川芎嗪对LPS致心肌细胞损伤的影响及机制研究

川芎嗪对LPS致心肌细胞损伤的影响及机制研究
刘丹;尹东;曾姝;何明
【摘要】目的探讨川芎嗪对脂多糖(LPS)诱导的大鼠心肌细胞损伤及NF-κB核移位的影响.方法采用原代培养SD乳鼠心肌细胞,经终浓度分别为40、80、120
μmol·L-1川芎嗪预处理后,用10 mg·L-1 LPS处理6 h,处理完成后检测培养液乳
酸脱氢酶(LDH) 活性,四唑盐(MTT)比色法检测心肌细胞存活率,流式细胞法检测ROS生成,试剂盒检测细胞内丙二醛(MDA)含量及细胞内抗氧化酶(SOD、GSH-Px)活性、Western blot法检测核蛋白中NF-κB p65的变化情况.结果不同剂量川芎嗪(40、80、120 μmol·L-1)预处理3 h后可明显降低LDH活性,增加细胞存活率,降低ROS生成,减少MDA含量,升高SOD、GSH-Px活性,抑制NF-κB p65在细
胞核中的表达,且呈剂量依赖性.结论川芎嗪可抑制LPS所致的心肌损伤,其机制与减少脂质过氧化、增强抗氧化酶系、降低ROS生成、抑制NF-κB p65核移位有关.%Aim To explore the role of tetrameth-ylpyrazine( TMPZ ) in lipopolysaeeharide ( LPS )-in-dueed eardiae cell damage and the nuelear transloea-tion of nuelear faetor kappaB( MF-ΚB ). Methods Cardiae eells isolaLed from primary neonaLal SD rat were pretreated with 40, 80, 120
μmol · L~1 TMPZ respeeLively, and Lhen LreaLed wiLh 10 mg · L~1 LPS for 6 hours. After treatment, the aetivity of laetie aeid dehydrogenase ( LD11 ) was determined by auto-bio-ehemistry analysator, eells viability was analyzed by meLhyl thiazolyl tetrazolium( MTT), generation of reae-tive oxygen speeies ( ROS ) were measured by flow ey-tometry , the eonLent of malondialdehyde ( MDA ), and the aeLivity of superoxide dismutase ( SOD ) and gluta-thione peroxidase ( GSII-PX ) were analyzed by eolori- metrie
method, the level of MF-ΚB p65 protein in nu-elear was deteeted by wesLern blotting. Results 3 hours pretreatment with different doses of TMPZ(40, 80, 120 μmol · L~1) signifieantly inereased cardiae cells viability, deereased LDII aetivity, ROS produe-tion and MAD eontent. SOD and GSll-Px aetivities were improved, and the nuelear expression of MF-ΚB p65 was inhibited in a dose-dependent manner. Conclusion TMPZ ean alleviate
LPS-indueed cardiae cell damage by suppressing lipid peroxidation, enhaneing antioxidant enzymes, deereasing ROS produetion and inhibiting nuelear transloeation of MF-ΚB.
【期刊名称】《中国药理学通报》
【年(卷),期】2012(028)011
【总页数】5页(P1531-1535)
【关键词】川芎嗪;脂多糖;ROS;NF-κB;心肌细胞;损伤;氧化应激
【作者】刘丹;尹东;曾姝;何明
【作者单位】南昌大学医学院药理学教研室;江西省分子医学重点实验室,江西,南昌,330006;南昌大学医学院药理学教研室;南昌大学医学院药理学教研室
【正文语种】中文
【中图分类】R-332;R284.1;R322.11;R329.24;R542.202.2
四甲基吡嗪(TMPZ)又名川芎嗪，是从川芎的生物碱中分离得到的有效单体。

川芎
嗪有良好的心肌保护作用，主要与其具备抗钙与抗自由基双重作用有关［1－2］。

脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)为革兰阴性细菌胞壁的重要成分，是引起炎症
反应和休克的关键介质之一，常引起全身炎症反应并可导致多器官功能衰竭，累及心脏。

有研究报道［3］，LPS可增加心肌细胞NADH氧化酶的表达及过氧化物
增殖而导致心肌损伤。

鉴于川芎嗪的抗氧自由基作用，我们假设川芎嗪可以保护LPS损伤的心肌细胞，目前尚未见报道。

因此，本研究利用LPS诱导心肌细胞损伤，观察川芎嗪对LPS诱导的心肌细胞损伤的影响，并检测活性氧(reactive oxygen species，ROS)生成、细胞的氧化应激状态及NF-κB p65的核移位情况，探讨川芎嗪对抗LPS损伤的可能机制。

1 材料与方法
1.1 受试药品与主要试剂 TMPZ:中国药品生物制品检定所，NF-κB p65、β-actin
抗体及相应二抗:Santa Cruz;DCHF-DA:Molecular probes;胎牛血清:杭州四季青
生物工程材料有限公司;MDA、SOD、GSH-Px检测试剂盒:南京建成生物工程研究所;胞核-胞质蛋白制备试剂盒:北京普利莱基因技术有限公司;MEM培养基:Gibco BRL;LPS(伤寒菌内毒素脂多糖)、胰酶、HEPES、MTT、增强化学发光印迹试剂、硝酸纤维素膜(Amersham，UK)、丙烯酰胺、PMSF、亮肽素、SDS、亚甲基双丙烯酰胺、过硫酸铵、TEMED、EDTA和DTT:Sigma公司;其它试剂均为分析纯。

1.2 心肌细胞的分离培养参照以前的实验方法［4］，以出生1～3 d的SD乳鼠
心室肌组织为实验对象，0.1%胰酶消化分离，MEM培养基(含15%胎牛血清)混
悬后放CO2培养箱(5%CO2，37℃)孵育2 h去除成纤维细胞，然后分别按
5×105cells·well－1、1 ×105cells·well－1接种于 6 孔、96 孔培养板，隔天换培养液，前3 d加入0.1 mmol·L－1Brdu抑制纤维细胞生长。

培养4 d随机分组进行实验。

1.3 药物处理用不同剂量的TMPZ预处理3 h，弃原培养基，用PBS清洗3次，
换新的MEM培养基，再加LPS(5mg·L－1)继续培养6 h，收集细胞进行实验。

每
次实验均分溶剂对照组(正常对照)、LPS处理组及药物干预组(TMPZ+LPS)，每组
至少重复6次，TMPZ用生理盐水溶解。

1.4 细胞存活率 MTT比色法检测细胞存活率。

胰酶消化收集细胞，每组细胞以
1×104cells·well－1浓度接种至96孔培养板中。

细胞融合至80%左右开始检测。

吸弃原培养基，每孔加入20 μl MTT 溶液(5 g·L－1溶于PBS)，37 ℃，4 h，然
后每孔加DMSO 150 μl振荡10 min，使蓝色结晶充分溶解，在490 nm波长处测定其光吸收值(OD值)。

1.5 生化检测各组处理结束后取上清200 μl，生化自动分析仪检测LDH活性。

1.6 流式细胞法检测心肌细胞内ROS含量实验结束后，用4℃预冷的PBS洗涤细胞2～3次，加入0.25%胰蛋白酶 (含0.02%EDTA)消化细胞后收集，将配制好的10 μmol·L－1DCFH-DA 溶液500 μl重悬细胞，37℃孵育30 min，离心，800
×g，5 min，弃上清，预冷的PBS洗涤细胞2～3次，制成1×108 cells·L－1的
悬液，立即进行流式细胞仪检测，以488 nm为激发波长，530 nm为发射波长。

以不加DCFH-DA的一管为阴性对照。

1.7 细胞内丙二醛(MDA)含量、SOD及GSH-Px活性测定实验结束后，消化收集心肌细胞，反复冻融破碎细胞，离心后取上清液，按试剂盒说明书进行操作。

1.8 Western blot检测实验结束后，按试剂盒说明书提取心肌细胞核蛋白，同等
量蛋白质行SDSPAGE后，电转膜，分别结合一抗、二抗，最后X线胶片曝光分析。

1.9 数据处理应用SPSS11.5统计软件行组间方差分析，各实验组数据以±s表示。

2 结果
2.1 TMPZ对LPS致心肌细胞损伤的影响如Fig 1，2 所示，心肌细胞用不同剂量(40、80、120 μmol·L－1)TMPZ 预处理 3 h，加入10 mg·L－1 LPS，心肌细胞
的存活率随TMPZ剂量的增大而升高，LDH值则随TMPZ剂量的增大而减少，具
有明显的剂量依赖性。

Fig 1 Effects of TMPZ on viability of cardiac cells subjected to LPS-induced injury(±s，n=6)＊＊P ＜0.01 vs control group;##P ＜0.01 vs LPS group.
Fig 2 Effects of TMPZ on LDH activity of cardiac cells subjected to LPS-induced injury(±s，n=6)＊＊P＜0.01 vs control group;##P＜0.01 vs LPS group.
2.2 TMPZ剂量依赖性地减少ROS生成流式细胞仪检测结果显示(Fig 3)，用10 mg·L－1LPS处理培养的心肌细胞，ROS生成明显增加(与对照组比，P ＜0.01)，用40 ～120 μmol·L－1TMPZ 预处理心肌细胞3 h，从40 μmol·L－1TMPZ 开始，ROS 生成明显降低(与LPS处理组相比，P＜0.01)。

说明随着药物浓度的增加，ROS的生成逐渐减少。

2.3 TMPZ剂量依赖性地抑制NF-κB p65核移位
Western blot结果显示(Fig 4)，用10 mg·L－1LPS处理培养的心肌细胞，核蛋
白中NF-κB p65蛋白含量明显增加(与对照组比，P＜0.01)，用40～120 μmol·L －1TMPZ 预处理心肌细胞3 h，从40 μmol·L－1TMPZ开始，核蛋白中NF-κB
p65蛋白含量明显降低(与LPS处理组相比，P＜0.01)。

说明随着药物浓度的增加，抑制NF-κB p65蛋白向细胞核的转移。

2.4 TMPZ剂量依赖性地抑制脂质过氧化，提高抗氧化酶活性如Fig 5所示，用
10 mg·L－1LPS处理培养的心肌细胞，MDA含量明显增加，SOD及GSH-Px活性下降(与对照组比，P＜0.01)，用40～120 μmol·L－1TMPZ 预处理心肌细胞 3 h，从40 μmol·L－1TMPZ开始，MDA 含量开始下降，SOD 及GSH-Px活性增加(与LPS处理组相比，P＜0.01)。

说明随着药物浓度的增加，脂质过氧化被抑制，抗氧化酶活性增加。

3 讨论
LPS是革兰阴性细菌致病的主要因素，它可引起机体的一系列炎症反应，是一种重要的致炎因子［5］。

根据文献报告［3，6］，LPS可增加心肌细胞NADH氧化酶的表达及过氧化物增殖，造成ROS生成增加。

ROS具有较高的反应活性，正常情况下，细胞存在抗氧化酶类，包括SOD、GSH-Px等，能够清除细胞代谢过程中不断产生的ROS，使得细胞内ROS的生成与清除处于一个相对稳定的水平。

但当其生成较多，超过细胞抗氧化酶类的清除水平时，会造成细胞的广泛损伤，如膜脂质过氧化、蛋白质及核酸损伤等。

因此，刺激心肌细胞产生过多的ROS可能是LPS诱导心肌细胞损伤的机制之一。

我们的研究证实，LPS处理心肌细胞后，会使得MDA含量升高，SOD、GSH-Px活性下降，ROS含量增加，心肌细胞存活率减少。

Fig 3Effects of TMPZ on ROS production of cardiac cells subjected to LPS-induced injury(±s，n=6).＊＊P ＜0.01 vs control group;##P ＜0.01 vs LPS group.
Fig 4 Effects of TMPZ on nuclear NF-κB p65 protein of cardiac cells subjected to LPS-induced injury by Western blot(±s，n=6)＊＊P ＜0.01 vs control group;##P ＜0.01 vs LPS group.
TMPZ是中药川芎的主要有效成份之一，许多研究［7－8］均报道川芎嗪有心血管保护作用，并且这种保护作用与其抗氧化作用有关。

我们在LPS损伤心肌细胞之前给予不同剂量的TMPZ预处理，发现有明显的保护作用，且这种保护作用呈剂量依赖性;进一步对TMPZ抗LPS损伤的机制进行研究，发现与抑制 NF-κB 激活有关。

众所周知［9］，NF-κB 信号传导通路被认为是LPS所介导的信号传导通路中最重要的下游通路。

一般情况下，NF-κB为p50/p65异源二聚体，与抑制物IκBα结合成无活性的三聚体存在于细胞质中;一旦受到外界因素刺激时，如大量产生的 ROS，IκBα 磷酸化而迅速降解，NF-κB即被激活，p65由细胞质移位至
细胞核，从而调控一系列基因表达［10］。

在LPS诱导的心肌细胞损伤中，NF-
κB的激活很有可能引起大量炎症因子如TNF-α、IL-1等的过度表达，从而造成细胞损伤。

我们的实验结果表明，LPS能促进p65的核移位，使p65在核中的表达明显升高，而TMPZ则呈剂量依赖性抑制p65的核移位，从而起到对抗LPS致心肌细胞损伤的作用。

因此，可以推断川芎嗪对LPS所致的心肌损伤有保护作用，
其机制主要是通过减少ROS生成，从而抑制NF-κB的活化，阻止p65的核移位，减少炎症因子的表达，发挥心肌保护作用。

Fig 5 Effects of TMPZ on content of MDA，SOD and GSH-Px activities of cardiac cells subjected to LPS-induced injury(±s，n=6)＊＊P ＜0.01 vs control group;##P ＜0.01 vs LPS group.
参考文献:
［1］ Hintz K K，Ren J.Tetramethylpyrazine elicits disparate responses in cardiac contraction and intracellular Ca2+transients in isolated adult rat ventricular myocytes［J］.Vascul Pharmacol，2003，40(4):213－7.
［2］ Guo L，Wang A，Sun Y，Xu C.Evaluation of antioxidant and immunity function of tetramethylpyrazine phosphate tablets in vivo ［J］.Molecules，2012，17(5):5412 －21.
［3］ Zhang Z H，Yu Y，Wei S G，et al.Centrally administered lipopolysaccharide elicits sympathetic excitation via NAD(P)H oxidasedependent mitogen-activated protein kinase signaling［J］.J Hypertens，2010，28(4):806 －16.
［4］刘丹，何明，易波，等.Pim-3对抗心肌细胞缺氧复氧损伤的研究［J］.中国药理学通报，2009，25(3):321－5.
［4］ Liu D，He M，Yi B，et al.The research of Pim-3 protective effect on
cardiomyocyte anoxia-reoxygenation injury［J］.Chin Pharmacol Bull，2009，25(3):321 －5.
［5］ Zeng L，Gu W，Zhang A Q，et al.A functional variant of lipopolysaccharide binding protein predisposes to sepsis and organ dysfunction in patients with major trauma［J］.Ann Surg，2012，
255(1):147－57.
［6］ Peng T，Lu X，Feng Q.Pivotal role of gp91phox-containing NADH oxidase in lipopolysaccharide-induced tumor necrosis factoralpha expression and myocardial depression［J］.Circulation，2005，
111(13):1637－44.
［7］王国峰，赵霞，李宁，等.川芎嗪对脂多糖诱导内皮细胞花生四烯酸通路炎症反应的影响［J］.中国药理学通报，2012，28(4)，253－7.
［7］ Wang G F，Zhao X，Li N，et al.Antiatherosclerosis induced by ligustrazine against LPS through arachidonic acid signaling pathway ［J］.Chin Pharmacol Bull，2012，28(4)，253 －7.
［8］ Zhao H P，Lu D，Zhang W，et al.Protective action of tetramethylpyrazine phosphate against dilated cardiomyopathy in
cTnT(R141W)transgenic mice［J］.Acta Pharmacol Sin，2010，31(3):281－8.
［9］ Li D Y，Xue M Y，Geng Z R，et al.The suppressive effects of Bursopentine(BP5)on oxidative stress and NF-κB activation in lipopolysaccharide-activated murine peritoneal macrophages［J］.Cell Physiol Biochem，2012，29(1-2):9－20.
［10］ Van der Heiden K，Cuhlmann S，Luong le A，et al.Role of nuclear
factor kappaB in cardiovascular health and disease［J］.Clin Sci(Lond)，2010，118(10):593－605.。