生血康口服液黄芪甲苷含量测定方法学研究

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生血康口服液黄芪甲苷含量测定方法学研究
发布时间:2021-12-22T08:27:45.856Z 来源:《中国科技人才》2021年第27期作者:高萍
[导读] 参照中国药典对本品中君药黄芪,摸索建立了黄芪甲苷的含量测定方法,并进行了方法学验证试验,具体内容如下:
哈药集团三精制药有限公司黑龙江省哈尔滨市 150069
摘要:目的:建立HPLC法测定生血康口服液中黄芪甲苷的含量方法。

方法:采用SpursilC18柱(200×4.6mm,5μm)为色谱柱;乙腈-水(28:72)为流动相;流速1.0ml?min-1;柱温30℃;进样量20μl;漂移管温度50℃,喷雾器级别70%,增益150,气体流量20PSI。

结果:黄芪甲苷在10.25μg?mL-1~153.75μg?mL-1的浓度范围内具有良好的线性关系,R=0.9999;平均回收率为99.07%,RSD(%)=0.46%。

结论:本方法准确,灵敏,可用于生血康口服液中黄芪甲苷的含量测定。

关键词:生血康口服液;黄芪甲苷;HPLC
生血康口服液是补气补血、健脾益肾、化瘀解毒的纯中药制剂,是恶性肿瘤放、化疗后的用药,使用中药材达十八位,有黄芪、红参、五味子、当归、枸杞子等名贵药材,目前检验标准采用国家药品标准,含量测定采用薄层扫描法测定其黄芪甲苷含量。

生血康口服液由十八味中药材加工而成的中药合剂,具有补气生血、健脾益肾、化瘀解毒,主治恶性肿瘤放化疗引起的红、白细胞减少症,气血两虚兼脾肾虚损、腰膝酸软、恶心呕吐、口渴喜饮等症候。

参照中国药典对本品中君药黄芪,摸索建立了黄芪甲苷的含量测定方法,并进行了方法学验证试验,具体内容如下:
一、试药
生血康口服液规格:20ml/支);乙腈为色谱纯,甲醇、氨水为分析纯,水为纯化水。

二、色谱条件与系统适用性试验
SpursilC18柱(200mm×4.6mm,5μm);流动相乙腈-水(28:72);流速1.0mL?min-1;柱温30℃;漂移管温度50℃,喷雾器级别70%,增益150,气体流量20PSI。

理论板数按黄芪甲苷峰计算应不低于4000。

三、对照品溶液、供试品溶液的制备
1、对照品储备液的制备。

取黄芪甲苷对照品适量,精密称定,加甲醇制成每1ml含黄芪甲苷0.1mg的溶液,即得第1个浓度对照品溶液。

精密量取上述溶液5ml,至10ml量瓶中,加甲醇稀释至刻度,即得浓度对照品溶液。

2、供试品溶液的制备。

精密量取本品5ml,加水15ml,用水饱和的正丁醇提取3次,每次20ml,合并正丁醇液,用氨试液充分洗涤2次,每次20ml,弃去氨液,正丁醇液蒸干,残渣加水5ml使溶解,通过D101型大孔吸附树脂柱(内径为1.0cm,柱高为8cm),以水80ml洗脱,弃去水液,再用40%乙醇40ml洗脱,弃去洗脱液,再用70%乙醇60ml洗脱,收集洗脱液,蒸干,加甲醇溶解并转移至10ml量瓶内,加甲醇至刻度,摇匀,即得。

测定法:分别精密吸取浓度的对照品溶液和供试品溶液各20μl,注入液相色谱仪,用外标两点法计算黄芪甲苷含量。

3、专属性试验。

取阴性样品,按供试品溶液制备方法,制备阴性供试品溶液,照色谱条件分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液、阴性供试品溶液各20μl,注入液相色谱仪,记录色谱图。

结果在与黄芪甲苷对照品相应的保留时间处,阴性供试品无色谱峰,表明处方中其他药材和辅料对黄芪甲苷测定无干扰,本方法专属性良好。

4、线性关系考察。

精密称取黄芪甲苷对照品10.25mg,置10ml量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,作为对照品原液。

分别精密量取上述对照品原液0.1、0.3、0.7
5、1.0、1.5ml,分别置10ml量瓶中,用甲醇稀释至刻度,摇匀,即得不同浓度的对照品溶液,照上述色谱条件,精密吸取20μl,注入液相色谱仪,记录色谱图。

以浓度对数值为横坐标,峰面积对数值为纵坐标,对黄芪甲苷进行线性回归,见表。

结果表明,黄芪甲苷在10.25μg?mL-1~153.75μg?mL-1浓度范围内相应的线性关系良好。

5、重复性试验。

取同一批次样品,按供试品制备方法平行处理6份样品,照上述色谱条件,精密吸取20μl,注入液相色谱仪,考察样品的黄芪甲苷含量。

结果表明,样品黄芪甲苷含量的RSD为2.0%,本方法重复性良好。

回收率试验,精密称取黄芪甲苷对照品16.71mg,置100ml量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,作为黄芪甲苷对照品原液。

精密量取本品2.5ml,精密加入黄芪甲苷对照品原液2.0ml,
2.5ml,
3.0ml(分别相当于2.5ml本品中黄芪甲苷含量的80%、100%、120%)各3份,加水15ml,用水饱和的正丁醇提取3次,每次20ml,合并正丁醇液,用氨试液充分洗涤2次,每次20ml,弃去氨液,正丁醇液蒸干,残渣加水5ml使溶解,通过D101型大孔吸附树脂柱(内径为1.0cm,柱高为8cm),以水80ml洗脱,弃去水液,再用40%乙醇40ml洗脱,弃去洗脱液,再用70%乙醇60ml洗脱,收集洗脱液,蒸干,加甲醇溶解并转移至10ml量瓶内,加甲醇至刻度,摇匀,即得回收率的供试品溶液。

对照品溶液的制备同前。

分别精密吸取20μl,分别注入液相色谱仪,记录色谱图,计算回收率。

结果表明,黄芪甲苷在不同浓度的回收率平均值为99.07%,RSD为0.46%,符合规定,该方法准确度
好。

四、讨论
药典黄芪药材的流动相系统为乙腈-水(32:68),而本品采用此流动相系统,黄芪甲苷峰与相邻色谱峰分离不完全,故减少乙腈比例,经流动相不同比例尝试,确定本品的流动相系统为乙腈-水(28:72),延长黄芪甲苷出峰时间,使与相邻色谱峰达到了良好分离(分离度大于1.5)。

生血康口服液含量测定检验的经验总结,是此方法必须注意到的事项,总结出来,供参考,中药的薄层扫描法测含量是准确性、重现性较差的方法,在没有其他方法取代之前,总结这些注意事项是很必要的,因为本品是多组分混合液,又是要求高的薄层扫描法,为了提高准确度及重现性现将检验过程中注意事项如下:
1、展开剂的配制。

氯仿-甲醇-水(13:7:2),要求配制后冷处放置过夜后,取下层使用。

在实际操作中发现,按此比例配制的展开剂,展开后,Rf值高,斑点前沿,分离度不好,根据常用有机溶液极性由大到小的顺序:水>甲酸>甲醇>醋酸>乙醇>异丙醇>丙酮>正丙醇>苯酚>正丁醇>正戊醇>乙酸乙酯>氯仿>苯>甲苯>环己烷>石油醚>液状石蜡看出,甲醇的极性大于氯仿的极性,要想斑点Rf值降到在适宜范围内,需增加适量极性相对小的氯仿量,工作中常用:取用正常配制的展开剂约40ml,加入层析缸中,再加入氯仿约1ml,在层析缸中摇匀,静置约10分钟,即可把薄层板放入层析缸中进行展开。

2、显色。

薄层板从层析缸中取出,晾干或吹风机吹干。

显色剂为15%的硫酸乙醇溶液,关键点:要用95%乙醇,用无水乙醇可致显色快且不稳定。

配制时需将硫酸沿玻璃棒缓慢分次加入到95%乙醇中。

烘板:“喷以15%硫酸乙醇溶液,在105℃烘10分钟,直至斑点显色清晰,取出”,这个过程强调二次喷板,二次显色,第一次,全板喷以15%硫酸乙醇溶液,放入烘箱中,观察斑点刚刚显现,取出,对准黄芪甲苷斑点位置,均匀喷以15%硫酸乙醇溶液,再放入烘箱中,观察斑点显现清晰,约5分钟,取出,在薄层板上覆盖同样大小的玻璃板,即可,经方法学验证试验结果表明,该方法测定结果准确可靠,重复性好,适合生血康口服液中黄芪甲苷的含量测定。

参考文献:
[1]张晨波.生血康口服液中黄芪甲苷的测定方法研究[M].北京:中国医药科技出版社,2019:10.
[2]刘月丹,闫雪生,李岩.生血康口服液中黄芪甲苷的测定标准研究[J].中国实验方剂学杂志,2018(08).。

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