乏氧诱导因子—1α在人牙周膜细胞的表达

乏氧诱导因子—1α在人牙周膜细胞的表达作者：唐开亮于西佼杜毅
来源：《中国医学创新》2013年第13期
【摘要】目的：本研究在缺氧的环境下培养人牙周膜细胞，模拟类似牙周组织局部缺血的病理模型，探讨体外牙周膜细胞在缺氧环境中HIF-1α的表达情况。

方法：常规培养人牙周膜细胞，20%和1%的氧浓度下培养牙周膜细胞24 h，利用RT-PCR及western blot技术检测HIF-1αmRNA及蛋白的表达情况。

结果：在常氧及缺氧环境下，都可检测到HIF-1αmRNA的表达，且两者的表达量差异无统计学意义，但在缺氧环境中牙周膜细胞的HIF-1α蛋白呈强阳性表达，与对照组比较，差异有统计学意义。

结论：缺氧使牙周膜细胞HIF-1α蛋白表达增加，提示牙周炎和正畸导致的缺氧微环境对人牙周膜细胞的活性与功能有一定影响。

【关键词】牙周膜细胞；缺氧；乏氧诱导因子
当牙周组织出现炎症时，其血液微循环被破坏，牙周组织会出现缺氧的情况。

正畸治疗由于牙周组织受到压力，其局部也会出现缺血现象导致牙周组织缺氧。

组织的氧浓度不足以及炎症细胞因子都可活化乏氧诱导因子（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α），缺氧环境会对组织造成重要的生物学影响，因此本实验模拟相当于牙周膜组织局部缺血的病理模型，在缺氧的环境下培养牙周膜细胞，探讨不同氧浓度下体外牙周膜细胞HIF-1α的表达情况。

1 资料与方法
1.1 人牙周膜细胞体外培养与分组无菌条件下刮取青少年正畸拔除健康第一前磨牙牙根中1/3牙周膜组织，均匀铺在培养皿底部，加入标准高糖胎牛培养基。

常规DMEM法培养。

取第3代牙周膜细胞用于实验。

细胞分成两组：对照组在20% O2的37 ℃培养箱中培养24 h；缺氧组牙周膜细胞在1% O2的37 ℃培养箱中培养24 h。

1.2 RT-PCR法检测缺氧对人牙周膜细胞细胞HIF-1α mRNA表达的影响 0.25%的胰蛋白酶液消化牙周膜细胞，配成单细胞悬液，接种到6孔板中，按实验分组分别移入常氧与缺氧培养箱中培养。

Trizol两步法提取细胞总RNA，随机引物提取RNA反转录合成cDNA，按照TaKaRa RNA PCR试剂盒说明书对cDNA 产物进行PCR扩增，凝胶电泳，紫外照相。

应用LabWorks软件测电泳条带密度值，分别计算GAPDH基因片段电泳带密度和目的基因片段电泳带密度的相对值，以测量目的基因的相对表达水平。

所用引物序列如下：HIF-1α5’-AGAGCGCAGATGGATCCTAA-3’
5’-TTCCTTTTGCACAGCTCCTT-3’ 退火温度为56.5℃，预期RC产物为160 bp； GAPDH 5’-GCTCTCCAGAACATCTACC-3’ 5’-GTGTCGCTGTTGAAGTCAG-3’ 退火温度为55.5 ℃，预期RC产物为266 bp。

1.3 Western blot 检测缺氧下人牙周膜细胞HIF-1α蛋白的表达每瓶细胞加400 μl含PMSF 的裂解液后取上清液加入20μl 2×SDS上样缓冲液混匀，煮沸3～5 min后上样电泳，离心取上清。

以上述上清液进行SDS-PAGE蛋白电泳后转膜，将PVDF膜放入平皿中，用封闭液没过，摇动1 h，用封闭液稀释一抗（1：400）加入平皿中，摇动孵育1 h，然后4℃过夜，反应结束后，用PBS洗3次，每次5～10 min，再用TBS洗一次，5～10 min，用TBS配制1%的脱脂奶粉溶液，稀释二抗（1：500），摇动反应1～2 h，用TBS洗3次，每次5～10 min，最后进行显色，进入暗室X光胶片曝光显影，用Labwork计算机软件对条带灰度值进行半定量分析。

2 结果
缺氧组及对照组都可检测到HIF-1αmRNA的表达，且缺氧组mRNA的表达量高于对照组，但两者之间差异并无统计学意义（图1）。

然而，western blot显示缺氧组的HIF-1α蛋白的表达量明显高于对照组，差异具有统计学意义（图2、图3）。

3 讨论
细胞的氧感知能力是机体长期以来进化形成重要生理功能，机体组织细胞正常功能的运转是由细胞通过氧感受器来适应不同的生理状态得已实现[1]。

当组织处于缺氧环境时，局部组织与细胞会对此作出生理或病理反应。

乏氧诱导因子（hypoxia inducible factor-1，HIF-1）可依据外界氧浓度的高低来调控其下游相应基因的表达，以维持细胞内氧环境的稳定，是机体重要的缺氧传递信号因子。

其中，细胞感受氧浓度高低并作出生物反应的关键分子是HIF-1α
（HIF-1α），其能激活其下游多种低氧反应性基因的表达，调控与血红素的产生、形成血管、细胞生存和能量代谢等相关基因表达[2]。

正畸对牙齿的施力，可导致牙周组织毛细血管血流量的暂时性梗阻，血液循环将会受到抑制[3]，与牙髓生理血流量相比，健康牙周组织血流量较低[4]，牙周炎的牙周组织微循环存在障碍。

这些情况牙周组织都处于缺氧的微环境中。

在牙周炎病理及正畸的牙槽骨吸收过程，牙周组织所处缺氧微环境可能起着重要作用。

不同组织细胞所需的氧浓度值不同，当毛细血管被明显破坏时，低于1%氧浓度可出现在牙周组织中[4]。

因此，本研究依据相关缺氧培养细胞的文献，在1%氧的氧浓度下培养牙周膜细胞[5]。

HIF-1αmRNA在常氧组和缺氧组的牙周膜细胞中都可检测到其表达，提示人牙周膜细胞有HIF-1αmRNA的表达。

与常氧组相比，缺氧组HIF-1mRNA的表达量虽有增高，但两者差异无统计学意义，说明人牙周膜细胞HIF-1αmRNA的表达可能不受缺氧时间及氧浓度的高低影响。

牙周膜细胞HIF-1α蛋白在缺氧24 h时在本研究中呈高度表达，提示HIF-1αmRNA表达与蛋白的表达可能无较大相关性[6]，HIF-1α活性的调节主要依赖于HIF-1α蛋白在细胞内的积聚及其稳定性。

特异性的敲除巨噬细胞，单核细胞等细胞中HIF-1α基因，可使其移动、聚集、趋化、杀菌力和侵袭性等炎症反应能力均丧失[7]。

在牙周炎牙龈组织的鳞状上皮、上皮下基
底膜、毛细血管壁内皮细胞可见HIF-1α呈乳突状轮廓样表达，在肉芽组织和结缔的炎症细胞也可见其阳性表达且染色增强明显[8]。

本研究中缺氧可诱导HIF-1α蛋白表达及积聚、鉴于HIF-1α对下游基因的调控作用，提示缺氧诱导的HIF-1α在牙周炎的发生及发展过程中起着一定调控作用。

但是HIF缺氧的调控途径较为复杂，其可诱导其下游多种靶基因的表达，具体缺氧对人牙周膜细胞的生物学特性的影响还需要进一步研究。

参考文献
[1] Semenza G L. Perspectives on oxygen sensing[J].Cell，1999， 98（3）： 281-284.
[2] Blancher C， Moore J W， Talks K L， et al. Relationship of hypoxia-inducible factor （HIF）-1alpha and HIF-2alpha expression to vascular endothelial growth factor induction and hypoxia survival in human breast cancer cell lines[J].Cancer Res，2000， 60（24）： 7106-7113.
[3] Matsuo M T K. The changes in periodontal ligament in the case of thrombus caused by the malocclusal forces[J].Microcirc Annu， 1991， 7： 129-130.
[4] Hitchon C， Wong K， Ma G， et al. Hypoxia-induced production of stromal cell-derived factor 1 （CXCL12） and vascular endothelial growth factor by synovial fibroblasts[J].Arthritis Rheum，2002， 46（10）： 2587-2597.
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[6] Gaengler P， Merte K. Effects of force application on periodontal blood circulation. A vital microscopic study in rats[J].J Periodontal Res，1983， 18（1）： 86-92.
[7] Berra E， Richard D E， Gothie E， et al. HIF-1-dependent transcriptional activity is required for oxygen-mediated HIF-1alpha degradation[J].FEBS Lett，2001， 491（1-2）： 85-90.
[8]贺小宁，陈文军，李斌. 牙龈组织 HIF-1 表达水平与牙周炎相关性的研究[J].宁夏医学杂志，2007，2（3）： 10.
（收稿日期：2012-11-29）（本文编辑：车艳）。