乙偶姻代谢

细菌中乙偶姻代谢相关研究
第一章前言
1.1 乙偶姻的基本性质及其应用
1.1.1 乙偶姻的性质
乙偶姻（acetoin）即3-羟基丁酮，分子量88.12，有两种手性异构体。

乙偶姻单体为无色或淡黄色液体，有奶油香气，两分子乙偶姻易聚合成二聚体，二聚体为白色结晶粉末，熔点15℃，沸点148℃，能自燃，易溶于水，溶于乙醇、丙二醇，微溶于乙醚，在植物油中几乎不溶。

自然地存在于玉米、葡萄酒、蜂蜜、可可、黄油、咖啡、草莓和醋栗等物质中，由于其具有特有的奶油香味，因此多用于奶油、干酪、咖啡、坚果的香味增强剂，同时也可用于配制奶油、乳品、酸乳和草莓型香精等，啤酒风味、奶酪香味均与乙偶姻有关。

由于其具有特有的奶油香味，乙偶姻在食品、香料以及化妆品等行业都有着非常重要的用途。

1.1.2 乙偶姻的应用
（1）在食品中的应用：乙偶姻是国际上常用的香料品种。

主要用作奶油、乳品、酸乳和草莓型等香料的生产，80%含量的乙偶姻俗称“醋嗡”，是酒类调香中一个极其重要的品种；
（2）在制药行业的应用：可用来生产医药中间体，较大程度地提高药效，减轻药物的副作用；
（3）在烟草行业的应用：乙偶姻、1-戊烯-3-醇、1-戊醇等成分具有典型的香气特征，对烟叶香气具有良好的影响，是特香型烤烟品种中特殊香气风格的主要物质基础；
（4）在化工行业的应用：乙偶姻可以用做含氯聚合物的稳定剂，石油行业的起泡剂，而乙偶姻与脂肪二元羧酸形成的酯可以用做防冻剂和增塑剂。

乙偶姻还可以作为一种新兴的平台化合物，广泛应用于其他行业，2004年美国能源部将其列为30种优先开发利用的平台化合物之一[1]。

1.2 乙偶姻的生产
1.2.1 丁二酮部分加氢还原生产乙偶姻
目前国内外研究及应用较多的乙偶姻生产方法是2,3-丁二酮部分加氢还原的方法[2],反应原理如图：
该方法主要是以 2,3-丁二酮为原料通过添加不同的催化剂、还原剂来加氢还原得到乙偶姻。

张小舟[3]等人对以 2,3-丁二酮为原料的乙偶姻化学合成工艺进行了研究，以锌为还原剂，探索了该还原反应的规律。

而 Martin Studer 等
则应用改性的铂作为催化剂对2,3-丁二酮进行选择性的加氢还原，得到具有一定旋光度的乙偶姻。

1.2.2 2,3-丁二醇选择性氧化法生产乙偶姻
人们对于2,3-丁二醇选择性氧化法生产乙偶姻的探索主要集中在空气氧化法和电化学氧化法。

空气氧化法即在装填铜刨花的反应器中，将2,3-丁二醇与空气加热至315o C后通过管式反应器，通过被空气氧化得到乙偶姻。

电化学氧化法即通过电解，使2,3-丁二醇失去H质子后变成负离子，向正极迁移从而发生氧化反应。

电化学氧化法只需使反应温度维持在40o C，电池电压为0.8V即可实现反应。

上述两种化学法都存在产品收率低，较难实现产业化，环境污染严重等缺点，最严重的是上述两种方法的原料来源（2,3-丁二醇和丁二酮）均来自石油，随着石油资源的日益枯竭，这两种原料的成本将越来越高，必将增加乙偶姻的生产成本，更加不能满足人们对乙偶姻的消费需求，因此迫切需要一条可持续的乙偶姻生产工艺。

1.2.3 生物法生产乙偶姻
基于上述两种化学法合成乙偶姻工艺路线的缺点以及人们对产品质量的担忧，人们开始将目光集中在用生物合成法来替代化学合成法，以期减轻环境资源压力，提高产品质量。

1.2.3.1 酶转化法生产乙偶姻
Hummel[4]等通过分离纯化乳酸菌或酵母菌中的丁二酮还原酶，以NADPH为辅酶，在pH5.0，70o C下用该还原酶催化丁二酮的还原，得到乙偶姻。

该方法产率最高可达到100%，且没有其他副产物。

De Faveri[5]等开发了一种附有醇脱氢酶活力的膜反应器，采用汉氏醋杆菌(Acetobacter hansenii) MIM2000/5全细胞催化2,3-丁二醇合成乙偶姻，考虑各种因素，在最适条件下2,3-丁二醇转化为乙偶姻的最大摩尔转化率达71.6%。

酶转化法与化学合成法相比，酶法产物得率高，没有其他副产物，但要获得大量特异性的酶比较困难，并且原料与化学法相同，都为丁二酮或2,3-丁二醇，存在同样的原料限制，因此酶法并没有从根本上改变乙偶姻的生产现状。

1.2.3.2 发酵法生产乙偶姻
自然界中某些细菌具有产乙偶姻的能力，能以糖质为原料进行发酵生产，但通常乙偶姻是作为丁二酮和2,3-丁二醇的副产物，产量较少。

因此从自然界中筛选分离到能够高产乙偶姻的菌株是提高发酵法生产乙偶姻转化率的一个重要环节。

赵祥颖等[6, 7]选育获得了一株高产乙偶姻的枯草芽孢杆菌SFA-H31 (CGMCC 1869)，可有效地转化葡萄糖生成乙偶姻，转化率高达48.26%，接近理论转化率（48.9%）[8]，且该菌不产丁二酮和2,3-丁二醇，是一株极具研究价值的乙偶姻生产菌株。

此外Xu[9]等也分离纯化出一株短小芽孢杆菌XH195（DSM 16187），该菌株发酵生产乙偶姻的发酵单位达80 g/L，是目前报道的乙偶姻发酵单位最高的菌株，它能在含氯化钠质量浓度为100 g/L的培养基上生长，并能以葡萄糖或蔗糖为碳源，37o C下发酵60 h后，乙偶姻的产量分别达63.0 g/L或58.1g/L。

此外由于以葡萄糖或其他能够转化生成丙酮酸的化合物为底物发酵生产乙偶姻的代谢途径已经研究得比较清楚[10, 11]，因此可以通过这一点，通过基因工程手段得到能够高产乙偶姻的菌株。

在微生物体内，有两条主要的乙偶姻合成途径：
两分子丙酮酸在α-乙酰乳酸合成酶的作用下合成一分子α-乙酰乳酸，α-乙酰乳酸在酸性条件下非酶自然氧化脱羧生成丁二酮，丁二酮又可在丁二酮还原酶或2,3-丁二醇脱氢酶的作用下还原为乙偶姻，该氧化途径已得到大量生化、分子生物学的数据支持[11, 12]；另一条途径是在α-乙酰乳酸合成后，经α-乙酰乳酸脱羧酶生成乙偶姻。

通过这两条途径生成的乙偶姻还可进一步被2,3-丁二醇脱氢酶还原成2,3-丁二醇。

因此可以通过基因工程手段敲除编码这两个酶的基因以使这两个酶失活，阻止乙偶姻向2,3-丁二醇和丁二酮的转化，从而达到积累乙偶姻的目的。

1.3 乙偶姻新陈代谢的生理意义
1.3.1 维持 pH 稳定，贮存碳源
细菌由于将丙酮酸代谢为乙偶姻或 2,3-丁二醇而避免了酸性产物在胞内的积累[13,14]，维持了 pH 稳定，避免了菌体的过早衰亡；同时由于在葡萄糖等能源利用完之后，乙偶姻能被作为替代的能源或碳源[15]，因此在细菌体内乙偶姻和2,3-丁二醇的合成也是一种能源贮备策略[16, 17]。

1.3.2 维持 NAD/NADH 比值的稳定
乙偶姻和2,3-丁二醇之间的可逆转化是和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD）与还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide hydrogenated，NADH）之间的转化相偶联的，因此乙偶姻/2,3-丁二醇代谢途径也被认为参与了细菌中维持 NAD/NADH 比率的稳定和平衡[17, 18]。

1.4 研究的背景与意义
乙偶姻在食品、制药、化工等行业都有重要用途，乙偶姻的生产已经研究的比较透彻，其中包括化学法和生物法，由于化学法有产率不高、原料来源不足等缺陷，日益显现出生物法生产乙偶姻的优势。

一般可由可再生的生物质原料通过细菌发酵来生产乙偶姻。

第二章实验
2.1 前言
基因工程技术是蛋白质工程的基础，它使从基因水平上改造微生物蛋白质成为了可能，而基因工程技术的第一步就是目的基因的克隆，基因克隆是指将目的基因从生物体基因组中分离并与载体 DNA 连接构成的 DNA 重组体在受体细胞内进行复制、扩增的技术。

基因工程技术为基因的结构和功能的研究提供了有力的手段。

在异源蛋白的表达中，大肠杆菌由于其背景清晰得到了广泛的应用。

当前己商业化的基因工程产品大多是通过大肠杆菌表达的，其主要优点是成本低、产量高、培养周期短，易于操作。

pET 系列载体是 Novagen 公司开发的一种非常有效的原核表达载体，利用 Lac 操纵子序列以及 Lac I 基因构建的以 T7 启动子为基础的表达载体，使外源基因的表达直接受 IPTG 的诱导。

Lac I 产生的阻遏蛋白与 Lac 操纵基因结合，从而不能进行外源基因的转录及表达，此时宿主菌
进行正常生长，积累生物量，当向培养基中加入 Lac操纵子的诱导物 IPTG，阻遏蛋白不能与操纵基因结合，则外源基因大量转录并高效表达。

2.2试验方法
2.2.1培养基及菌种保藏条件
LB 培养基：蛋白胨 10 g/L，NaCl 10 g/L，酵母粉 5 g/L，调节 pH 为 7.2，121°C 高压蒸汽灭菌 20 min。

菌种保藏：菌种短期保藏采用斜面于冰箱4o C 保藏，长期保藏是用过夜培养的菌液与 40%的灭菌甘油等体积混合，混匀后置于-80o C，可保藏一年以上。

若需保藏时间更长一些的则需要进行冻干保藏，具体做法如下：将适当浓度（一般为 10%）的脱脂牛奶1-2 ml 加入长满菌苔的固体斜面，充分混匀后，吸取 0.5 ml 加入事先灭菌的冻干管中，用灭菌脱脂棉封口，冷冻干燥，然后抽真空，并同时对管体进行加热熔融，封口。

冻干保藏的菌株由于保藏环境真空度高，湿度小等优点，能存活 5-10 年。

2.2.2基因组 DNA 的提取
使用 TIANGEN 的细菌基因组 DNA 提取试剂盒对菌体进行 DNA 提取。

具体操作如下：
（1）取细菌培养液 1-5 ml，10,000 rpm 离心 1 min，尽量吸净上清；
（2）向菌体沉淀中加入200 µl 缓冲液 GA，振荡至菌体彻底悬浮；
（3）向管中加入20 µl 蛋白酶 K 溶液，混匀；
（4）加入220 µl 缓冲液 GB，振荡 15 s，70o C 放置 10 min，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内的水珠；
（5）加220 µl 无水乙醇，充分振荡混匀 15 s，此时可能会出现絮凝状沉淀，简短离心以去除管内壁的水珠；
（6）将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱 CB3 中（吸附柱放入收集管中），12,000 rpm 离心 30 s，倒掉废液，将吸附柱 CB3 放入收集管中；（7）向吸附柱 CB3 中加入500 µl 缓冲液 GD，12,000 rpm 离心 30 s，倒掉废液，将吸附柱 CB3 放入收集管中；
（8）向吸附柱 CB3 中加入700 µl 漂洗液 PW，12,000 rpm 离心 30 s，倒掉废液，吸附柱 CB3 放入收集管中；
（9）向吸附柱 CB3 中加入500 µl 漂洗液 PW，12,000 rpm 离心 30 s，倒掉废液，将吸附柱 CB3 放入收集管中；
（10）将吸附柱 CB3 放入收集管中，12,000 rpm 离心 2 min，倒掉废液；将吸附柱 CB3开盖置于温室放置数分钟，以彻底晒干吸附材料中残余的漂洗液；（11）将吸附柱 CB3 转入一个干净的离心管中，想吸附膜的中间部位悬空滴加50-200µl 洗脱缓冲液 TE，温室放置 2 - 5 min，12,000 rpm 离心 2 min，将溶液收集到离心管中，收集管中得到的就是菌体的 DNA；
（12）得到的 DNA 于-20o C 存放，备用。

2.2.3 PCR 体系及方法
2.2.
3.1 引物设计
根据HTA426 中的 Gk0373 的基因序列，设计引物如下，上下游引物分别设计
EcoR I 和 Hind III 酶切位点（用黑斜体标出）：
GKF：5’-CCG AAGCTT TCAGGACTTCCTCTTGGCC-3’
GKR：5’-CCC GAATTC ATGAAGAGAACGATGCGTC-3’
2.2.
3.2 PCR 扩增
PCR 扩增体系按如下：
Tap buffer 5μl；
dNTP 4μl；
引物各 1μl；
酶 0.5μl；
O 37.5μl；
ddH
2
模板 1μl
PCR 反应条件如下：94°C 变性 5 min，94°C 变性40 s，60°C 退火 30 s，72°C 延伸 2 min，从第二步循环 30 次后，72°C 延伸10 min。

2.2.
3.3 PCR 扩增产物的回收
使用天根生物公司的切胶回收试剂盒对琼脂糖凝胶电泳中的目标条带进行回收，具体操作步骤如下：
（1）在紫外灯下切下含有目标条带的(1100 bp 左右)琼脂糖凝胶，吸尽凝胶表面的液体，切碎；
（2）称量凝胶重量，根据重量加入3倍体积的 PN buffer，均匀后于 50°C 混合至凝胶完全融化；
（3）冷却至室温后，全部转移到收集管中，静置2 min；
（4）12000 rpm 离心30 S，弃滤液；
（5）将制备管置回离心管中，加入600 μl PW溶液，12000 rpm 离心 30 s，弃滤液；
（6）重复步骤（5）；
（7）将制备管置回离心管中 12,000 rpm 离心 2 min；
（8）将制备管置于洁净的 Eppendorf 管中，在 DNA 制备膜中央加50μl洗脱液，室温静置 1 min，12,000 rpm 离心 1 min，洗脱 DNA
2.2.4 PCR 扩增产物与载体的连接
将目的基因GK0373和PET28a质粒，用 EcoR I和 Hind III进行双酶切，酶切体系如下：
成分体积（µl）
质粒 10
EcoR I 1
Hind III 1
10 × M buffer 2
O 6
ddH
2
总体系 20
上述切胶回收产物与 PET28a载体进行连接。

连接反应按说明书进行。

16℃连接 12 h，得到克隆载体PET28a-GK0373。

连接体系如下：
成分体积（µl）
pET28a(+) 2
目的片段 2
T4 DNA ligase 1
10 × T4 DNA ligase buffer 1
dd H
2
O 4
总体系 10
2.3.5 转化
将连接物通过热激法转化感受态 E.coli DH5α，具体操作步骤如下：（1）取两管 E. coli DH5α感受态细胞100 µl，冰浴 5 min；
（2）每管中加入 5 µl 重组质粒，冰浴 30 min；
（3） 42o C 水浴热休克 90 s，冰上放置 2 - 3 min；
（4）取转化后的细胞悬液200 µl 转入到装有800 µl 预冷 LB 液体培养基的试管中，37o C，150 rpm，震荡培养 45 min；
（5）将200 µl 转化的菌液涂布于含 50 mg/ml Amp，涂有40 µl X-gal 和 7 µl IP TG 的LB 平板培养基上，37o C 过夜培养；
（6）随机挑选 10 个阳性菌落接入 5 ml 含 Amp 的 LB 液体培养基中，37o C，150 rpm，振荡培养 8-12 h；
（7）提取转化子质粒，经合适的限制性内切酶酶切后用琼脂糖凝胶电泳检查片段大小。

2.4 诱导表达
取测序结果为阳性的重组菌BL21 / pET28a(+)-GK0373单菌落于5.0 ml含卡那霉素 50 ug/ml 的 LB 液体培养基，37o C 培养过夜，次日按 1%的接种量转接入新鲜的 100 ml含卡那霉素 50 ug/ml 的 LB 液体培养基，继续培养 3-4 h （OD600约 0.4 ~ 0.6）后，加 IPTG诱导，终浓度为 0.1 mM/L，25o C 培养20 h，8000 rpm 离心 5 min，收集菌体。

菌体用 20 mM/L 磷酸钾缓冲液（pH 7.4）洗两次，然后用 20 mM/L 磷酸缓冲液（pH7.4）重悬至 OD600= 20，用超声波破碎仪破碎菌体细胞，4o C，12000 rpm 离心 20 min，收集上清即为重组菌粗酶液。

取上清进行 SDS-PAGE 电泳检测。

2.5 蛋白纯化
His 标签的蛋白纯化需用到的缓冲液：
（1）低浓度咪唑缓冲液（low imidazole buffer，L-buffer）：20 mM/LNa
2HPO
4
-NaH
2PO
4
(pH 7.4), 25 mM/L 咪唑；
（2）高浓度咪唑缓冲液（high imidazole buffer，H-buffer）：20 mM/LNa
2HPO
4
-NaH
2PO
4
(pH 7.4),0.5 M/L 咪唑。

天然条件下较大量纯化目的蛋白步骤：
按ÄKTAprime plus 系统提供的“Histidine-tagged protein purification gradient elution”
说明书步骤操作，具体如下：
（1）当诱导表达实验中的菌体浓度达到一定程度时，测定培养物的 OD 600，4°C，12,000rpm 离心 5 min，收集菌体；
（2）菌体用 L-buffer 洗涤一次，然后重悬至 OD600值为 20，冰浴条件
下超声波破碎菌体细胞 10 min(5s,10s,320w)，4°C，12,000 rpm 离心 30 min；
（3）将上清用 0.22 μm 滤膜过滤至新的容器，以防进样时发生堵柱；
（4）打开ÄKTAprime，先用 L-buffer 进行冲洗至基线平稳；
（5）将 A 通道浸入上述处理过的蛋白中，流速为 2 ml/min；
（6）观察出峰情况，至镍柱吸附饱和后将 A 通道换到 L-buffer 溶液中，流速仍为 2ml/min，冲洗掉未结合的杂蛋白；
（7）基线平稳后，用 M-buffer 冲洗一次，流速为 2 ml/min，洗脱掉结合的杂蛋白；
（8）基线平稳后，换为 H-buffer 进行洗脱，流速为 2 ml/min，观察出峰情况，收集目的蛋白，约 15 ml；
（9）洗脱完成后，将 A 通道插入 20%的乙醇溶液中，流速为 2 ml/min，使柱子中充满乙醇，防止染菌；
（10）将收集到的目的蛋白装入预先处理好的透析袋中，将透析袋放入 5 L
pH 7.4 的20 mM/LNa
2HPO
4
-NaH
2
PO
4
(pH 7.4),于 4°C 透析 16 h；
（11）将透析好的样品加入 5 kDa 的浓缩管中，5000 rpm 离心 30 min，收集目的蛋白，进行 SDS-PAGE 电泳。

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