常用生物化学仪器及色谱仪器介绍

液相色谱分离原理
和气相色谱一样，液相色谱分离系 统也由两相——固定相和流动相组成。 被分离混合物由流动相液体推动进入色 谱柱。根据各组分在固定相及流动相中 的吸附能力、分配系数、离子交换作用 或分子尺寸大小的差异进行分离。
液相色谱组成
液相色谱系统主要包括四部分:
高压输液系统 进样系统 分离系统 检测系统
4、火焰光度检测器（FPD）
火焰光度检测器可用于大气中痕 量硫化物以及农副产品、水中的毫微 克级有机磷和有机硫农药残留量的测 定。
四种常用检测器的性能指标
高效液相色谱法
高效液相色谱法（HPLC）是20世纪60年 代末70年代初发展起来的一种新型分离分析 技术，随着不断改进与发展，目前已成为应 用极为广泛的化学分离分析的重要手段。
常用生物化学仪器及色谱仪器介绍
主讲人：王琼
气相色谱法
气相色谱法（GC）是英国生物化学家Martin等 人在研究液液分配色谱的基础上，于1952年创立的 一种极有效的分离方法，它可分析和分离复杂的多 组分混合物。目前由于使用了高效能的色谱柱，高 灵敏度的检测器及微处理机，使得气相色谱法成为 一种分析速度快、灵敏度高、应用范围广的分析方 法。
以液体作为流动相的色谱分离方法。适 用于高沸点、大分子、强极性和热稳定性差 的化合物的分析。
高效液相色谱法
高效液相色谱法（HPLC）是20世纪60年 代末70年代初发展起来的一种新型分离分析 技术，随着不断改进与发展，目前已成为应 用极为广泛的化学分离分析的重要手段。
以液体作为流动相的色谱分离方法。适 用于高沸点、大分子、强极性和热稳定性差 的化合物的分析。
转头盖在拧紧后一定要用手指触摸转头与转盖之间有无缝隙，如有缝隙要 拧开重新拧紧，直至确认无缝隙方可启动离心机。
离心机使用注意事项
转头盖在拧紧后一定要用手指触摸转头与转盖之间有无缝隙，如有缝隙 要拧开重新拧紧，直至确认无缝隙方可启动离心机。
一定要在达到预设转速后且离心机运行正常，才能离开离心机。
离心中如发现异常现象，如不正常噪音及振动，应立即停机并通知管理 人员。 如样品泄漏，必须立刻用水或中性清洁剂清洗转子及离心腔并擦干。 使用完毕后，卸下转子，取下套管并放入抽屉。 冷冻型离心机，每次使用完后必须将离心机盖子打开让离心腔回到室温， 并且用软布将离心腔里冷却水和赃物清理干净。 清理实验桌面及离心机台面并将垃圾带走。
四、检测系统
常用检测器
紫外检测器（包括二极管阵列检测器） 荧光检测器 示差折光检测器 电导检测器 蒸发光散射检测器
紫外检测器
原理：基于被分析组分对特定波长紫外光（最大吸 光度）的选择性吸收
定量基础：比耳定律，A＝KCL 优点： 1）灵敏度高
2）对温度和流速不敏感 3）可用于梯度洗脱 缺点：仅适用于测定有紫外吸收的物质
缺点是线性范围窄，只有103左右，且 响应易受操作条件的影响，重现性较差。
4、火焰光度检测器（FPD）
火焰光度检测 器，又称硫、磷检测 器，它是一种对含磷、 硫有机化合物具有高 选择性和高灵敏度的 质量型检测器。根据 硫和磷化合物在富氢 火焰中燃烧时，生成 化学发光物质，并能 发射出特征波长的光， 记录这些特征光谱， 就能检测硫和磷。
(2)水平转子：也称吊篮式转头。静止时离心管垂直挂在转头上，当转头转速 达600r/min后，离心管荡至水平位置，通常一个转头挂4个或6个吊篮。 优点：梯度物质可放在保持垂直的离心管中，离心时被分离的样品带垂直 于离心管纵轴，而不像角式转头中样品沉淀物的界面与离心管成一定角度， 因而有利于离心结束后由管内分层取出已分离的各样品带。 缺点：最高转速和容量相对较小，离心时间较长。
温度
仪器 状态
使用 人
导师 姓名
2010.5.19 09：00
09：30
12154-H
8000r/mi n
4℃
正常 张三 李四
使用登记必须在实验前填写 记录本和笔要及时放回原处
离心机使用注意事项
使用前必须清楚该转子的最大转速。 离心前必须用天平平衡样品。 离心管要带盖平衡。 离心管通常都会放在碎冰上，取出平衡时，要把碎冰的液体擦拭干净。 转头在每次使用前要严格检查孔内是否有异物和污垢，以保持平衡。 样品容量不要超过离心管的2/3。 水平转子必须装载所有位置。 预冷时转头盖可先拧紧，也可摆放在实验台上，但千万不可不拧紧浮放在 转头上。
优点：消除了溶剂干扰以及温度变化带来的基线漂移 ，可梯度洗脱，灵敏度高。
HPLC的通用型检测器，其应用范围将越来越广。
高效液相色谱法与气相色谱法的比较
气相色谱法分析对象只限于分析气体和沸点较低的 化合物或挥发性的衍生物，它们仅占有机物总数的20 ％。
对于占有机物总数近80％的那些高沸点、热稳定性 差、摩尔质量大的物质，目前主要采用高效液相色谱 法进行分离和分析。
高效液相色谱法与气相色谱法的比较
液相色谱能完成难度较高的分离工作
（1）气相色谱的流动相是惰性的，只起运载样品分子的作用， 不参与分配平衡过程；而在液相色谱中，流动相具有运载样品 分子和选择性分离的双重作用。 （2）液相色谱固定相类型多，如离子交换色谱和排阻色谱等， 作为分析时选择余地大。 （3）液相色谱通常在室温下操作，较低的温度，一般有利于色 谱分离条件的选择。
二、转子速度的设定
转头都有一定的使用极限，到一定时限后， 最高使用转速必须降低。
除418实验室的贝克曼冷冻离心机外，其他离 心机转头使用时最高转速必须适当降低10%-20%。
当离心样品密度大于1.2克/立方厘米，转子 最高转速必须相应降低。
三、样品的装载和平衡
由于离心时产生很大的离心力。当转头所带的样 品处于不平衡状态时，会产生很大的力矩。轻者引起 机器发抖和震动，重者会扭断转轴造成事故。 离心管要二二平衡，放在转头的对称位置。 离心管、套管、样品及管帽一起放在天平进行称重
四、检测系统
这个系统是指样品经色谱柱分离后，各成 分按保留时间不同，顺序地随载气进人检测器， 检测器把进入的组分按时间及其浓度或质量的 变化，转化成易于测量的电信号，经过必要的 放大传递给记录仪或计算机，最后得到该混合 样品的色谱流出曲线及定性和定量信息。
1、热导检测器（TCD）
热导检测器是根据不 同的物质具有不同的 热导系数原理制成的。 热导检测器由于结构 简单，性能稳定，几 乎对所有物质都有响 应，通用性好，而且 线性范围宽，价格便 宜，因此是应用最广， 最成熟的一种检测器。 其主要缺点是灵敏度 较低。
优点：对流动相流速和压力的改变不敏感，可用于梯度 洗脱。
缺点：对温度变化敏感（每升高1度，电导率增加2%2.5%)。
主要用于离子色谱检测水溶性无机和有机离子。
蒸发光散射检测器
原理：色谱柱流出物在通向检测器途中，被高速氮气 喷成雾状液滴，溶质形成不挥发的微小颗粒，被载气 带到检测系统，进入散射室中，检验散射光的强度。
气相色谱组成
气相色谱系统主要包括四部分:
载气系统 进样系统 分离系统 检测系统
气相色谱系统示意图
气路系统，用来 提供稳定的载气
进样系统，用来 定量向色谱柱输
送样品
分离系统，用来分离 样品的不同组分
检测系统，分析被 分离的各种组分
一、载气系统
载气由压缩气体钢瓶供给，经减压阀、稳压阀 控制压强和流速，由压强计指示气体压强，然后进 入检测器热导池的参考臂，继而进入色谱柱。最后 通过热导池、流量计而放入大气。
液相色谱系统组成
高压输液系统
进样系统
分离系统
检测系统
一、高压输液系统
由于高效液相色谱所用固定相颗粒极细， 因此对流动相阻力很大，为使流动相较快流 动，必须配备有高压输液系统。它是高效液 相色谱仪最重要的部件，一般由储液罐、高 压输液泵、过滤器、压力脉动阻力器等组成， 其中高压输液泵是核心部件。
二、进样系统
(3)区带转头：为一空腔，没有离心管，样品液直接放在腔内。适用于大量样 品分离。
(4)垂直转头：其离心管是垂直放置，样品颗粒的沉降距离最短，离心所需时 间也短，适合用于密度梯度区带离心。
(5)连续流动转头：可用于大量培养液或提取液的浓缩与分离，与区带转头类 似。
(6)分析转头：是分析小室，专用于分析。
高效液相色谱法与气相色谱法的比较
液相色谱样品的回收比较容易，且回收是定量的， 可以用来提纯和制备具有足够纯度的单一物质。
液相色谱检测器的灵敏度不及气相色谱，操作比较 复杂。
在实际应用中，这2种色谱技术是相互补充的。
离心机概述
离心机是利用离心力对混合液（含有固形物） 进行分离和沉淀的一种专用仪器，是分离、纯 化细胞、病毒、蛋白、核酸和酶的最方便最有 效的工具。
以气体作为流动相的色谱分离方法。适用于沸 点较低、热稳定性好的中小分子化合物的分析。
气相色谱分离原理
气相色谱(GC)是基于时间差别的分离技术。 将气化的混合物或气体通过含有某种物质的管，基于管中
物质对不同化合物的保留性能不同而得到分离。样品经过 检测器以后，被记录的就是色谱图，每一个峰代表最初混 合样品中不同的组分。峰出现的时间称为保留时间，可以 用来对每个组分进行定性；峰的大小（峰高或峰面积）则 是组分含量大小的度量。
缺点：不能检测永久性气体、水、一氧化碳、二 氧化碳、氮的氧化物、硫化氢等物质。
3、电子俘获检测器（ECD）
电子俘获检测器 是一种放射性离 子化检测器，与 火焰离子化检测 器相似，也需要 一个能源和一个 电场。能源多数 用63Ni或3H放射 源，其结构如图：
3、电子俘获检测器（ECD）
是目前分析痕量电负性有机物最有效 的检测器。电子捕获检测器已广泛应用于 农药残留量、大气及水质污染分析，以及 生物化学、医学、药物学和环境监测等领 域中。
常用的载气：氮气、氢气、空气、氦气、氩气。
二、进样系统
包括进样装置和汽化室。 进样通常用微量注射器和进样阀将样品 引入。液体样品引入后需要瞬间汽化。汽化 在汽化室进行。
三、分离系统
分离系统由色谱柱组成，它是色谱仪的 核心部件，其作用是分离样品。
填充柱（2-6mm直径，1-6m长）
色谱柱
毛细管柱（0.1-0.5mm直径, 几十米长）
平衡。 水平转头不允许有空挡，即不挂吊篮的现象，否则
会损坏转头。
三、样品的装载和平衡
静平衡：对称的两管样品等 重。
动平衡：离心时产生的力矩 不仅与样品的重量有关，还 和样品的旋转半径有关。
处于对称位置的两个离心管 必须装载密度相近的样品。
离心机使用注意事项
日期
开机 时间
关机 时间
转子 型号
rpm/ rcf
Hale Waihona Puke 荧光检测器 原理：基于被分析组分发射的荧光强度进行检测 优点： 1）灵敏度极高，是最灵敏的检测器之一
2）选择性好 3）对温度和流速不敏感，可用于梯度洗脱 缺点：仅适用于测定可产生荧光的物质 可检测物质：多环芳烃、霉菌毒素、酪氨酸、色氨酸 、卟啉、儿茶酚氨等（具有对称共轭体系）
示差折光检测器
2、氢火焰离子化检测器（FID）
氢火焰离子化检测 器是以氢气和空气燃烧 的火焰作为能源，利用 含碳有机物在火焰中燃 烧产生离子，在外加的 电场作用下，使离子形 成离子流，根据离子流 产生的电信号强度，检 测被色谱柱分离出的组 分。
2、氢火焰离子化检测器（FID）
氢火焰离子化检测器的优点： 能检测大多数含碳有机化合物； 死体积小， 响应速度快， 线性范围宽，可达106以上； 结构不复杂，操作简单， 是目前应用最广泛的色谱检测器之一。
低速/低速冷冻离心机（低于6000r/min）
根据转速 高速/高速冷冻离心机（低于25000r/min）
超速冷冻离心机（高于30000r/min）
根据用途 分析离心机
制备离心机
一、转子
(1)角转子：转头的离心管腔与转轴保持20-30度的固定角度。离心沉淀在管壁 的斜面上。具有较大的容量和较高的转速。
关键技术－六通阀进样系统
三、分离系统
分离系统的主要元件是色谱柱，它包括柱 管与固定相两部分。柱管材料有玻璃、不锈钢、 铝、铜及内衬光滑聚合材料的其他金属。玻璃 管耐压有限，故金属管用得较多。一般色谱柱 长5～30cm，内径为4～5mm，凝胶色谱柱内径 3～12mm，制备柱内径较大，可达25mm以上。
原理：连续测定流通池中溶液折射率来测定试样中各组 分浓度。
优点：通用型检测器 缺点：
1）属于中等灵敏度的检测器 2）对温度变化敏感（配柱温箱） 3）对溶剂组成变化敏感，不能用于梯度洗脱
电导检测器
原理：根据物质在某些介质中电离后所产生的电导变化 来测定电离物质含量。广泛应用于离子色谱法。