液相仪对不同品种板蓝根、大青叶中靛玉红、靛蓝进行外标法定量分析,结果发现反相高效液相法测定靛蓝、靛玉红含量,快速简便、灵敏度较高、重现性好。

从试验结果也可看出,高效液相色谱法具有精密度高、稳定性好、专属性强、简便快速等特点,作为制备工艺质量考察的控制方法有实际意义。

3.3HPLC 法色谱条件的选择(1)柱温:为室温时,受外界影响较大,基线有时漂移且重复性不好;当为25℃时,出峰时间延长,造成流动相的浪费;靛玉红温度过高会分解,适当提高柱温至30℃能够克服以上缺陷,基线平稳且使分离较好,出峰时间适中,保留时间约为8.399min 。

(2)波长:复方板蓝根溶液经过分光光度计进行波长扫描,发现在544nm 处有最大吸收峰,再根据靛玉红在544nm 处也有较强的吸收峰,所以,选择544nm 作为检测波长。

参考文献:
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表2靛玉红含量方差分析表
表3正交试验结果表
方差来源离差平方和自由度均方F 值F 0.05(2,2)加水量(A )煎煮次数(B )煎煮时间(D )
误差
2.81
23.426.897.972222
1.4111.713.453.98
<18.63ns
<1
19
编号因素
靛玉红含量(μg/mL )A
加水量(倍)
B 煎煮次数(次)
C 煎煮时间(h )123456789
T 1T 2T 3888
1010101212129.9410.866.94123123123
15.628.213.90 1.0
1.5
2.02.01.01.51.52.01.09.745.8212.19 6.681.961.306.862.221.782.084.030.8327.74(T )
2011年中国畜牧兽医学会期刊编辑学分会年会暨中国畜牧兽医科技期刊发展论坛顺利召开
2011年8月29日,“2011年中国畜牧兽医学会期刊编辑学分会年会暨中国畜牧兽医科技期刊发展论坛”在吉林省延边州延吉市隆重召开。

中国畜牧兽医学会期刊编辑学分会理事长冯艳秋主持开幕式,中国畜牧兽医学会秘书长阎汉平先生参加会议并致辞,中国社会科学院法学研究所李顺德研究员、中国农业科学院家禽研究所戴有理研究员作精彩演讲。

同时分会对中国畜牧兽医优秀期刊、优秀团体、先进个人进行了表彰,本刊编辑部谢新东、彭春香、张爱华分别获评优秀主编、优秀编辑、优秀美编。

各会员单位近70位代表参加了此次盛会,并就期刊的经营、改革、发展等方面进行了交流和探讨。

(本刊讯)
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