纯化方案——精选推荐

包含体蛋白质的纯化方案
1、破碎：
1、1、破碎缓冲液组成： 50mM Tris pH7.0-8.5左右,1mM EDTA ，溶菌酶(10 µg/g cell)，；或 20 mmol/l Tris-HCl, pH 7.5,1mmol/lEDTA, 0.1mM PMSF, DNAse (10 µg/g cell)细胞破碎缓冲液中不含脲等变性剂，故不溶解包涵体。

1、2、超声波破碎：单纯超声破碎，在小规模下且菌量较少的情况下效果较好，由于能量传递和局部产热等原因，很难用于大体积细胞悬液的破碎，这样部分未破碎细胞与包涵体混在一起，给后期纯化带来困难。

因此，在较大规模纯化时先用溶菌酶破碎细菌的细胞膜，再结合超声破碎方法，可显著提高包涵体的纯度和回收率。

占空比50％，超声15s，停15s，10－20min。

破碎后的匀浆在4℃，15,000 rpm下离心30 min，弃去上清液。

2、洗涤：
为了除去包涵体上粘附的杂质，如膜蛋白或核酸，应用洗涤液洗涤包涵体，通常用低浓度的变性剂,过高浓度的尿素或盐酸胍会使包涵体溶解，如2M尿素在50mM Tris pH7.0-8.5左右,1mM EDTA中洗涤。

此外可以用温和去垢剂TritonX-100洗涤去除膜碎片和膜蛋白。

离心后的沉淀物质用上述缓冲液进行悬浮，搅拌洗涤20－30min，在4℃，12,000 rpm下离心30 min，弃去上清液。

重复一次。

再用50mM Tris pH7.0-8.5左右洗涤，以去除Buffer中的EDTA。

20－30min，在4℃，12,000 rpm下离心30 min，弃去上清液
3、溶解：
一般用强的变性剂如尿素（6-8M）、盐酸胍（GdnHCl 6M），通过离子间的相互作用，打断包涵体蛋白质分子内和分子间的各种化学键，使多肽伸展，一般来讲，盐酸胍优于尿素，因为盐酸胍是较尿素强的变性剂，它能使尿素不能溶解的包涵体溶解，而且尿素分解的异氰酸盐能导致多肽链的自由氨基甲酰化，特别是在碱性pH值下长期保温时。

或用去垢剂，如SDS、正十六烷基三甲基铵氯化物、Sarkosyl等，可以破坏蛋白内的疏水键，也可溶解一些包涵体蛋白质。

另外，对于含有半胱氨酸的蛋白质，分离的包涵体中通常含有一些链间形成的二硫键和链内的非活性二硫键。

还需加入还原剂，如巯基乙醇、二硫基苏糖醇（DTT）、二硫赤藓糖醇、半胱氨酸。

还原剂的使用浓度一般是50-100mM 2-BME或DTT，也有文献使用5mM浓度。

在较粗放的条件下，可以使用5ml/l的浓度。

还原剂的使用浓度与蛋白二硫键的数目无关，而有些没有二硫键的蛋白加不加还原剂无影响，如牛生长激素包涵体的增溶。

对于目标蛋白没有二硫键某些包涵体的增溶，有时还原剂的使用也是必要的，可能由于含二硫键的杂蛋白影响了包涵体的溶解。

洗完后将沉淀用10～15 ml的溶解Buffer（8M尿素，0.2mM DTT或100mM2ME，20mM Tris，0.5M NaCl，2% Triton,pH8.0）悬浮，室温放置或搅拌5-6小时或过夜后用,12,000 rpm下离心30 min，弃去沉淀。

4、过Ni柱：
Ni柱纯化操作说明
A、过柱前的注意事项：
a、样品必须澄清、无颗粒物，否则会堵塞柱子、缩短其使用寿命；
b、包含体洗涤的最后一步及溶解时所用的Buffer中不能含EDTA、DTT、2ME；
c、确保样品及Binding Buffer中有适量的NaCl，以防止杂离子与Ni离子竞争；
B、过Ni柱的操作步骤：
a、用DDW洗涤，洗去20％的乙醇、除尽基质中的空气，并能防止下一步中Ni离子沉淀；
b、5×柱体积的Charge Buffer（50mM NiSO4）充电；
c、5×柱体积的DDW洗涤，去游离的Ni离子；
d、10×柱体积的Binding Buffer（20mM Tris-HCl,0.5M NaCl,5mM咪唑，pH8.0）
平衡；
e、上样（手工上样，样品体积应根据目的蛋白的浓度来确定）；
f、10×柱体积的Binding Buffer洗涤，至无蛋白检出，收集流出液；
g、Elution Buffer（20mM Tris-HCl,0.5M NaCl,500－1000mM咪唑，pH8.0）洗
脱，每次1ml，应呈现正态分布（两边稀，中间浓）；
h、10×柱体积的Binding Buffer洗涤。

此时，即可用于纯化同种蛋白，很少需
要重新充电。

注：同种蛋白纯化5～10次后，应进行strip和re-charge。

C、柱的清洗与保存：（最好每天清洗一次）
1）、去Ni离子：a、5×柱体积的Strip Buffer（20mMTris-HCl,0.5M NaCl,50mM EDTA，pH7.4）洗涤；b、10×柱体积的DDW洗涤。

2）、去沉淀的蛋白质：a、5×柱体积的0.5M NaOH装满柱子，静置0.5～2hr；b、DDW洗涤，至流出液的pH值为7。

3）、保存：20％乙醇洗涤，再加20％乙醇保存于4℃。

D、柱的再生：
当流速很慢、充电后基质不变成蓝绿色时，应进行柱的再生。

a、2×柱体积的6M盐酸胍洗涤，然后3×柱体积的DDW洗涤；
b、1×柱体积的2％SDS洗涤；
c、5×柱体积的0.5M NaOH装满柱子，静置0.5～2hr；
d、5×柱体积的DDW洗涤，然后5×柱体积的100mM EDTA，pH8.0洗涤；
e、3×柱体积的DDW洗涤，然后3×柱体积的20％乙醇洗涤；
f、20％乙醇保存于4℃。

5、复性：
由于包涵体中的重组蛋白缺乏生物学活性，加上剧烈的处理条件，使蛋白的高级结构破坏，因此重组蛋白的复性特别必要。

通过缓慢去除变性剂使目标蛋白从变性的完全伸展状态恢复到正常的折叠结构，同时去除还原剂使二硫键正常形成。

一般在尿素浓度4M左右时复性过程开始，到2M 左右时结束。

对于盐酸胍而言，可以从4M开始，到1.5M 时复性过程已经结束。

5、1包涵体蛋白复性方法
稀释复性：直接加入水或缓冲液，放置过夜，缺点是体积增加较大，变性剂稀释速度太快，不易控制。

目前稀释法主要有一次稀释、分段稀释和连续稀释三种方式。

透析复性：好处是不增加体积，通过逐渐降低外透液浓度来控制变性剂去除速度，有人称易形成无活性蛋白质聚体，且不适合大规模操作，无法应用到生产规模。

超滤复性：在生产中较多的使用，规模较大，易于对透析速度进行控制，缺点是不适合样品量较少的情况，且有些蛋白可能在超滤过程中不可逆的变性。

柱上复性：是最近研究较多并成功的在生产中应用的一种复性方法，包涵体蛋白变性后，在色谱柱上复性，大致可分成疏水柱复性及凝胶柱复性两类。

其中的凝胶柱复性均是用Sephacry1S-100或Superdex75 等分子筛填料，柱较长（40cm-100cm不等）。

相比稀释和透析两种方法，色谱柱复性回收率高（高达90%以上）、快速、易放大，样品稀释倍数小（一般五倍左右）[5]
高蛋白质浓度下的复性：通常有两种方法，一是缓慢地连续或不连续地将变性蛋白加入到复性缓冲液中，使得蛋白质在加入过程中或加入阶段之间有足够的时间进行折叠复性；二是采用温度跳跃式复性，即让蛋白质先在低温下折叠复性以减少蛋白质聚集的形成，当形成聚集体的中间体已经减少时，迅速提高温度以促进蛋白质折叠复性。

此外，吸附法、反胶束法和双水相萃取法等都可用蛋白质的复性。

5、2包涵体蛋白复性效率
复性是一个非常复杂的过程，除与蛋白质复性的过程控制相关外，还很大程度上与蛋白质本身的性质有关，有些蛋白非常容易复性，如牛胰RNA酶有12对二硫键，在较宽松的条件下复性效率可以达到95%以上，而有一些蛋白至今没有发现能够对其进行复性的方法如IL-11，很多蛋白的复性效率只有百分之零点几，如在纯化IL-2时以十二烷基硫酸钠溶液中加入铜离子（0.05%SDS，7.5-30u mol/l CuCl2）的方法，25-37°C下反应3小时，再EDTA至1m mol/l终止反应，复性后的二聚体低于1%。

一般说来，蛋白质的复性效率在20%左右。

5、2、1影响复性效率的因素：
蛋白质的复性浓度：正确折叠的蛋白质的得率低通常是由于多肽链之间的聚集作用，蛋白质的浓度是使蛋白质聚集的主要因素，因而，一般浓度控制在
0.1-1mg/ml；如果变性蛋白加入复性液中过快，容易形成絮状沉淀，可能是蛋白重新凝聚的缘故。

可采用再水浴和磁力搅拌下，逐滴加入变性蛋白，使变性蛋白在复性液中始终处于低浓度状态。

pH和温度：复性缓冲液的pH值必须在7.0以上，这样可以防止自由硫醇的质子化作用影响正确配对的二硫键的形成，过高或过低会降低复性效率，最适宜的复性pH值一般是8.0-9.0。

此外，影响复性效率的因素还有，变性剂的起始浓度和去除速度、氧化还原电势、离子强度、共溶剂和其他添加剂的存在与否等。

5、2、2提高包涵体蛋白的复性产率
氧化-还原转换系统：对于含有二硫键的蛋白，复性过程应能够促使二硫键形成。

常用的方法有：空气氧化法、使用氧化交换系统、混合硫化物法、谷胱甘肽再氧化法及DTT再氧化法。

最常用的氧化交换系统是GSH/GSSG,而cysteine/cystine、
cysteamine/cystamine、DTT/GSSG、DTE/GSSG等也都有应用。

氧化交换系统通过促使不正确形成的二硫键的快速交换反应提高了正确配对的二硫键的产率。

通常使用1-3m mol/l还原型巯基试剂,还原型和氧化型巯基试剂的比例通常为10：1—5：1。

添加低分子化合物：低分子化合物自身并不能加速蛋白质的折叠，但可能通过破坏错误折叠中间体的稳定性，或增加折叠中间体和未折叠分子的可溶性来提高复性产率。

如盐酸胍、脲、烷基脲、以及碳酸酰胺类等，在非变性浓度下是很
有效的促进剂。

蛋白质的辅因子、配基或底物亦可起到很好的促折叠作用，如蛋白质的辅因子Zn2+或Cu2+可以稳定蛋白质的折叠中间体,从而防止了蛋白质的聚集，加入浓度大于0.4 mol/lTris缓冲液可提高包涵体蛋白质的折叠效率。

浓度为0.4-0.6M L-Arg有助于增加复性中间产物的溶解度。

成功的应用于很多蛋白如t-PA的复性中，可以抑制二聚体的形成。

NDSBs是近年来出现的可促进蛋白复性的新家族, NDSBs由一个亲水的硫代甜菜碱及一个短的疏水集团组成，故不属于去垢剂,不会形成微束,易于透析去除，目前，常用的有NDSB-195，NDSB-201，NDSB-256。

PEG-NaSO4两相法：用PEG和NaSO4作为成相剂,然后加入盐酸胍，再把变性的还原的蛋白质溶液加入其中进行复性,但这种方法需复性的变性蛋白质的浓度必须低。

分子伴侣和折叠酶等：这类蛋白质主要包括硫氧还蛋白二硫键异构酶、肽酰-辅氨酰顺反异构酶、分子伴侣、FK506结合蛋白、Cyclophilin等。

分子伴侣和折叠酶等不仅可在细胞内调节蛋白质的折叠和聚集过程的平衡，而且可在体外促进蛋白质的折叠复性。

其它：提高复性率的策略还有许多，如：非离子型去垢剂，尤其是离子型或两性离子去垢剂或表面活性剂CHAPs、Triton X-100、磷脂、laury lmaltosid、Sarkosyl等对蛋白质复性有促进作用；待折叠复性的蛋白质的抗体可有效协助其复性；多聚离子化合物如肝素不仅可以促进蛋白质的作用，而且具有稳定天然蛋白质的作用。

5、3复性效果的检测：
根据具体的蛋白性质和需要，可以从生化、免疫、物理性质等方面对蛋白质的复性效率进行检测。

凝胶电泳：一般可以用非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳可以检测变性和天然状态的蛋白质，或用非还原的聚丙烯酰胺电泳检测有二硫键的蛋白复性后二硫键的配对情况。

光谱学方法：可以用紫外差光谱、荧光光谱、圆二色性光谱（CD）等，利用两种状态下的光谱学特征进行复性情况的检测，但一般只用于复性研究中的过程检测。

色谱方法：如IEX、RP-HPLC、CE等，由于两种状态的蛋白色谱行为不同，生物学活性及比活测定：一般用细胞方法或生化方法进行测定，较好的反映了复性蛋白的活性，值得注意的是，不同的测活方法测得的结果不同，而且常常不能完全反映体内活性。

黏度和浊度测定：复性后的蛋白溶解度增加，变性状态时由于疏水残基暴露，一般水溶性很差，大多形成可见的沉淀析出。

免疫学方法：如ELISA、WESTERN等，特别是对结构决定簇的抗体检验，比较真实的反映了蛋白质的折叠状态。

5、4、具体方案
透析复性：取变性上清,在缓冲液中(50mmol·L - 1 Tris2HCl pH 8. 0)复性。

利用复性液I（2 mol/L 尿素、 100 mmol/L Tris-HCl、 5 mmol/L EDTA, pH 7.5）将蛋白质于4 ℃透析4 h; 随后, 转入复性液II（0.5 mol/L 尿素、 1 mmol/L GSSG、 2 mmol/L GSH、 100 mmol/L Tris-HCl、 5 mmol/L EDTA, pH 7.5）4 ℃透析4 h; 然后, 于复性液III（1 mmol/L GSSG、 2 mmol/L GSH、 100 mmol/L Tris-HCl、 5 mmol/L EDTA、 5 mmol/L 精氨酸, pH 7.5）中4 ℃透析8 h, 中
间更换一次复性液III; 最后, 用复性液IV（100 mmol/L Tris-HCl、 5 mmol/L EDTA、 5 mmol/L精氨酸, pH 7.5）4 ℃透析8 h, 中间更换复性液IV一次。

金属鳌合层析复性
用5 ml 的Hitrap chelating 柱子，先用Ni 离子饱和，再用含8 M urea 的复性液平衡。

然后将100 ml 溶解了包涵体(5.7mg/ml 溶在8 M urea) 的样品加入柱中。

用平衡液将基线洗平，然后用200 ml 的线性梯度逐步由含8 M urea 的缓冲液过渡到复性缓冲液中。

然后用含0.2 M 的imidazole 将复性后的scFv 洗出柱子。

并考察了流速对复性率的影响。

用稀释法复性包涵体蛋白质
在稀释复性中，对pH, GSH与GSSG的比例与浓度，精氨酸浓度，样品量及复性温度等条件进行了优化。

优化后的复性缓冲液组成即做为其它复性方法的基础。

最优化的复性液组成为：20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 含0.5 M 精氨酸，1mM EDTA, 1 mM GSH 及1 mM GSSG，这也就是后面常提到的复性缓冲液。

25 ml 溶解了的包涵体(5.7 mg/ml 溶在8M urea) 样品稀释200 倍到此复性缓冲液中。

用脲素及pH 梯度凝胶过滤复性
先将HiLoad 16/60 Superdex 30用一个由上至下线性减少的urea 梯度(8 M 到0.4 M)，同时还存在一个从2-7.5 的pH 梯度平衡上部的60%的柱体积。

我们通过先在柱中加入0.4柱体积的pH 7.5 含0.4 M urea的复性缓冲液，随后用0.6 柱体积的线性梯度从pH 7.5 含0.4 M urea 的复性缓冲液变成8M urea pH 2 的溶液中来实现这一点。

这样当样品(溶于8M urea, pH 2.0 含5.7 mg/ml 的scFv 融合蛋白质) 加入柱顶后也同样处于与溶解液同样的环境中。

因为蛋白质分子很大，并被所选凝胶介质完全排阻在外，因此它向下的速度要比urea等小分子快得多。

这样可以通过预先形成的梯度，最后转移到柱子底部的含0.4 M urea 的复性缓冲液中，从而达到逐步脱除变性剂的目的。

这个转移的速度由流速来控制，因此我们对流速在一定范围内(0.02到1.0 ml/min) 对复性率的影响进行了研究。

同时也考察了样品的量(100 µl-1.0 ml) 对复性率的影响。

每管收集1.0 ml。

在对照实验中，用无梯度或仅有urea 梯度凝胶过滤复性做为对照。

其它条件与脲素及pH 梯度凝胶过滤复性一样。