老鹰茶总黄酮体外抗呼吸道合胞病毒的作用.
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老鹰茶总黄酮体外 抗呼吸道合胞病毒的作用
主讲人：黄升海 职 称：教 授 邮 箱：shhuang@ 单 位：安徽医科大学微生物学教研室
一、目的和要求
1. 熟悉中药抗呼吸道合胞病毒的体外实 验方法。 2. 了解医学微生物学和其它相关学科的 一些实验原理及操作步骤。
பைடு நூலகம்
二、实验材料
（5）37℃孵育6~7d，到时每孔添加约2ml的1％福尔马林（以 0.15M的NaCl配制），固定过夜使之充分渗透过覆盖层。固 定时间24h以上，无上限； （6）剔除覆盖层，用自来水轻柔的冲洗平板边缘残留的琼脂 糖； （7）每孔添加2~3ml的0.05％中性红。贮存液为10×的，可 保存数月之久，工作液以去离子水稀释即可； （8）室温染色1h~1d，吸掉染液，轻柔地清洗并打开盖子令 其干燥后即可保存数年之久； （9）空斑计算法分别计算两组的空斑形成数，加以比较，以 鉴定老鹰茶总黄酮对RSV的具体作用。
约在病毒对照孔CPE为75%以上时弃培养液 上清，每孔加入含5.0 g/L MTT的培养液50μl， 继续培养2～3h后洗去MTT上清，每孔加 DMSO溶解液100μl，混匀5～10 min后测 A570 nm值。并按下述公式计算药物对RSV 抑制率。 病毒抑制率（%）=（药物处理组A570 nm病毒对照组A570 nm）/（细胞对照组A570 nm-病毒对照组A570 nm）×100%.
在已长成单层Hep-2细胞的40孔板上接种RSV，每 孔50μl（100 TCID50），33℃吸附90min后弃病毒 上清。根据细胞毒性实验的结果，在药物无毒浓度 范围内加入不同浓度的含药维持液，每孔0.2ml。 （各孔药物维持液浓度分别为：10、20、40、80、 160、320、640、800、1600mg/L）。然后将RSV 培养板置33℃，50mL/L CO2培养，每日观察CPE。 隔日换新鲜含药维持液。实验同时设正常细胞对照 组、病毒对照组、阳性药物病毒唑组和药物组。当 细胞发生病变时，细胞出现肿胀、变圆，折光性减 弱，有合胞体形成。
1.材料：试药，阳性对照药利巴韦林， RSV-Long株病毒，Hep-2细胞； 2.试剂：细胞培养液，培养板，胎牛血清， 琼脂糖，MTT，胰蛋白酶等； 3.器材：全自动酶标仪，CO2孵箱等。
三、实验内容和方法
用胰蛋白酶将生长良好的Hep-2细胞分散成单个细胞悬液， 按1×108/ml的细胞密度分种于40孔板，每孔0.1ml。置 37℃, 50mL/L CO2培养箱中培养24 h。待细胞长成单层 后弃培养液上清，换含不同浓度的含药维持液，每种浓度重 复4孔，并设正常细胞对照。继续培养48 h后弃培养液上清， 每孔加入含5g/L MTT的无血清MEM培养基50μl，置CO2 培养箱中继续培养2～3 h后弃MTT上清，PBS洗3次，每孔 加溶解液（DMSO：乙醇体积比为1∶1）100μl，振荡5～ 10 min，待结晶完全溶解后于96孔酶标测定仪上测定 A570 nm值，并根据下式计算细胞存活率，计算药物对细 胞的最大无毒浓度范围。 细胞存活率（%）=（实验孔A570 nm/对照孔A570 nm） ×100%。
四、思考题
1.通过本次实验结果，复习文献，分析有哪 些方法可用于药物的抗病毒作用研究？ 2.如何避免实验操作过程中的批间差异？ 3.怎样避免细胞培养过程的污染？
1、药物对Hep-2细胞的毒性作用
2、空斑试验鉴定老鹰茶总黄酮对 RSV的抑制作用
（1）以5×105 /ml的密度接种Hep-2细胞到两组6孔板中，每孔加入3ml 细胞悬液； （2）待细胞长成单层后（不得超过48h），移去营养液，每组每孔加入 400μl的PBS和100μl毒液（10倍系列稀释），其中一组每孔另加400μl 的药物维持液（根据细胞毒性实验的结果，加入浓度在药物无毒浓度 范围内的药物维持液）。 （3）37℃，5％CO2，吸附1~4h，每隔15~30分钟应摇晃板子1次以令 病毒分布均匀，病毒在4h时达到最高吸附度； （4）弃去吸附液，每孔添加覆盖层3ml，少于3ml细胞不易存活。覆盖 层以含5％小牛血清的2×DMEM和0.6％的琼脂糖按1：1比例混合而 成，这样小牛血清的终浓度为2.5％，琼脂糖为0.3％。琼脂糖必须高 压灭菌，用前以微波炉充分融解，并放置65℃水浴保温待用。 2×DMEM即取1袋干粉DMEM加入500ml去离子水融解即可，其中还 可加入双抗或二性霉素等，过滤除菌备用，用时37℃预热。二者应充 分混合且温度不能过高（即无烫手感为止），否则会摧残细胞；
主讲人：黄升海 职 称：教 授 邮 箱：shhuang@ 单 位：安徽医科大学微生物学教研室
一、目的和要求
1. 熟悉中药抗呼吸道合胞病毒的体外实 验方法。 2. 了解医学微生物学和其它相关学科的 一些实验原理及操作步骤。
பைடு நூலகம்
二、实验材料
（5）37℃孵育6~7d，到时每孔添加约2ml的1％福尔马林（以 0.15M的NaCl配制），固定过夜使之充分渗透过覆盖层。固 定时间24h以上，无上限； （6）剔除覆盖层，用自来水轻柔的冲洗平板边缘残留的琼脂 糖； （7）每孔添加2~3ml的0.05％中性红。贮存液为10×的，可 保存数月之久，工作液以去离子水稀释即可； （8）室温染色1h~1d，吸掉染液，轻柔地清洗并打开盖子令 其干燥后即可保存数年之久； （9）空斑计算法分别计算两组的空斑形成数，加以比较，以 鉴定老鹰茶总黄酮对RSV的具体作用。
约在病毒对照孔CPE为75%以上时弃培养液 上清，每孔加入含5.0 g/L MTT的培养液50μl， 继续培养2～3h后洗去MTT上清，每孔加 DMSO溶解液100μl，混匀5～10 min后测 A570 nm值。并按下述公式计算药物对RSV 抑制率。 病毒抑制率（%）=（药物处理组A570 nm病毒对照组A570 nm）/（细胞对照组A570 nm-病毒对照组A570 nm）×100%.
在已长成单层Hep-2细胞的40孔板上接种RSV，每 孔50μl（100 TCID50），33℃吸附90min后弃病毒 上清。根据细胞毒性实验的结果，在药物无毒浓度 范围内加入不同浓度的含药维持液，每孔0.2ml。 （各孔药物维持液浓度分别为：10、20、40、80、 160、320、640、800、1600mg/L）。然后将RSV 培养板置33℃，50mL/L CO2培养，每日观察CPE。 隔日换新鲜含药维持液。实验同时设正常细胞对照 组、病毒对照组、阳性药物病毒唑组和药物组。当 细胞发生病变时，细胞出现肿胀、变圆，折光性减 弱，有合胞体形成。
1.材料：试药，阳性对照药利巴韦林， RSV-Long株病毒，Hep-2细胞； 2.试剂：细胞培养液，培养板，胎牛血清， 琼脂糖，MTT，胰蛋白酶等； 3.器材：全自动酶标仪，CO2孵箱等。
三、实验内容和方法
用胰蛋白酶将生长良好的Hep-2细胞分散成单个细胞悬液， 按1×108/ml的细胞密度分种于40孔板，每孔0.1ml。置 37℃, 50mL/L CO2培养箱中培养24 h。待细胞长成单层 后弃培养液上清，换含不同浓度的含药维持液，每种浓度重 复4孔，并设正常细胞对照。继续培养48 h后弃培养液上清， 每孔加入含5g/L MTT的无血清MEM培养基50μl，置CO2 培养箱中继续培养2～3 h后弃MTT上清，PBS洗3次，每孔 加溶解液（DMSO：乙醇体积比为1∶1）100μl，振荡5～ 10 min，待结晶完全溶解后于96孔酶标测定仪上测定 A570 nm值，并根据下式计算细胞存活率，计算药物对细 胞的最大无毒浓度范围。 细胞存活率（%）=（实验孔A570 nm/对照孔A570 nm） ×100%。
四、思考题
1.通过本次实验结果，复习文献，分析有哪 些方法可用于药物的抗病毒作用研究？ 2.如何避免实验操作过程中的批间差异？ 3.怎样避免细胞培养过程的污染？
1、药物对Hep-2细胞的毒性作用
2、空斑试验鉴定老鹰茶总黄酮对 RSV的抑制作用
（1）以5×105 /ml的密度接种Hep-2细胞到两组6孔板中，每孔加入3ml 细胞悬液； （2）待细胞长成单层后（不得超过48h），移去营养液，每组每孔加入 400μl的PBS和100μl毒液（10倍系列稀释），其中一组每孔另加400μl 的药物维持液（根据细胞毒性实验的结果，加入浓度在药物无毒浓度 范围内的药物维持液）。 （3）37℃，5％CO2，吸附1~4h，每隔15~30分钟应摇晃板子1次以令 病毒分布均匀，病毒在4h时达到最高吸附度； （4）弃去吸附液，每孔添加覆盖层3ml，少于3ml细胞不易存活。覆盖 层以含5％小牛血清的2×DMEM和0.6％的琼脂糖按1：1比例混合而 成，这样小牛血清的终浓度为2.5％，琼脂糖为0.3％。琼脂糖必须高 压灭菌，用前以微波炉充分融解，并放置65℃水浴保温待用。 2×DMEM即取1袋干粉DMEM加入500ml去离子水融解即可，其中还 可加入双抗或二性霉素等，过滤除菌备用，用时37℃预热。二者应充 分混合且温度不能过高（即无烫手感为止），否则会摧残细胞；