胃癌BRCA1基因甲基化与BRCA1 mRNA表达的关系研究

胃癌BRCA1基因甲基化与BRCA1 mRNA表达的关系研究孙欣欣;王红兵;徐海洋
【摘要】目的：探讨乳腺癌易感基因1（BRCA1）启动子CpG岛甲基化与BRCA1 mRNA表达的相关性及其意义。

方法采用甲基化特异性PCR技术检测37例胃癌组织和对应癌旁组织及6例正常胃组织中BRCA1基因启动子CpG岛甲基化状态；采用逆转录PCR技术检测37例胃癌组织和对应癌旁组织及6例正常胃组织中BRCA1 mRNA 表达水平。

结果胃癌组织中 BRCA1基因启动子 CpG 岛总甲基化率为48.6%（18/37），显著高于癌旁组织[5.4%（2/37）]和正常胃组织[0.0%（0/6）]，差异有统计学意义（χ2=17.541、5.021，P均<0.05）。

胃癌组织中BRCA1 mRNA阳性表达率为48.6%（18/37），显著低于癌旁组织[94.6%（35/37）]和正常胃组织[100.0%（6/6）]，差异有统计学意义（χ2=19.215、5.520，P均<0.05）。

BRCA1基因启动子CpG岛甲基化与BRCA1 mRNA表达成负相关（ r=-0.515，P<0.05）。

结论 BRCA1基因启动子CpG岛甲基化可能是导致BRCA1 mRNA失表达的主要原因之一。

%Objective To investigate the relationship between the methylation of breast cancer susceptibility gene 1(BRCA1)promoter CpG island and the expression level of BRCA1 mRNA in gastric cancer and the signifi-cance. Methods Methylation-specific PCR was used to detect the methylation of BRCA1 gene promoter CpG island in the tumor tissues and paired adjacent cancerous tissues from 37 patients gastric cancer and the 6 normal gastric tissues. reverse transcription PCR was performed to detect the expression of BRCA1 mRNA in the tumor tissues and paired ad-jacent cancerous tissues from 37 patients gastric cancer and the 6 normal gastric tissues. Results The methylation rate of the
BRCA1 gene promoter CpG island in the gastric cancer tissues[48.
6%(18/37)]was higher than those in the paired adjacent tissues[5.
4%(2/37)]and the normal gastric tissues[0. 0%(0/6)](χ2 =17. 541,5. 021;P<0.
05). The expression positive rate of the BRCA1 mRNA in the gastric cancer tissues[48. 6%(18/37)]was higher than those in the paired adjacent tissues[94. 6%(35/37)]and the normal gastric tissues[100. 0%(6/6)](χ2 =19. 215,5. 520;P <0. 05 ). The methylation of BRCA1 gene promoter CpG island has a negative correlation with BRCA1 mRNA(r= -0. 515,P<0. 05). Conclusion Methylation of BRCA1 gene promoter CpG island may be one of the main reasons for the loss of BRCA1 mRNA expression.
【期刊名称】《肿瘤基础与临床》
【年(卷),期】2014(000)006
【总页数】4页(P463-466)
【关键词】胃癌;BRCA1基因;甲基化
【作者】孙欣欣;王红兵;徐海洋
【作者单位】徐州医学院研究生学院，江苏徐州221002;徐州医学院附属医院肿瘤内科，江苏徐州221002;徐州医学院附属医院肿瘤内科，江苏徐州221002【正文语种】中文
【中图分类】R735.2;R730.23
乳腺癌易感基因 1（breast cancer susceptibility gene 1，BRCA1）是一个抑癌基因，参与基因的转录调节、细胞周期调控、DNA双链损伤修复、细胞凋亡和泛
素化等重要的细胞活动，其中DNA双链修复途径主要包括：同源重组修复、非同源末端连接［1-3］。

胃癌是常见的恶性肿瘤之一，其发生、发展与癌基因的激活、抑癌基因的失活等因素有关，而基因启动子CpG岛甲基化是抑癌基因失活的一重要途径［4］。

抑癌基因启动子CpG岛异常甲基化常常导致其转录异常、表达下
调甚至缺失，进而导致肿瘤的发生［5］。

DNA甲基化在肿瘤基因表达调控、分
化发育、细胞增殖等方面起着重要作用，与肿瘤的发生、发展密切相关，因此成为当前分子学研究热点之一。

目前国内关于BRCA1基因甲基化与BRCA1 mRNA表达相关性在肿瘤中研究甚少，而在胃癌组织中尚无文献报道。

本研究采用甲基化特异性PCR技术检测37例胃癌组织和对应癌旁组织及6例正常胃组织中BRCA1基因启动子CpG岛甲基化状态；采用逆转录PCR技术检测37例胃癌组织和对应癌旁组织及6例正常胃组织中BRCA1 mRNA表达水平，探讨 BRCA1基因启动子CpG岛甲基化与BRCA1 mRNA表达的相关性及其意义。

1.1 研究对象收集2013年6月至2013年12月徐州医学院附属医院经病理诊断
证实的胃癌组织37例，同时取其对应癌旁组织，另取6例胃部良性病变旁正常胃组织作为对照组。

所有胃癌患者术前均未接受过放化疗，癌旁组织距离癌组织5 cm以上。

37例患者中，男29例，女8例，年龄31～80岁，中位年龄63岁。

所有标本均于术后30 min内获得，液氮速冻后-80℃冰箱保存。

1.2 主要试剂基因组DNA提取试剂盒、逆转录PCR相关试剂盒购自北京天根生化科技有限公司，FZ DNA methylation-Gold、Hot start Taq DNA聚合酶购自美国Zymo Research公司，TRIzol试剂购自美国ABI公司，引物由上海生工合成。

1.3 方法
1.3.1 组织DNA提取和甲基化修饰每个样本取30 mg左右组织块进行匀浆处理，参照组织基因组DNA提取试剂盒说明书提取基因组DNA，UV3000紫外分光光
度仪测定DNA浓度和纯度，OD260/OD280比值在1.8～2.0之间的DNA用于
甲基化修饰。

各样本DNA取1.5 μg，参照FZ DNA甲基化试剂盒说明书进行甲
基化修饰，修饰好的DNA洗脱后于-20℃保存。

1.3.2 甲基化特异性PCR法甲基化引物：M，F：5'-TCGTGGTAACGGAAAAGCGC-3'，R：5'-AAATCTCAACGAACTCACGCCG-3'。

非甲基化引物：U，F：5'-TTGGTTTTTGTGGTAATGGAAAAGTGT-3'，R：5'-CAAAAAATCTCAACAAACTCACACCA-3'。

PCR反应体系：PCR混合液（美国Zymo Research公司）1
2.5 μL，上下游引物（10 μmol·L-1）各1.0 μL，修饰好的模板2 μL，加无核酶水补足至25 μL。

循环条件：95℃预变性10 min，然后进行40个循环扩增：95℃变性30 s，甲基化引物及非甲基化引物分别在60℃、58℃退火55 s，72℃延伸30 s，最后于72℃延伸7 min。

甲基化特异性引物（M）扩增的目的片段为75 bp，非甲基化特异性引物（U）扩增的目的片段为86 bp。

取10 μL PCR产物在3%琼脂糖凝胶上电泳，以TIANGFN 50 bp DNA Lad-der （MD108-01）为标准DNA Marker同步电泳，FB染色后凝胶成像系统观察结果并记录。

判断标准［6］：M阳性、U阴性为完全甲基化；M阳性、U阳性为部
分甲基化；M阴性、U阳性为非甲基化。

1.3.3 RNA提取及逆转录PCR检测mRNA 每个样本取约100 mg组织，采用Trizol试剂（按照说明书操作）提取组织总RNA，紫外分光光度计检测其浓度、
纯度，取总RNA 1 μg，按照逆转录说明书合成cDNA。

普通PCR扩增BRCA1
基因，引物如下：F：5'-TTGCGGGAGGAAAATGGGTAGTTA-3'，R：5'-TGTGCCAAGGGTGAATGATGAAAG-3'，扩增的目的片段为292 bp，内参照选
用β-actin，F：5'-AAATCTGGCACCACACCTTC-3'，R：5'-CCATCTCTTGCTCGAAGTCC-3'，扩增的目的片段为432 bp。

PCR为25 μL体系：2×Taq PCR Master-Mix（北京天根生化科技有限公司）12.5 μL，上下游引物（10 μmol·L-1）各1.0 μL，模板cDNA 2 μL，加水至25 μL，95℃预变性2
min，然后进行35个循环扩增：95℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸1 min，最后于72℃延伸5 min。

2%琼脂糖凝胶电泳，电泳结果在紫外灯下观察。

根据以下标准判断结果：432 bp处出现条带，同时292 bp处出现条带即可判断
该标本BRCA1 mRNA表达阳性；仅432 bp处出现条带则判断为BRCA1 mRNA 表达阴性。

1.4 统计学处理采用SPSS 16.0进行数据分析，BRCA1基因甲基化、BRCA1 mRNA表达结果比较采用χ2检验；BRCA1基因甲基化与BRCA1 mRNA表达之间的关系分析采用确切概率法及定性资料相关分析，检验水准α=0.05。

2.1 不同胃组织中BRCA1基因启动子CpG岛甲基化状态37例胃癌组织中有18
例甲基化，其中6例为完全甲基化，12例为部分甲基化，总甲基化率为48.6%（18/37）；对应37例癌旁组织中2例部分甲基化，总甲基化率为5.4%
（2/37）；6例正常胃组织中均未检测到BRCA1基因甲基化，总甲基化率为0.0%（0/6）。

胃癌组织中BRCA1基因启动子CpG岛甲基化率显著高于癌旁组织及正常胃组织，差异有统计学意义（χ2=17.541、5.021，P均＜0.05）。

见图1。

2.2 不同胃组织中BRCA1 mRNA表达37例胃癌组织中，阳性表达 18例，阳性
表达率为 48.6%（18/37）；对应37例癌旁组织中，阳性表达35例，阳性表达
率为94.6%（35/37），6例正常胃组织中均阳性表达，阳性表达率 100.0%
（6/6）。

胃癌组织中BRCA1 mRNA阳性表达率显著低于癌旁组织和正常胃组织，差异有统计学意义（χ2=19.215、5.520，P均＜0.05）。

见图2。

2.3 BRCA1基因启动子CpG岛甲基化与BRCA1 mRNA表达的关系18例
BRCA1基因启动子CpG岛甲基化的胃癌组织中有4例BRCA1 mRNA表达阳性，19例BRCA1基因启动子CpG岛非甲基化的胃癌组织中有14例BRCA1 mRNA
表达阳性，胃癌组织中发生BRCA1基因启动子CpG岛甲基化的BRCA1 mRNA
阳性表达率显著低于未发生甲基化的胃癌组织（χ2=9.799，P＜0.05），BRCA1
基因甲基化与BRCA1 mRNA表达成负相关（r=-0.515，P＜0.05）。

BRCA1基因是与家族性乳腺癌和卵巢癌相关的基因，定位于人染色体17q21，基因组DNA长约100 kb，具有24个外显子，其中22个外显子转录7.6 kb mRNA，最终编码一个由1 863个氨基酸组成的蛋白质，其相对分子质量为220 000［7］。

表观遗传学首先提出基因的DNA序列没有发生改变，而基因功能发
生可遗传的变异，并最终导致表型的改变，主要包括X染色体失活、DNA甲基化、组蛋白修饰、非编码RNA调控等［8］。

DNA甲基化是表观遗传学研究最深入的内容之一［9］，指生物体在DNA甲基转移酶的催化下，以S-腺苷甲硫氨酸为甲基供体，将甲基转移到特定的碱基上的过程。

甲基化主要发生在启动子CpG岛5'端胞嘧啶碱基，这些位点在正常情况下处于完全非甲基化状态，CpG岛发生甲基
化往往会导致基因的转录失活或沉默［10］。

近年来研究［11］表明，抑癌基因
的启动子CpG岛异常甲基化导致其功能失活是肿瘤发生的重要机制之一。

研究［12］也已证实启动子CpG岛异常甲基化以及肿瘤相关基因的沉默是胃癌发生的重要机制，p16、APC等基因甲基化在胃癌中已被研究。

本研究采用甲基化特异性PCR技术检测37例胃癌组织和对应癌旁组织及6例正
常胃组织中BRCA1基因启动子CpG岛甲基化状态，结果显示胃癌组织中总甲基
化率为48.65%，显著高于癌旁组织的5.4%和正常胃组织的0.0%。

本研究结果提示胃癌组织中存在高比例的BRCA1基因启动子CpG岛甲基化，说明BRCA1基
因启动子CpG岛甲基化可能参与了胃癌的发生、发展。

本研究在2例癌旁组织中也检测到BRCA1基因启动子CpG岛甲基化，且对应癌组织中均存在该基因完全
甲基化，癌旁组织中存在BRCA1基因启动子CpG岛甲基化，这一现象可能预示
癌旁组织已经处于癌前病变阶段。

采用逆转录PCR检测37例胃癌组织和对应癌
旁组织及6例正常胃组织中BRCA1 mRNA表达水平，结果显示，BRCA1 mRNA 的阳性表达率在胃癌组织中为48.6%，明显低于对应癌旁组织的94.6%和正常胃
组织的 100.0%。

为了证实BRCA1基因启动子CpG岛甲基化状态与BRCA1 mRNA表达之间的关系，我们对胃癌组织中甲基化组和非甲基化组BRCA1 mRNA表达的差异进行分析，结果显示：18例BRCA1基因启动子CpG岛甲基
化的胃癌组织中有4例BRCA1 mRNA表达阳性，19例BRCA1基因启动子CpG 岛非甲基化的胃癌组织中有14例BRCA1 mRNA表达阳性，而且 BRCA1基因启动子CpG岛甲基化与BRCA1 mRNA表达呈显著负相关（r =-0.515，P＜0.05），提示BRCA1基因启动子CpG岛甲基化是导致BRCA1基因失表达的原因之一。

综上所述，我们初步证实了胃癌组织中存在高比例的BRCA1基因启动子CpG岛
甲基化，BRCA1基因启动子CpG岛甲基化可能是导致BRCA1 mRNA失表达的
主要原因之一，BRCA1基因启动子CpG岛甲基化与胃癌的发生、发展有一定关系。

由于DNA甲基化是可逆的基因修饰过程，通过逆转抑癌基因的甲基化状态，恢复细胞正常生长的调节功能，可能成为胃癌治疗的新靶点。

【相关文献】
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