分子生物学基本实验操作

1.1.2.2 其他
RNA酶很难被灭活，实验过程中要时刻注意防止RNA酶污染。 实验操作者的手也是RNA酶最主要的潜在污染源之一，因此，在实验准备和 RNA抽提过程中，都应戴手套，并尽可能勤换手套。 实验室RNA相关实验用的仪器及试剂应该专用，包括移液器、玻璃器皿、塑料制 品和电泳槽等，并存放在指定地点。

1.1.3.5 RNA质量检测 质量检测
（2）纯度和产量分析：计算A260/A280的比值R来判定RNA的纯度： 用DEPC- ddH2O溶解RNA，1.6<R<1.8，认为RNA的质量较好； R<1.6时，溶液中蛋白或者时其他有机物的污染比较明显； R>1.8时，说明RNA降解比较明显。 根据1A260单链RNA=40ng/ul计算RNA产量。

1.3.2 质粒 质粒DNA的抽提步骤 的抽提步骤
菌夜重悬
质量检测
裂解
沉淀，洗 沉淀， 涤，溶解
质粒复性， 质粒复性， 蛋白沉淀
氯仿抽提

1.3.2 质粒DNA抽提步骤 质粒DNA抽提步骤
1、取2ml过夜培养的菌夜于EP管中，4℃，离心收集菌沉淀； 2、将细菌沉淀重悬于200µl预冷的溶液Ⅰ中，剧烈振荡，使菌体分散混匀； * 一定要使细菌分散均匀 3、加200µl新鲜配制的溶液Ⅱ，轻轻颠倒数次混匀（不可剧烈振荡），并将离心 管置冰上2-3min，使细胞壁充分裂解（离心管中菌液逐渐变得透明且粘稠）； *此步时间不宜过长，混匀不能剧烈，否则基因组DNA 断裂，造成污染 4、加入200µl预冷的溶液Ⅲ，将管温和颠倒数次混匀，见白色絮状沉淀，可在冰上 放置3-5min；

1.3.2 质粒 质粒DNA抽提步骤 抽提步骤
6、加入500µl的氯仿，混匀，4℃，12000rpm离心10min； 7、小心移去上请，加入等体积预冷的异丙醇，混匀，室温放置5min，4℃， 12000rpm离心15min，可见质粒DNA沉淀； 8、小心弃上清， 1ml预冷的70%乙醇悬浮沉淀，4℃，12000rpm离心5min，重复此 步一次； 9、室温干燥沉淀5-10min，视沉淀多少加入灭菌 ddH2O溶解沉淀
组织
液氮 匀浆
用液氮预冷研钵，将绿豆大小的组织直接置于液氮中敲碎，并迅速研磨至 粉末状，小心转移至1ml Trizol中。在研磨的过程中，应不断补加液氮， 直至样品成粉末状（适用于心、胃、主动脉等组织）
倾去培养基，按10cm dish /ml的比例直接将Trizol加入到培养 贴壁细胞 皿中消化、裂解细胞，用RNAse free的枪头吹打数次，将样 品转入无RNA酶的EP管中 细胞

1.1.3.6 RNA样本的保存 样本的保存
将质检过关的 RNA标本编号，贴标签，置于-80℃保存。做好RNA标本 的贮存登记、RNA提取实验记录、RNA质量鉴定记录等，并由专人统一 保管。


1.2.4 DNA保存 保存
质检过关的DNA，若短期内需要进行下一步实验，可以暂存区-20℃，长期 保存则应置于-80℃。做好样本贮存登记、具体的实验记录、质量鉴定 记录等，并由专人统一保管。

1.3 质粒DNA的抽提 质粒DNA的抽提 1.3.1 原理
将大肠杆菌悬液暴露于高pH的强阴离子洗涤剂中，细胞壁破裂，染色体DNA及 蛋白质变性，将质粒DNA释放到上清中。在裂解过程中，细菌蛋白质、破裂的细 胞壁和变性的染色体DNA会相互缠绕成大型复合物，被SDS所包围，当用钾离子 取代钠离子时，这些复合物会从溶液中进一步有效地沉淀下来，通过离心去除， 利用异丙醇沉淀从上清中获得质粒DNA。

1.1.3.5 RNA质量检测 质量检测
（1）完整性：可以用普通琼脂糖凝胶电泳分析RNA的质量。电泳所用的缓冲液 必须是新配置的。如果电泳可见28S和18S两条主要条带，以及5S的带，并且 28S的亮度在18S的两倍以上，认为RNA的质量很好。 * RNA上样量应控制在300-400ng左右，过多或过少都影响电泳效果
1.3.4 质粒 质粒DNA的保存 的保存
质检过关的质粒，若短期内需要进行下一步实验，可以暂存区-20℃，长期 保存则应置于-80℃。做好质粒样本贮存登记、具体的实验记录、质量鉴定 记录等，并由专人统一保管。

2、PCR技术 、 技术
2.1 原理


1.1.2 相关器皿的处理
1.1.2.1 塑料制品的处理 已经标明RNase-Free的塑料制品，如果没有开封使用过，可以直接使用。对于国产 塑料制品，都必须处理方可使用，步骤如下： 1）在玻璃烧杯中注入双蒸水，加入DEPC使其终浓度为0.1%，磁力搅拌0.5小时； 2）用1）浸泡需要处理的塑料制品，在通风橱中处理过夜； 3）弃将DEPC水，用铝箔封住处理过的塑料制品，高温高压灭菌至少30 min； 5）100℃烤至干燥，置于干净处备用。枪头必须在无菌操作台中，用镊子装入枪头 盒。
悬浮细胞 4℃ 2 000g 离心5分钟收集细胞，用Trizol重悬、裂解，每1ml
Trizol可裂解5-10*106个细胞

1.1.3.2 相分离
（1）匀浆好的组织，室温下静置5-10 min以充分裂解，4℃、16000rpm离心10min， 取800微升上清液转入一个无RNA酶的EP管中；若为细胞样本，可以省略此步， 直接进行下一步操作； （2）按照1ml Trizol加入200µl氯仿，用手剧烈振荡混匀15-30S后室温静置10-15 min， 直至出现较为明显的分层； （3）4℃，16000 r/min离心15 min，小心吸取上层水相于一新管。 *千万不可吸取到中间界面，一般吸取300微升上清，所得RNA产量足以进行一般的 后续实验，过多上清很容易造成DNA污染；

1.3.3 质粒 质粒DNA的质量签定 的质量签定
一般将质粒DNA样品稀释100倍，检测样品的OD260和OD280，计算其比值 R来衡量样品的纯度。一般认为R≈1.8, DNA质量较好；R＞2.0，表明RNA污 染明显；R＜1.7，表明蛋白质、酚等污染较为明显。根据1A260双链DNA = 50ng/ul，计算质粒DNA产量。
1.2 基因组DNA的抽提 基因组DNA的抽提 1.2.1 原理
酚-氯仿法提取 DNA原理为在EDTA（螯合二价阳离子以抑制DNase）存在的 情况下，用蛋白酶K消化真核细胞或组织，用去污剂 SDS溶解细胞膜并使蛋白质 变性，通过酚－氯仿法去除蛋白质，而保留 DNA 于水相溶液，最后通过无水乙 醇和高盐溶液沉淀基因组DNA。

1.1.3.3 RNA沉淀 沉淀
(4) 加入等体积异丙醇，轻轻混匀，室温静置10 min； (5) 4℃，12000 rpm离心10min，弃上清，此时可见RNA沉淀于管底。在离心之前， RNA沉淀是不可见的，常常在离心管的边缘或者底部形成凝胶状小球；
1.1.3.4 RNA 洗涤、溶解 洗涤、

1.2.2基因Βιβλιοθήκη 1.2.2基因组DNA抽提步骤 基因组DNA抽提步骤
（6）加入1/10体积的3M醋酸钠 (pH5.2)和2.5倍体积的预冷无水乙醇，混匀，此时可 见絮状沉淀析出，置-80℃冰箱30min； （7）12000rpm 离心 15 min，小心倾去上清； （8）加入1ml 70%乙醇，悬浮沉淀； （9）4℃，12000 rpm离心5 min，弃上清，室温晾干5-10min，视沉淀量的多少加入 灭菌双蒸水溶解DNA沉淀。
EP管中55℃裂解过夜
细胞 悬浮细胞 4℃ 2 000g 离心5分钟收集细胞，PBS重悬浮洗涤细胞，按照 1-5*107的比例加入裂解液，悬浮细胞，55℃裂解过夜；

1.2.2基因组 1.2.2基因组DNA抽提步骤 基因组DNA抽提步骤
（2）匀浆裂解过夜的样本应清亮透明。加入等体积Tris-饱和酚，轻轻颠倒，充分混 匀形成乳浊液，此步将离心管置于旋转器上，慢慢混匀10-30min； （3）室温，12000rpm，离心10min，取上清； （4）加入等体积的酚-氯仿，轻轻颠倒混匀； （5）室温，12000rpm，离心15min，小心取出上清；
再补加900ul 裂解液至1ml（适用肝、肾等组织），55℃裂解过夜
组织
液氮 匀浆
取黄豆大小的组织于盛有液氮的研钵内迅速研磨至粉末状。在研磨的 过程中，不断补加液氮，直至样品成粉末状（适用于心、胃等组织），
将其小心转入装有1ml裂解液的EP管中，55℃裂解过夜；
贴壁细胞 倾去培养基除，PBS洗涤细胞1-2次，按10cm dish /ml的比例直 接将裂解液加入到培养皿中消化细胞，用枪头吹落细胞，转入

1.1.3 总RNA抽提步骤 抽提步骤
匀浆
质量检测
相分离
溶解
沉淀
洗涤

1.1.3.1 匀浆
研磨棒 米粒大小的组织加入100微升Trizol ，冰上充分研磨至看不见块状的
组织，再补加900ul Trizol 至1ml（适用肝、肾等组织）
分子生物学基本实验操作
周正峰 09.7.19

HEADLINE
1 2 3 4 核酸抽提 PCR 技术 克隆操作 实验中一些好的习惯

1 核酸抽提
1.1 总RNA抽提 RNA抽提
1.1.1 原理 利用强变性剂异硫氰酸胍迅速裂解组织（或细胞），促 使核蛋白与核酸的解离，并迅速抑制细胞内的RNA 酶；经 酸性苯酚-氯仿抽提，异丙醇沉淀可获得完整的RNA。
（6） 加入1ml 75%DEPC-乙醇，悬浮沉淀； * 此步一定要将RNA沉淀悬浮起来，才能保证残留的盐被洗去 （7）4℃，12000 rpm离心5 min，弃上清，室温晾干，或者真空干燥5~10 min，视 沉淀量的多少加入DEPC- ddH2O溶解RNA，可用枪吹打数下以助RNA溶解； * 沉淀不要过于干燥，否则将会大大降低RNA的溶解度；

1.2.3 DNA质量检测 质量检测
一般将DNA样品稀释50-100倍（使OD260值位于0.1~1.0之间），检测样品的 OD260，OD280，计算其比值R来衡量样品的纯度。一般R≈1.8，DNA质量较 好；R＞2.0,表明RNA污染明显；R＜1.7，表明蛋白质、酚等污染较为明显。根 据1A260双链DNA=50ng/ul，计算DNA产量。

1.2.2 基因组 基因组DNA的抽提步骤 的抽提步骤
匀浆
质量检测
相分离
溶解
沉淀
洗涤

1.2.2 基因组DNA的抽提步骤 基因组DNA DNA的抽提步骤
研磨棒 绿豆大小的组织加入100微升裂解液，充分研磨至看不见块状的组织，

1.1.2.2 玻璃和金属制品的处理
用去离子清洗干净，用锡箔纸包好，然后至烘箱中250℃烘烤3小时以上 或者180℃烘烤8小时以上。
1.1.2.3 电泳槽的处理
用于RNA电泳的电泳槽应用去污剂洗干净，再用水冲洗，用乙醇干燥，然后灌满 3%的H2O2溶液，于室温放置 10 分钟，最后用 0.1%DEPC水彻底冲洗电泳槽。
2.2 实验室设置
PCR实验操作要求在三个不同的区域内进行，严格预防PCR的污染： 1、标本处理区，包括扩增模版的制备； 2、PCR扩增区，包括PCR反应液的配置和PCR扩增； 3、PCR产物分析区，包括凝胶电泳分析，拍照及胶回收等。 各工作区必须有一定的隔离，各区实验器材需专用，并且各区设置要有一 定的方向性：标本制备—PCR扩增—产物分析—产物处理。 切记PCR扩增产物及产物分析区的器材不要拿到标本处理区和PCR扩增 区。