感受态细胞的制备及检测

单菌落划线
一、实验目的
1. 了解并掌握感受态细胞的制备；
2. 掌握感受态细胞的检测方法；
二、实验原理
细菌处于0℃的CaCl2低渗溶液中，会膨胀成
球形，细胞膜的通透性发生变化，转化混合物中
的外源DNA形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物粘
附于细胞表面，经42 ℃短时间热激处理，促进细
胞吸收DNA复合物，在丰富培养基上生长数小时 后，球状细胞复原并分裂增值，在选择培养基上 便可获得所需的转化子。
2013-6-1
感受态细胞（Competent cell）
细胞处于能够吸收外源DNA的状态
称感受态，经特殊处理后处于此状态的
细胞称感受体细胞。
电击法、CaCl2 、KCl等化学试剂法处理后，
细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，能允许
外源DNA分子进入 ； 进入受体细胞的DNA分子通过复制，表达实
从而显示β-半乳糖苷酶活性，由此很容易鉴别重组体
菌株。
电击法与CaCl2 制备法的区别
电击法:利用瞬时高压电流（数千伏特）处理细胞 悬浮液，使微生物细胞膜在高压电作用下发生去 极化，产生微孔，悬液中溶解的核酸即可通过细 胞膜上的空洞进入细胞内部。
CaCl2 法:利用低渗溶液处理细胞悬浮液微生物细 胞膜结构发生变化，使得细胞在热激时（42℃， 90s）变得很容易从溶液中摄取DNA。
细菌处于0的cacl低渗溶液中会膨胀成球形细胞膜的通透性发生变化转化混合物中的外源dna形成抗dnase的羟基钙磷酸复合物粘附于细胞表面经42短时间热激处理促进细胞吸收dna复合物在丰富培养基上生长数小时后球状细胞复原并分裂增值在选择培养基上便可获得所需的转化子
微生物学实验课感受态细胞的ຫໍສະໝຸດ 备及检测2010级硕士生：张瑶
④加入800 μl液体LB培养基(不含Amp)，37℃摇床培养1-1.5 h； ⑤4000 r/min离心5 min，弃上清，剩余约100 μL； ⑥凃布氨苄LB固体平板（氨苄终浓度为100 μg/mL），37℃正置30 min，再倒 置培养12 h左右；
四、实验步骤--感受态检测
3）蓝白斑筛选，菌落PCR验证
五、实验注意事项
1. 细胞生长状态和密度：不要用经过多次转接或储于４℃ 的培养菌，最好从 -80℃甘油保存的菌种中直接转接用 于制备感受态细胞的菌液。 细胞生长密度以刚进入对数生长期时为宜，也可通过监 测培养液的OD600 来控制。密度过高或不足均会影响转 化效率。
实验操作时要格外小心，悬浮细胞时要轻柔，以免造成 菌体破裂，影响转化。 感受态细胞制备过程中均需在冰上操作。 菌种转接前最好培养成单菌落进行后续实验。
现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传
性状。
感受态细胞（Competent cell）
常用大肠杆菌感受态细胞的区别
DH5α大肠杆菌感受态是一种常用于质粒克隆的菌株 BL21感受态主要用用于蛋白表达的优化实验。 JM109感受态在使用pUC系列质粒载体进行DNA转 化或用M13 phage载体进行转染时，由于载体DNA产 生的LacZa多肽和JM09编码的LacZΔM15进行α-互补，
2.
3. 4. 5.
六、课后作业
1. 电击法与CaCl2 制备感受态细胞的区别是什么？
2. 为什么在重悬细胞时操作要轻柔？
3. 感受态细胞制备过程中为何均需在冰上操作？
4. 菌种转接前为何培养成单菌落进行后续实验？
5. 蓝白斑筛选的原理是什么？
三、实验材料及试剂
超低温离心机
水浴锅
三、实验材料及试剂
恒温金属浴
摇床
三、实验材料及试剂
制冰机
超净工作台
准备物品（按20个感受态计算）
(1) 50 mL离心管 2个，洗净，灭菌，干燥，预冷。 (2) 1.5 mL离心管：25个，灭菌，干燥，预冷。 (3) LB 液体培养基：50 mL液体LB放于500 mL三角瓶（洗净）中，灭菌。 (4) LB 液体培养基：3 mL液体LB放于小试管中，灭菌。 (5) LB固体平板2个，无Amp。 (6) 氯化钙：0.1 M，25 mL，灭菌，使用前置于冰浴中预冷 称取CaCI2· 2H2O 0.37 g，定容至25 mL (7) 氯化钙-氯化镁混合液：（氯化钙 20 mM，氯化镁 80 mM）200 mL，灭 菌，使用前置于冰浴中预冷 称取CaCI2· 2H2O 0.59 g，MgCI2· 6H2O 3.25 g，定容到200 mL (8) 甘油：4 mL，灭菌，预冷。(或DMSO 1 mL) (10) 颗粒状小冰块。 (11) 蓝枪头、黄枪头各一盒，灭菌，预冷。 (12) LB培养基：胰蛋白胨 10 g/L，酵母提取物 5 g/L， NaCl 10 g/L，琼脂 粉 16 g/L（固体培养基），调节pH至7.0，高压灭菌。
感受态细胞可以用来做什么？
将构建好的载体转入感受态细 胞进行表达(转化)，不仅可以 检验重组载体是否构建成功， 最主要的是感受态细胞作为重 组载体的宿主可以进行后续实 验，如蛋白质表达纯化等工作。
蓝白斑筛选
α-互补现象：因为许多载体都带有一个LacZ基因的调控序列和头146 个氨基酸的编码信息，编码α-互补肽，该肽段能与宿主编码的缺陷型 β-半乳糖苷酶实现基因内互补（α-互补）。 当这种载体转入可编码β-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞中时， 在IPTG的诱导下，宿主可同时合成这两种肽段，虽然它们各自都没有 酶活性，但它们可以融为一体形成具有酶活性的蛋白质，所以称这种 现象为α-互补现象。 由互补产生的α-半乳糖苷酶(LacZ)能够作用于生色底物X-gal而产生 蓝色的菌落，所以利用这个特点，在载体的该基因编码序列之间人工 放入一个多克隆位点，当插入一个外源DNA片段时，会造成LacZ(α)基 因的失活，破坏α-互补作用，就不能产生具有活性的酶。所以，有重 组质粒的菌落为白色，而没有重组质粒的菌落为蓝色。
四、实验步骤--感受态检测
1）连接
纯化后的PCR产物与pMD18-T载体连接（16 ℃，8-10h ）
试剂名称 加入量 solutionⅠ 5 μl PCR产物 4.5 μl T载体 0.5 μl
2）转化
①从冰箱中取出大肠杆菌感受态细胞，置冰上缓缓融化； ②将连接产物（10 μL）全部加入100 μL感受态中，混合均匀，冰浴30 min； ③42℃热激90 s，冰浴2 min；42℃热激1 min，冰浴2 min；
四、实验步骤--感受态制备
(1) 划线接种工程菌到LB平板上，培养出单菌落。
(2) 挑取单菌落至盛有液体LB的小试管中， 37℃过夜培养。 (3) 将小试管中的菌液转移至盛有50 mL液体LB的三角瓶中，37℃振荡
（200 r/min）约1 h，至呈云雾状，冰浴10 min。
(4) 把菌液倒入预冷的50 mL离心管中，（每管放25 mL）共2管。 (5) 4℃，4500 r/min离心10 min，充分弃上清。 (6) 每管加入15 mL预冷的氯化钙-氯化镁混合液，重悬细胞，冰浴10 min。 (7) 4℃，4500 r/min离心10 min，充分弃上清。 (8) 每管加入1 mL预冷的氯化钙溶液，重悬细胞，冰浴10 min。 (9) 每管加入0.25 mL 预冷的无菌甘油，冰浴10 min，分装到20个1.5 mL EP管中，每个EP管分装100 μL，放于-70℃冰箱中，备用。 注：第8步可以加入DMSO替换甘油作为保护剂。