mAb2G4_ODN_lip在H9C2心肌细胞缺氧复氧模型中的保护作用
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临 床 麻 醉 学 杂 志 ２０１５ 年 ６ 月 第 ３１ 卷 第 ６ 期 Ｊ Ｃｌｉｎ Ａｎｅｓｔｈｅｓｉｏｌ，Ｊｕｎｅ ２０１５，Ｖｏｌ．３１，Ｎｏ．６
·实验研究·
ｍＡｂ２Ｇ４／ＯＤＮ／ｌｉｐ 在 Ｈ９Ｃ２ 心 肌 细 胞 缺 氧 复 氧 模型中的保护作用
陈刘芳 靖国庆 杨建国 张宗泽 王焱林 吴云
【Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ】 ＮＦ－κＢ；Ｈｙｐｏｘｉａ／ｒｅｏｘｙｇｅｎａｔｉｏｎ；Ｈ９Ｃ２ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ
基 金 项 目 ：国 家 自 然 科 学 基 金 （编 号 ：８１２０１４９９） 作者单位：４３００７１ 武 汉 市，武 汉 大 学 中 南 医 院 麻 醉 科 （陈 刘
Ｈ９Ｃ２心肌 细 胞 按 常 规 培 养，高 糖 ＤＭＥＭ 完 全 培养基，１０％胎牛血清，置于３７ ℃、５％ＣＯ２ 细胞培养 箱中培养，０．２５％胰 酶消化传代，选取对数生 长 期 细 胞进行实 验。将 心 肌 细 胞 置 于 厌 氧 袋 中 密 封 后，３７
临 床 麻 醉 学 杂 志 ２０１５ 年 ６ 月 第 ３１ 卷 第 ６ 期 Ｊ Ｃｌｉｎ Ａｎｅｓｔｈｅｓｉｏｌ，Ｊｕｎｅ ２０１５，Ｖｏｌ．３１，Ｎｏ．６
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ｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ２Ｇ４，ｍＡｂ２Ｇ４）能 高 效 特 异 性 地 与 受损心肌细胞结合；核转 录 因 子－κＢ（ＮＦ－κＢ）作 为 一 种广泛存在 的 诱 导 性 核 转 录 因 子，其 在 ＭＩＲＩ中 的 作用是近年来 缺 血－再 灌 注 损 伤 机 制 研 究 的 重 要 进 展［２］；转染人工合成与 ＮＦ－κＢ 结 合 位 点 具 高 度 亲 和 力 的 寡 聚 脱 氧 核 苷 酸 也 就 是 诱 骗 性 寡 核 苷 酸 （ｄｅｃｏｙ ＯＤＮ）是 近 年 来 倍 受 关 注 的 一 个 可 以 特 异 性 针 对 ＮＦ－κＢ 的新 型 基 因 治 理 策 略。 因 此 我 们 设 想 建 立 Ｈ９Ｃ２心肌细胞 缺 氧 复 氧 模 型，运 用 基 因 工 程 技 术 将 ｍＡｂ２Ｇ４和 ＮＦ－κＢ ｄｅｃｏｙ ＯＤＮ 融合成单克隆抗 体／寡 核 苷 酸／阳 离 子 脂 质 体 复 合 物 （ｍＡｂ２Ｇ４／ ＯＤＮ／ｌｉｐ），并 探 讨 不 同 剂 量 ｍＡｂ２Ｇ４／ＯＤＮ／ｌｉｐ 是 否能在 ｍＡｂ２Ｇ４引导下靶向到达缺氧心肌细胞 内， 快 速 、高 效 地 抑 制 细 胞 内 转 录 因 子 的 激 活 ，进 而 抑 制 炎性细胞因子的表 达，对 缺 氧 复 氧 心 肌 细 胞 起 到 保 护作用。
芳、靖 国 庆、张 宗 泽、王 焱 林、吴 云）；武 汉 大 学 ＨＯＰＥ 护 理 学 院 （杨 建国）
通 信 作 者 ：吴 云 ，Ｅｍａｉｌ：２２３３０５１６５９＠ｑｑ．ｃｏｍ
心 肌 缺 血－再 灌 注 损 伤 （ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｉｓｃｈｅｍｉａ ａｎｄ ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ ｉｎｊｕｒｙ，ＭＩＲＩ）是阻碍缺血心肌从 再 灌注疗法 中 获 得 最 佳 疗 效 的 主 要 难 题。 有 研 究 报 道 ［１］抗 肌 球 蛋 白 单 克 隆 抗 体 ２Ｇ４（ａｎｔｉ－ｍｙｏｓｉｎ ｍｏｎ－
分组和培养 细胞按随机数字表法分为五组： 正常对照组 （Ｃ 组）：细 胞 不 经 任 何 处 理；单 纯 缺 氧－ 复氧 组 （ＩＲ 组）：细 胞 进 行 缺 氧 ２ｈ 复 氧 １ｈ 处 理； ｍＡｂ２Ｇ４／ＯＤＮ／ｌｉｐ 处 理 ２ μｇ 组 （Ｌ 组 ）：配 制 ｍＡｂ２Ｇ４／ＯＤＮ／ｌｉｐ低 剂 量 （２μｇ ＯＤＮ）混 合 液，处 理 细 胞 ４ｈ 后 ，更 换 为 普 通 培 养 基 继 续 培 养 ２０ｈ，进 行缺氧２ｈ 复 氧 １ｈ 处 理；４μｇ 组 （Ｍ 组），６μｇ 组 （Ｈ 组）：分别配制 ｍＡｂ２Ｇ４／ＯＤＮ／ｌｉｐ ４μｇ、６μｇ混 合液，处理方法同 Ｌ 组。
【摘要】 目的 探 讨 抗 肌 球 蛋 白 单 克 隆 抗 体 ２Ｇ４／寡 核 苷 酸／阳 离 子 脂 质 体 复 合 物 （ｍＡｂ２Ｇ４／ ＯＤＮ／ｌｉｐ）在 Ｈ９Ｃ２心肌细胞缺氧复氧模型中的作用 及 机 制。 方 法 将 培 养 的 心 肌 细 胞 按 随 机 数 字 表法分为五组：正 常 对 照 组 （Ｃ 组 ）、单 纯 缺 氧－复 氧 组 （ＩＲ 组 ）、ｍＡｂ２Ｇ４／ＯＤＮ／ｌｉｐ ２μｇ 处 理 组 （Ｌ 组）、ｍＡｂ２Ｇ４／ＯＤＮ／ｌｉｐ ４μｇ处理组（Ｍ 组）和 ｍＡｂ２Ｇ４／ＯＤＮ／ｌｉｐ ６μｇ 处 理 组 （Ｈ 组 ）。Ｃ 组 不 作 任 何 处理；ＩＲ 组细胞孔加入生理盐水；其余三组加入不同剂量 ｍＡｂ２Ｇ４／ＯＤＮ／ｌｉｐ处理细胞４ｈ，更换普 通培养基继续培养２０ｈ。各实验 组 再 进 行 缺 氧 ２ｈ 复 氧 １ｈ 处 理。 ＭＴＴ 法 测 五 组 心 肌 细 胞 活 力； ＥＬＩＳＡ 法测 ＴＮＦ－α、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＡＳＴ、ＣＫ 及 ＳＯＤ 的 浓 度。结 果 与 Ｃ 组 比 较，其 余 四 组 细 胞 活 力 明 显下降，ＴＮＦ－α、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＡＳＴ、ＣＫ 浓度明 显 升 高，ＳＯＤ 浓 度 明 显 降 低（Ｐ＜０．０１）；与ＩＲ 组 比 较，Ｌ 组 和 Ｍ 组细胞活力明显上升，ＴＮＦ－α、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＳＯＤ 浓度明显升高，ＡＳＴ、ＣＫ 浓度明显降低（Ｐ＜０．０１）。 与 Ｌ组比较，Ｍ 组和 Ｈ 组 ＴＮＦ－α、ＩＬ－６、ＩＬ－８和 ＳＯＤ 浓度明显升高，ＡＳＴ、ＣＫ 浓度明显降低（Ｐ＜０．０１）。 结论 ｍＡｂ２Ｇ４／ＯＤＮ／ｌｉｐ ２μｇ、４μｇ处理能够通过特异性的结合受损心肌细胞，抑制炎性因子 ＴＮＦ－α、 ＩＬ－６、ＩＬ－８的表达，降低 ＡＳＴ、ＣＫ 表达，升高 ＳＯＤ 浓度，对缺氧复氧心肌细胞起到保护作用。
ｌｉｐ ｆｏｒ ４ｈａｎｄ ｔｈｅｎ ｗｅｒｅ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｗｉｔｈ ｎｏｒｍａｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ ｆｏｒ ２０ｈ．Ａｌｌ ｔｈｅ ｃｅｌｌｓ ｕｎｄｅｒｗｅｎｔ ｈｙ－ ｐｏｘｉａ ｆｏｒ ２ｈａｎｄ ｆｏｌｌｏｗｅｄ ｂｙ １ｈｒｅｏｘｙｇｅｎａｔｉｏｎ．Ｔｈｅ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ ｗａｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ ＭＴＴ ａｓｓａｙ．Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＴＮＦ－α，ＩＬ－６，ＩＬ－８ ｗａｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ ＥＬＩＳＡ．Ａｓｐａｒｔａｔｅ ａｍｉｎｏ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ （ＡＳＴ），Ｃｒｅａｔｉｎｅ ｋｉｎａｓ （ＣＫ），ａｎｄ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅ （ＳＯＤ）ｗｅｒｅ ａｌｓｏ ｍｅａｓｕｒｅｄ ｔｏ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ ｔｈｅ ｉｎｊｕｒｙ ｏｆ ｃｅｌｌｓ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ，ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＴＮＦ－α，ＩＬ－６，ＩＬ－８，ＡＳＴ ａｎｄ ＣＫ ｉｎ ｔｈｅ ｆｏｕｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｇｒｏｕｐｓ ｗａｓ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ （Ｐ＜ ０．０１），ｗｈｉｌｅ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＳＯＤ ｗａｓ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ．Ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ＩＲ ｇｒｏｕｐ，ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＴＮＦ－α，ＩＬ－６，ＩＬ－８ａｎｄ ＳＯＤ ｉｎ ｂｏｔｈ ｔｈｅ Ｌ ａｎｄ Ｍ ｇｒｏｕｐｓ ｗａｓ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ（Ｐ＜ ０．０１），ｗｈｉｌｅ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＡＳＴ ａｎｄ ＣＫ ｗｅｒｅ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ．Ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ Ｌ ｇｒｏｕｐ，ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＴＮＦ－ α，ＩＬ－６，ＩＬ－８ａｎｄ ＳＯＤ ｉｎ ｔｈｅ Ｍ ａｎｄ Ｈ ｇｒｏｕｐｓ ｗｅｒｅ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ，ｗｈｉｌｅ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＡＳＴ ａｎｄ ＣＫ ｗｅｒｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ （Ｐ＜０．０１）．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｔｈｅ ｍＡｂ２Ｇ４／ＯＤＮ／ｌｉｐ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｄｏｓｅｓ ２μｇ，４μｇ ｃａｎ ｐｒｏｔｅｃｔ ｔｈｅ ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ｈｙｐｏｘｉａ ａｎｄ ｒｅｏｘｙｇｅｎａｔｉｏｎ ｉｎｊｕｒｙ ｂｙ ｉｎｈｉｂ－ ｉｔｉｎｇ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＴＮＦ－α，ＩＬ－６，ＩＬ－８ａｎｄ ｄｅｃｒｅａｓｉｎｇ ｔｈｅ ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ ＡＳＴ ａｎｄ ＣＫ ａｎｄ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ＳＯＤ．
材料与方法
细胞和材料 Ｈ９Ｃ２ 心 肌 细 胞 （上 海 拜 力 生 物 科技有 限 公 司 ）；ＤＭＥＭ 完 全 培 养 基，胰 酶 （Ｔｒｙｐ－ ｓｉｎ－ＥＤＴＡ），胎 牛 血 清 （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ 公 司 ）；ＡＳＴ／ ＧＯＴ，ＣＫ，ＳＯＤ 试 剂 盒 （南 京 建 成 生 物 工 程 研 究 所）；羊抗 ＧＲＰ７８ 多 克 隆 抗 体，羊 抗 ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ ｃ， ＶＤＡＣ１多克 隆 抗 体 （Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ 公 司 ）；小 鼠 免 疫 球蛋白 Ｇ（ＩｇＧ）ＥＬＩＳＡ 试 剂 盒 （伊 莱 瑞 特 生 物 科 技 有限公司）；小 鼠 抗 肌 球 蛋 白 单 克 隆 抗 体 （ａｂｃａｍ 公 司）；ＤＳＰＣ，胆 固 醇，ＤＳＰＥ－ＰＥＧ（２０００）ＰＤＰ，ＤＳＰＥ－ ＰＥＧ（２０００）Ａｍｉｎｅ（Ａｖａｎｔｉ公 司）；ＳＰＤＰ，ＤＴＴ（Ｓｉｇ－ ｍａ公 司 ）；兔 抗 ＮＦ－κＢ 多 克 隆 抗 体 （Ｂｉｏｗｏｒｌｄ 公 司）；ＨＲＰ 标记羊抗兔二抗（武汉博士德生物工程有 限 公 司 ）。
ｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ａｎｅｓｔｈｅｓｉｏｌｏｇｙ，Ｚｈｏｎｇｎａｎ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ Ｗｕｈａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｕｈａｎ ４３００７１，Ｃｈｉｎａ
Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ａｕｔｈｏｒ：ＷＵ Ｙｕｎ，Ｅｍａｉｌ：２２３３０５１６５９＠ｑｑ．ｃｏｍ
【Ａｂｓｔｒａｃｔ】 Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ａｎｄ ｉｔｓ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ａｎｔｉ－ｍｙｏｓｉｎ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ２Ｇ４／ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ／ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ （ｍＡｂ２Ｇ４／ＯＤＮ／ｌｉｐ）ｏｎ Ｈ９Ｃ２ｃａｒｄｉｏ－ ｍｙｏｃｙｔｅｓ ｗｉｔｈ ｈｙｐｏｘｉａ－ｒｅｏｘｙｇｅｎａｔｉｏｎ ｉｎｊｕｒｙ ｍｏｄｅｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｗｅ ｕｓｅｄ ｔｈｅ Ｈ９Ｃ２ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ ｔｏ ｅｓｔａｂｌｉｓｈ ｔｈｅ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ Ｈｙｐｏｘｉａ－Ｒｅｏｘｙｇｅｎａｔｉｏｎ ｍｏｄｅｌ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅ ｐｌａｔｅｓ，ｗｈｉｃｈ ｗｅｒｅ ｒａｎｄｏｍｌｙ ｄｉｖｉｄ－ ｅｄ ｉｎｔｏ ｆｉｖｅ ｇｒｏｕｐｓ，ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ ａｎｄ ｆｏｕｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｇｒｏｕｐｓ．Ｔｈｅ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｔｈｅ ＩＲ ｇｒｏｕｐ ｗｅｒｅ ｔｒｅａ－ ｔｅｄ ｗｉｔｈ ｓａｌｉｎｅ，ｔｈｅ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｇｒｏｕｐｓ ｗｅｒｅ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｄｏｓｅｓ ｏｆ ｍＡｂ２Ｇ４／ＯＤＮ／
【关 键 词 】 ＮＦ－κＢ；缺 氧 复 氧 ；Ｈ９Ｃ２ 心 肌 细 胞
Ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｍＡｂ２Ｇ４／ＯＤＮ／ｌｉｐ ｏｎ Ｈ９Ｃ２ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ ｗｉｔｈ ｈｙｐｏｘｉａ－ｒｅｏｘｙｇｅｎａｔｉｏｎｉｎｊｕｒｙ
ＣＨＥＮ Ｌｉｕｆａｎｇ，ＪＩＮＧ Ｇｕｏｑｉｎｇ，ＹＡＮＧ Ｊｉａｎｇｕｏ，ＺＨＡＮＧ Ｚｏｎｇｚｅ，ＷＡＮＧ Ｙａｎｌｉｎ，ＷＵ Ｙｕｎ．Ｄｅ－
研究发现miri激活的nfb可增高促炎细胞因子的血浆水平增强梗死区中性粒细胞浸润导致心脏收缩功能降低和心肌损伤所以抑制nfb激活可以减少tnf和il6等炎性细胞因子的产生和中性粒细胞募集从而减少心梗面积和改善心功能67sod是具有抗氧化作用的酶类其含量高低间接反映机体清除氧自由基的能力本研究建立mab2g4lip作用于h9c2心肌细胞缺氧复氧模型发现经过mab2g4tnf表达显著下调sod表达上调提示mab2g4lip能通过mab2g4特异性地识别缺血心肌细胞从而具有靶向性的携带目的基因nfbdecoyodn进入缺血心肌通过抑制nfb诱导的炎性反应及提高了清除氧自由基的能力来发挥其保护作用
临 床 麻 醉 学 杂 志 ２０１５ 年 ６ 月 第 ３１ 卷 第 ６ 期 Ｊ Ｃｌｉｎ Ａｎｅｓｔｈｅｓｉｏｌ，Ｊｕｎｅ ２０１５，Ｖｏｌ．３１，Ｎｏ．６
·实验研究·
ｍＡｂ２Ｇ４／ＯＤＮ／ｌｉｐ 在 Ｈ９Ｃ２ 心 肌 细 胞 缺 氧 复 氧 模型中的保护作用
陈刘芳 靖国庆 杨建国 张宗泽 王焱林 吴云
【Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ】 ＮＦ－κＢ；Ｈｙｐｏｘｉａ／ｒｅｏｘｙｇｅｎａｔｉｏｎ；Ｈ９Ｃ２ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ
基 金 项 目 ：国 家 自 然 科 学 基 金 （编 号 ：８１２０１４９９） 作者单位：４３００７１ 武 汉 市，武 汉 大 学 中 南 医 院 麻 醉 科 （陈 刘
Ｈ９Ｃ２心肌 细 胞 按 常 规 培 养，高 糖 ＤＭＥＭ 完 全 培养基，１０％胎牛血清，置于３７ ℃、５％ＣＯ２ 细胞培养 箱中培养，０．２５％胰 酶消化传代，选取对数生 长 期 细 胞进行实 验。将 心 肌 细 胞 置 于 厌 氧 袋 中 密 封 后，３７
临 床 麻 醉 学 杂 志 ２０１５ 年 ６ 月 第 ３１ 卷 第 ６ 期 Ｊ Ｃｌｉｎ Ａｎｅｓｔｈｅｓｉｏｌ，Ｊｕｎｅ ２０１５，Ｖｏｌ．３１，Ｎｏ．６
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ｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ２Ｇ４，ｍＡｂ２Ｇ４）能 高 效 特 异 性 地 与 受损心肌细胞结合；核转 录 因 子－κＢ（ＮＦ－κＢ）作 为 一 种广泛存在 的 诱 导 性 核 转 录 因 子，其 在 ＭＩＲＩ中 的 作用是近年来 缺 血－再 灌 注 损 伤 机 制 研 究 的 重 要 进 展［２］；转染人工合成与 ＮＦ－κＢ 结 合 位 点 具 高 度 亲 和 力 的 寡 聚 脱 氧 核 苷 酸 也 就 是 诱 骗 性 寡 核 苷 酸 （ｄｅｃｏｙ ＯＤＮ）是 近 年 来 倍 受 关 注 的 一 个 可 以 特 异 性 针 对 ＮＦ－κＢ 的新 型 基 因 治 理 策 略。 因 此 我 们 设 想 建 立 Ｈ９Ｃ２心肌细胞 缺 氧 复 氧 模 型，运 用 基 因 工 程 技 术 将 ｍＡｂ２Ｇ４和 ＮＦ－κＢ ｄｅｃｏｙ ＯＤＮ 融合成单克隆抗 体／寡 核 苷 酸／阳 离 子 脂 质 体 复 合 物 （ｍＡｂ２Ｇ４／ ＯＤＮ／ｌｉｐ），并 探 讨 不 同 剂 量 ｍＡｂ２Ｇ４／ＯＤＮ／ｌｉｐ 是 否能在 ｍＡｂ２Ｇ４引导下靶向到达缺氧心肌细胞 内， 快 速 、高 效 地 抑 制 细 胞 内 转 录 因 子 的 激 活 ，进 而 抑 制 炎性细胞因子的表 达，对 缺 氧 复 氧 心 肌 细 胞 起 到 保 护作用。
芳、靖 国 庆、张 宗 泽、王 焱 林、吴 云）；武 汉 大 学 ＨＯＰＥ 护 理 学 院 （杨 建国）
通 信 作 者 ：吴 云 ，Ｅｍａｉｌ：２２３３０５１６５９＠ｑｑ．ｃｏｍ
心 肌 缺 血－再 灌 注 损 伤 （ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｉｓｃｈｅｍｉａ ａｎｄ ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ ｉｎｊｕｒｙ，ＭＩＲＩ）是阻碍缺血心肌从 再 灌注疗法 中 获 得 最 佳 疗 效 的 主 要 难 题。 有 研 究 报 道 ［１］抗 肌 球 蛋 白 单 克 隆 抗 体 ２Ｇ４（ａｎｔｉ－ｍｙｏｓｉｎ ｍｏｎ－
分组和培养 细胞按随机数字表法分为五组： 正常对照组 （Ｃ 组）：细 胞 不 经 任 何 处 理；单 纯 缺 氧－ 复氧 组 （ＩＲ 组）：细 胞 进 行 缺 氧 ２ｈ 复 氧 １ｈ 处 理； ｍＡｂ２Ｇ４／ＯＤＮ／ｌｉｐ 处 理 ２ μｇ 组 （Ｌ 组 ）：配 制 ｍＡｂ２Ｇ４／ＯＤＮ／ｌｉｐ低 剂 量 （２μｇ ＯＤＮ）混 合 液，处 理 细 胞 ４ｈ 后 ，更 换 为 普 通 培 养 基 继 续 培 养 ２０ｈ，进 行缺氧２ｈ 复 氧 １ｈ 处 理；４μｇ 组 （Ｍ 组），６μｇ 组 （Ｈ 组）：分别配制 ｍＡｂ２Ｇ４／ＯＤＮ／ｌｉｐ ４μｇ、６μｇ混 合液，处理方法同 Ｌ 组。
【摘要】 目的 探 讨 抗 肌 球 蛋 白 单 克 隆 抗 体 ２Ｇ４／寡 核 苷 酸／阳 离 子 脂 质 体 复 合 物 （ｍＡｂ２Ｇ４／ ＯＤＮ／ｌｉｐ）在 Ｈ９Ｃ２心肌细胞缺氧复氧模型中的作用 及 机 制。 方 法 将 培 养 的 心 肌 细 胞 按 随 机 数 字 表法分为五组：正 常 对 照 组 （Ｃ 组 ）、单 纯 缺 氧－复 氧 组 （ＩＲ 组 ）、ｍＡｂ２Ｇ４／ＯＤＮ／ｌｉｐ ２μｇ 处 理 组 （Ｌ 组）、ｍＡｂ２Ｇ４／ＯＤＮ／ｌｉｐ ４μｇ处理组（Ｍ 组）和 ｍＡｂ２Ｇ４／ＯＤＮ／ｌｉｐ ６μｇ 处 理 组 （Ｈ 组 ）。Ｃ 组 不 作 任 何 处理；ＩＲ 组细胞孔加入生理盐水；其余三组加入不同剂量 ｍＡｂ２Ｇ４／ＯＤＮ／ｌｉｐ处理细胞４ｈ，更换普 通培养基继续培养２０ｈ。各实验 组 再 进 行 缺 氧 ２ｈ 复 氧 １ｈ 处 理。 ＭＴＴ 法 测 五 组 心 肌 细 胞 活 力； ＥＬＩＳＡ 法测 ＴＮＦ－α、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＡＳＴ、ＣＫ 及 ＳＯＤ 的 浓 度。结 果 与 Ｃ 组 比 较，其 余 四 组 细 胞 活 力 明 显下降，ＴＮＦ－α、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＡＳＴ、ＣＫ 浓度明 显 升 高，ＳＯＤ 浓 度 明 显 降 低（Ｐ＜０．０１）；与ＩＲ 组 比 较，Ｌ 组 和 Ｍ 组细胞活力明显上升，ＴＮＦ－α、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＳＯＤ 浓度明显升高，ＡＳＴ、ＣＫ 浓度明显降低（Ｐ＜０．０１）。 与 Ｌ组比较，Ｍ 组和 Ｈ 组 ＴＮＦ－α、ＩＬ－６、ＩＬ－８和 ＳＯＤ 浓度明显升高，ＡＳＴ、ＣＫ 浓度明显降低（Ｐ＜０．０１）。 结论 ｍＡｂ２Ｇ４／ＯＤＮ／ｌｉｐ ２μｇ、４μｇ处理能够通过特异性的结合受损心肌细胞，抑制炎性因子 ＴＮＦ－α、 ＩＬ－６、ＩＬ－８的表达，降低 ＡＳＴ、ＣＫ 表达，升高 ＳＯＤ 浓度，对缺氧复氧心肌细胞起到保护作用。
ｌｉｐ ｆｏｒ ４ｈａｎｄ ｔｈｅｎ ｗｅｒｅ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｗｉｔｈ ｎｏｒｍａｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ ｆｏｒ ２０ｈ．Ａｌｌ ｔｈｅ ｃｅｌｌｓ ｕｎｄｅｒｗｅｎｔ ｈｙ－ ｐｏｘｉａ ｆｏｒ ２ｈａｎｄ ｆｏｌｌｏｗｅｄ ｂｙ １ｈｒｅｏｘｙｇｅｎａｔｉｏｎ．Ｔｈｅ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ ｗａｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ ＭＴＴ ａｓｓａｙ．Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＴＮＦ－α，ＩＬ－６，ＩＬ－８ ｗａｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ ＥＬＩＳＡ．Ａｓｐａｒｔａｔｅ ａｍｉｎｏ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ （ＡＳＴ），Ｃｒｅａｔｉｎｅ ｋｉｎａｓ （ＣＫ），ａｎｄ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅ （ＳＯＤ）ｗｅｒｅ ａｌｓｏ ｍｅａｓｕｒｅｄ ｔｏ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ ｔｈｅ ｉｎｊｕｒｙ ｏｆ ｃｅｌｌｓ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ，ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＴＮＦ－α，ＩＬ－６，ＩＬ－８，ＡＳＴ ａｎｄ ＣＫ ｉｎ ｔｈｅ ｆｏｕｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｇｒｏｕｐｓ ｗａｓ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ （Ｐ＜ ０．０１），ｗｈｉｌｅ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＳＯＤ ｗａｓ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ．Ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ＩＲ ｇｒｏｕｐ，ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＴＮＦ－α，ＩＬ－６，ＩＬ－８ａｎｄ ＳＯＤ ｉｎ ｂｏｔｈ ｔｈｅ Ｌ ａｎｄ Ｍ ｇｒｏｕｐｓ ｗａｓ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ（Ｐ＜ ０．０１），ｗｈｉｌｅ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＡＳＴ ａｎｄ ＣＫ ｗｅｒｅ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ．Ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ Ｌ ｇｒｏｕｐ，ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＴＮＦ－ α，ＩＬ－６，ＩＬ－８ａｎｄ ＳＯＤ ｉｎ ｔｈｅ Ｍ ａｎｄ Ｈ ｇｒｏｕｐｓ ｗｅｒｅ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ，ｗｈｉｌｅ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＡＳＴ ａｎｄ ＣＫ ｗｅｒｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ （Ｐ＜０．０１）．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｔｈｅ ｍＡｂ２Ｇ４／ＯＤＮ／ｌｉｐ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｄｏｓｅｓ ２μｇ，４μｇ ｃａｎ ｐｒｏｔｅｃｔ ｔｈｅ ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ｈｙｐｏｘｉａ ａｎｄ ｒｅｏｘｙｇｅｎａｔｉｏｎ ｉｎｊｕｒｙ ｂｙ ｉｎｈｉｂ－ ｉｔｉｎｇ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＴＮＦ－α，ＩＬ－６，ＩＬ－８ａｎｄ ｄｅｃｒｅａｓｉｎｇ ｔｈｅ ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ ＡＳＴ ａｎｄ ＣＫ ａｎｄ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ＳＯＤ．
材料与方法
细胞和材料 Ｈ９Ｃ２ 心 肌 细 胞 （上 海 拜 力 生 物 科技有 限 公 司 ）；ＤＭＥＭ 完 全 培 养 基，胰 酶 （Ｔｒｙｐ－ ｓｉｎ－ＥＤＴＡ），胎 牛 血 清 （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ 公 司 ）；ＡＳＴ／ ＧＯＴ，ＣＫ，ＳＯＤ 试 剂 盒 （南 京 建 成 生 物 工 程 研 究 所）；羊抗 ＧＲＰ７８ 多 克 隆 抗 体，羊 抗 ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ ｃ， ＶＤＡＣ１多克 隆 抗 体 （Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ 公 司 ）；小 鼠 免 疫 球蛋白 Ｇ（ＩｇＧ）ＥＬＩＳＡ 试 剂 盒 （伊 莱 瑞 特 生 物 科 技 有限公司）；小 鼠 抗 肌 球 蛋 白 单 克 隆 抗 体 （ａｂｃａｍ 公 司）；ＤＳＰＣ，胆 固 醇，ＤＳＰＥ－ＰＥＧ（２０００）ＰＤＰ，ＤＳＰＥ－ ＰＥＧ（２０００）Ａｍｉｎｅ（Ａｖａｎｔｉ公 司）；ＳＰＤＰ，ＤＴＴ（Ｓｉｇ－ ｍａ公 司 ）；兔 抗 ＮＦ－κＢ 多 克 隆 抗 体 （Ｂｉｏｗｏｒｌｄ 公 司）；ＨＲＰ 标记羊抗兔二抗（武汉博士德生物工程有 限 公 司 ）。
ｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ａｎｅｓｔｈｅｓｉｏｌｏｇｙ，Ｚｈｏｎｇｎａｎ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ Ｗｕｈａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｕｈａｎ ４３００７１，Ｃｈｉｎａ
Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ａｕｔｈｏｒ：ＷＵ Ｙｕｎ，Ｅｍａｉｌ：２２３３０５１６５９＠ｑｑ．ｃｏｍ
【Ａｂｓｔｒａｃｔ】 Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ａｎｄ ｉｔｓ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ａｎｔｉ－ｍｙｏｓｉｎ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ２Ｇ４／ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ／ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ （ｍＡｂ２Ｇ４／ＯＤＮ／ｌｉｐ）ｏｎ Ｈ９Ｃ２ｃａｒｄｉｏ－ ｍｙｏｃｙｔｅｓ ｗｉｔｈ ｈｙｐｏｘｉａ－ｒｅｏｘｙｇｅｎａｔｉｏｎ ｉｎｊｕｒｙ ｍｏｄｅｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｗｅ ｕｓｅｄ ｔｈｅ Ｈ９Ｃ２ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ ｔｏ ｅｓｔａｂｌｉｓｈ ｔｈｅ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ Ｈｙｐｏｘｉａ－Ｒｅｏｘｙｇｅｎａｔｉｏｎ ｍｏｄｅｌ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅ ｐｌａｔｅｓ，ｗｈｉｃｈ ｗｅｒｅ ｒａｎｄｏｍｌｙ ｄｉｖｉｄ－ ｅｄ ｉｎｔｏ ｆｉｖｅ ｇｒｏｕｐｓ，ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ ａｎｄ ｆｏｕｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｇｒｏｕｐｓ．Ｔｈｅ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｔｈｅ ＩＲ ｇｒｏｕｐ ｗｅｒｅ ｔｒｅａ－ ｔｅｄ ｗｉｔｈ ｓａｌｉｎｅ，ｔｈｅ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｇｒｏｕｐｓ ｗｅｒｅ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｄｏｓｅｓ ｏｆ ｍＡｂ２Ｇ４／ＯＤＮ／
【关 键 词 】 ＮＦ－κＢ；缺 氧 复 氧 ；Ｈ９Ｃ２ 心 肌 细 胞
Ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｍＡｂ２Ｇ４／ＯＤＮ／ｌｉｐ ｏｎ Ｈ９Ｃ２ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ ｗｉｔｈ ｈｙｐｏｘｉａ－ｒｅｏｘｙｇｅｎａｔｉｏｎｉｎｊｕｒｙ
ＣＨＥＮ Ｌｉｕｆａｎｇ，ＪＩＮＧ Ｇｕｏｑｉｎｇ，ＹＡＮＧ Ｊｉａｎｇｕｏ，ＺＨＡＮＧ Ｚｏｎｇｚｅ，ＷＡＮＧ Ｙａｎｌｉｎ，ＷＵ Ｙｕｎ．Ｄｅ－
研究发现miri激活的nfb可增高促炎细胞因子的血浆水平增强梗死区中性粒细胞浸润导致心脏收缩功能降低和心肌损伤所以抑制nfb激活可以减少tnf和il6等炎性细胞因子的产生和中性粒细胞募集从而减少心梗面积和改善心功能67sod是具有抗氧化作用的酶类其含量高低间接反映机体清除氧自由基的能力本研究建立mab2g4lip作用于h9c2心肌细胞缺氧复氧模型发现经过mab2g4tnf表达显著下调sod表达上调提示mab2g4lip能通过mab2g4特异性地识别缺血心肌细胞从而具有靶向性的携带目的基因nfbdecoyodn进入缺血心肌通过抑制nfb诱导的炎性反应及提高了清除氧自由基的能力来发挥其保护作用