细胞培养操作规范

细胞计数板计数室构造
细胞数/ml=（4个大方格
细胞总数/4）×104×稀
释倍数
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四、细胞培养注意事项
1. 实验进行前，无菌室及无菌操作台(laminar flow) 以紫外灯照射20-30分钟灭菌，以75 %酒 精 擦拭无菌操作抬面，并开启无菌操作台风扇运 转10 分钟后，才开始实验操作。
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细胞培养皿 ▫ 35mm （加液量3ml) ▫ 60mm （加液量5ml) ▫ 100mm（加液量10ml)
150mm (加液量15ml)
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常用培养基：
RPMI1640：
适合许多种细胞，如肿瘤细胞、正常细胞的原代培 养、传代培养等。
尤其适合人白细胞，如H9、HL-60、IM-9和K562等细胞系的培养。
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天，至室温下全溶后再分装，一般用15ml无菌 离心管分装。
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谷氨酰胺：
谷氨酰胺在溶液中很不稳定，4℃放置1周可分 解50％，故应单独配制，置于-20℃保存，临 用前加入培养液。
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消化液：
胰蛋白酶溶液： 常用浓度：0.25%。 消化时间：2-10分钟（显微镜下观察）
用含血清培养液终止其对细胞的消化作用 。
0.5M NaOH煮沸15分钟或浸泡过夜，流水冲洗，0.5M HCl煮沸15分钟或浸泡过夜，流水冲洗，蒸馏水冲洗
15次以上，50℃烤干备用。
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消毒： 消毒前常用的包装：牛皮纸、棉布、铝饭盒包
装 高压蒸汽消毒：121℃ ，维持20-30分钟。
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三：细胞培养方法
1.细胞复苏方法：
细胞培养操作规范
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一：细胞培养的基本条件：
1.无菌环境： 细胞培养间消毒 a：使用前紫外照射20-30分钟 b：使用完75%酒精擦拭台面，紫外照射15
分钟。 c：每两周用84消毒液擦拭地面、台面一次的
方式进行消毒
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超净工作台：
使用前 开启柜内紫外灯照射15－30分钟 使用时 开启鼓风，在台面内操作 使用完毕后 要用75%酒精将台面和台内四周擦拭干净，紫
从 液 氮 中 取 出 冷 冻 管 ， 迅 速 投 入 37℃ 水 浴中，甩动冻存管，使其融化（1分钟左右）；
5分钟内用培养液稀释至原体积的10倍以上； 1000转低速离心5分钟；
去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细胞。
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2.细胞换液方法：
换液指针： 观察培养基颜色：当培养基的颜色由红色渐渐褪成橙 黄色，颜色清亮，无杂质，无浑浊 观察细胞生长状态：细胞生长状态良好，确认无细菌 真菌污染 换液方法： 将吸管、废液缸放入工作台开启细胞培养房及工作台 紫外消毒20分钟， 开启恒温水浴箱，培养液预热 关闭紫外灯，开启工作台上风机 吸弃原培养液 加入新的培养
胰蛋白酶-EDTA消化液 称取0.25g的胰蛋白酶和0.02g的EDTA 用无Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液或D-Hank’s配制，
用滤器过滤除菌，-20 ℃分装保存。
细胞冻存液配制： 90%血清和10% DMSO
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3：常用培养器皿的清洗及消毒
玻璃器皿的清洗
刷洗（自来水）、浸泡（洗衣粉）、冲洗（自来水） ，烘干（50 ℃，恒温干燥箱）酸泡 （24小时，至少6小时）、清洗（流水冲洗和蒸溜水冲 洗15遍以上），50℃烘干。 新的橡胶制品洗涤方法
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2.相关试剂及配制方法：
细胞培养的相关试剂配制均在超净工作台上操作 ，严格按照无菌操作流程！
完全培养基: 基础培养基 90% 血清 10％ 碳酸氢钠 2.0 g/L 青、链霉素 100U／ml 过滤除菌4 ℃保存 使用时加入谷氨酰胺（配制方法：谷氨酰胺2.922g溶于
三蒸水加至100ml即配成200mmol/L的溶液，充分 搅拌溶解后，过滤除菌，分装小瓶，-20℃保存，使 用时可向100ml培养液中编加辑pp入t 1ml谷氨酰胺溶液。 14
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3.细胞传代方法：
传代指Байду номын сангаас：
观察培养基颜色：当培养基的颜色由红色渐渐褪 成橙黄色，颜色清亮，无杂质，无浑浊
显微镜观察细胞生长状态：细胞生长状态良好，
铺满培养瓶80%以上，细胞透亮，形态清晰，
间隙无杂质，确认无细菌真菌污染
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传代方法：
将新的培养皿、吸管、废液缸放入工作台开启细胞培 养房及工作台紫外消毒20分钟，
细胞计数
离心收集细胞，吸弃上清，加入冻存液调整细 胞密度至1×106个/ml
将细胞移入冻存管，写好标签（细胞种类，冻存时间
）4 ℃15-30分钟，-20 ℃1-2小时，-80 ℃ 保存，或过夜后至液氮罐内保存。
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5:细胞计数
数红色边框标记的四个方 格内的细胞总数（如有压 线则计上不计下，计左不 计右）
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EDTA溶液 使用浓度： ▫ 0.02%，与胰蛋白酶配合使用。 • EDTA 不能被血清中和，终止消化后，需用培
养液或PBS 彻底冲洗培养瓶。
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二：细胞培养前准备工作：
1.相关耗材：
细胞培养皿（瓶）若干、离心管（15ml,50ml）、 100ml玻璃瓶4个、500ml玻璃瓶4个、2mL冻存管、 tip头及枪头盒、吸管（10ml刻度）、吹打管、50ml 、10ml、5ml注射器、一次性针孔过滤器（0.22um ）、一次性口罩、帽子、手套、纱布、牛皮纸、标签纸
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控制水盘内污染的方法：
1、 定期(至少每两周一次)，更换水盘内的无菌 蒸馏水或无菌去离子水。
2、 在水盘内添加适量硫酸铜，预防真菌污染。 配制方法：20g无水硫酸铜＋5ml浓硫酸＋1L 灭菌纯水。
3、 水盘内添加适量抗生素。
4、定期为培养箱（含水盘）进行一次高温灭菌 。
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2. 细胞培养条件 细胞培养器皿： 细胞培养瓶： ▫ 25平方厘米（加液量3-5ml） ▫ 75平方厘米（加液量10-15ml） ▫ 150平方厘米（加液量40ml） 细胞培养板：
外照射10分钟。
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CO2 培养箱：
1.设定的条件为 37℃ ， 5 ％CO2 。 2.使用 CO2 培养箱应注意的问题： ▫ 用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松，以保证
通气。 ▫ 保持培养箱内空气干净，定期消毒擦拭。
▫ 箱内蒸馏水槽中定期更换灭菌蒸馏水3000毫升 ，以保持箱内湿度。
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将细胞悬液吸至离心管，1000rpm离心5分钟
吸弃上清，加入PBS吹打混匀， 1000rpm再次离心 5分钟
吸弃上清，加入新鲜培养基，吹打混匀，按比例接种
到细胞培养瓶
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细胞消化时间的控制：
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4:细胞冻存：
吸出旧培养液加PBS冲洗两次 胰酶消化 加培养基中止消化，（以上步骤同细胞传代 ）
开启恒温水浴箱，培养液、消化液预热
关毕紫外灯，开灯，通气，点燃酒精灯
吸弃培养基，PBS清洗两次
加入2ml消化液晃动培养瓶使消化液覆盖整个细胞界 面后吸弃培养液
肉眼观察细胞培养瓶底部出现一层云雾状，轻轻敲打 底部有块状物脱落，显微镜下观察看到细胞间隙变 大，细胞回缩变圆少量漂浮后加入10ml含血清培养 基终止消化，吹打管吹打数次
每次操作只处理一株细胞株，且即使培养基相同亦 不共享培养基，以避免失误混淆或细胞间污染。 实验完毕后，将实验物品带出工作台，以75 % 酒精擦拭无菌操作抬面。操作间隔应让无菌操作 台运转10 分钟以上后，再进行下一个细胞株之操 作
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2. 无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞， 必要物品，例如试管架、吸管吸取器或吸管 盒等可以暂时放置，其它实验用品用完即应 移出，以利于气流之流通。容器、培养瓶、 培养板和培养皿实验用品以75 % 酒精 擦 拭外部后才带入无菌操作台内。实验操作应 在台面之中央无菌区域，勿在边缘之非无菌 区域操作。切记开启鼓风。
DMEM：
DMEM（A）【不含谷氨酰胺、可高压灭菌】
DMEM（H）【含谷氨酰胺、高糖型（4500mg/L ）、除菌过滤灭菌】
DMEM（L）【含谷氨酰胺、低糖型(1000mg/L)
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、除菌过滤灭菌】
血清：
常用血清种类：胎牛血清、新生牛血清、小牛血清 血清的灭活（消除补体活性） 56℃ ，30 分钟。 使用浓度：5%-20%，一般10% 血清的消毒：过滤除菌 血清解冻步骤：–20℃ 或–70℃至4℃冰箱溶解一
3、 小心取用无菌之实验物品，避免造成污 染。勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口，亦不 要在打开之容器正上方操作实验。容器打开 后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45° 角取用，尽量勿将瓶盖盖口朝下放置桌面。
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4.一次将所有的所需要试剂、工具放入工作 台。不要半路走出工作间拿东西，传递东西 进工作室需酒精擦拭灭菌