复合因素对小鼠病毒性肝炎湿热证的影响

复合因素对小鼠病毒性肝炎湿热证的影响
目的建立小鼠病毒性肝炎的湿热证模型，为中药应用于湿热证治疗提供模型基础。

方法将小鼠随机分为正常组、单纯湿热组、病毒组、模型组。

采用反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测小鼠肝脏病毒含量。

对各组小鼠进行症状、肝功能、肝脏病理学改变等方面比较。

结果病毒组、模型组小鼠的肝功能存在不同程度的损害。

2组肝组织均有不同程度病理改變，以模型组病变更严重。

用RT-PCR检测造模后血清病毒滴度，病毒组、模型组无明显差异，病毒含量2.9×104～5.5×104拷贝数/mL。

结论初步构建小鼠病毒感染的湿热证模型，该模型的发病条件、病变程度及主要症状、体征均近似于中医湿热证特征，操作简单，重复性好，有较高的应用价值。

标签：肝炎病毒；动物模型；湿热证；小鼠
温病湿热证是由湿热病邪引起的急性外感热病，其中“必发热”为温病湿热证区别于内伤杂病湿热证的关键。

与温热类温病比较，其病理具有起病较缓、病势缠绵、病程较长之特点；与内伤湿热证比较，具有温病起病较急、来势较猛、传变较快、变化较多之特点[1]。

其病因与发病正如薛生白所言：“太阴内伤，湿饮停聚，客邪再至，内外相引，故病湿热。

”强调“内外合邪”、“同类相召”是发病之关键。

本实验在肥甘饮食+湿热环境+生物致病因子的共同作用下致温病湿热证模型，从症状、组织病理学等方面对温病湿热证模型进行观察和评价。

1 实验材料
1.1 动物
4周龄，SPF级，雄性BALB/c小鼠40只，购自广东省医学实验动物中心。

动物合格证号：0046987。

1.2 试剂与仪器
MHV-A59病毒由南方医科大学公共卫生与热带医学院微生物系病毒研究所提供；液氮、甲醛、无水乙醇：上海试剂一厂；0.9%氯化钠溶液、2.5%戊二醛、2%戊巴比妥由广州中医药大学温病教研室提供；二甲苯、Harris苏木精液、伊红染色液、1%盐酸；丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

高脂饲料及普通饲料均由广东省医学实验动物中心提供。

植物生长气候箱、手术器械、研钵、直灌胃针、金属夹、石蜡油、一次性注射器（1、5、10 mL），以及0.5、1.5 mL Eppendorf管购自美国AEGEN 公司；TP1020自动脱水机、RM2135 Leica切片机、HI1210 Leica摊片机、HI1220 Leica烘片机、EG1160Leica自动包埋机等。

2 实验方法
2.1 造模
参考文献[2]方法，所有动物正常饲养于实验动物房，适应性喂养3 d，无不良反应，即纳入实验。

4周龄SPF级BALB/c雄性小鼠40只，随机分为4组，每组10只。

正常对照组：正常饮食，同步饲养；单纯湿热组：肥甘饮食，每日在人工热气候模拟舱中热暴露6 h（温度32 ℃±0.5 ℃，湿度90%±5%），连续13 d；病毒组：正常饮食、饮水13 d，于第11日经腹腔接种鼠肝炎病毒MHV-A59 0.5 mL（预实验确定最佳攻毒浓度为10-2）；模型组：肥甘饮食，每日在人工热气候模拟舱中热暴露6 h（温度32 ℃±0.5 ℃，湿度90%±5%），连续13 d，于第11日经腹腔接种鼠肝炎病毒MHV-A59 0.5 mL（浓度为10-2）。

并观察各组动物的症状（纳呆，便溏或便秘，倦怠）、饮水量、饮食量、体质量、肛温及死亡等变化。

2.2 标本采集
第14日全部小鼠乙醚麻醉后摘取眼球采集外周血，离心后收集血清，放入-70 ℃低温冰箱保存，待测ALT、AST，剩余血清标本做病毒滴度测定。

采血后脱椎处死小鼠，剖开腹腔，迅速取各组肝左叶组织1块，面积约5 mm×5 mm，置于10%中性甲醛溶液中固定，石蜡包埋，切片，经二甲苯脱蜡、梯度酒精序列脱水、HE染色，光学显微镜下观察其组织形态学改变。

2.3 指标检测
2.3.1 肝脏组织病理学观察光学显微镜下观察各组肝组织形态学改变。

炎症活动计分和纤维化计分标准[3]：炎症活动计分分为汇管区炎症（P）、小叶内炎症（L）、碎屑样坏死（PN）、桥接坏死（BN）4项，每项根据病变程度分别计1～4分，因为PN、BN严重度与预后直接相关，计分公式为P+L+2PN+2BN。

纤维化计分分为中央静脉周和窦周、汇管区及纤维隔3项，并依据病变程度计1～4分。

见表1。

2.3.2 小鼠肝脏酶学检测采用全自动生化仪检测各组小鼠ALT、AST。

2.3.3 组织RNA提取将样品组织挑入已高压灭菌过1.5 mL Eppendorf管中，每管加1 mL DEPC水，混匀，吸去上清，重复以上操作；将冲洗后的组织挑出，加液氮，研碎；将研磨好样本放入新的1.5 mL Eppendorf管，加入1 mL Trizol （Invitrogen），混匀，室温静置15 min；再加入200 ?L氯仿，颠倒混匀，室温静置10 min，13 000 r/min离心10 min；取上清液转移至一新的1.5 mL Eppendorf 管，加入等体积异丙醇，颠倒混匀，静置10 min，13 000 r/min离心10 min；弃上清，加1 mL 75%乙醇（用DEPC水配置）洗涤沉淀，8500 r/min离心5 min，吸去上清；空气干燥沉淀，加40 ?L DEPC水溶解RNA；-20 ℃冰箱保存备用（长期保存放-70 ℃冰箱）。

2.3.4 RNA鉴定取5 ?L RNA加2 995 ?L水，稀释倍数为600倍，共3 mL 样品，用紫外分光光度计（日本SHIMADZU UV mini1240）测定波长为260 nm 及280 nm时的吸光度（OD值）；取5 ?L RNA，经1%低熔点琼脂糖凝胶电泳（含溴乙啶，用TAE缓冲液配制），检测总RNA完整性。

2.3.5 RNA反转录取5 ?L RNA模板做反转录反应，反应体系如下：5×反转录buffer 4 μL[反转录buffer成分：50 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0），50 mmol/L KCl，4 mmol/L MgCl2，10 mmol/L DTT]，上游引物（10 pmol/?L）0.4 ?L，下游引物（10 pmol/?L）0.4 ?L，dNTPs （10 mmol/?L）0.2 ?L，MMLV（200 U/?L）1 ?L，DEPC水9 ?L，RNA模板5 ?L，总体积20 ?L。

反应条件：置于PE9600PCR仪37 ℃、1 h，然后95 ℃、3 min 灭活，备用。

2.3.6 荧光定量PCR反应反转录好的模板按以下反应体系进行PCR扩增：5×定量PCR buffer10 ?L[PCR buffer成分：10 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0），50 mmol/L KCl，2 mmol/L MgCl2）]；上游引物（10 pmol/?L）1 ?L；下游引物R（10 pmol/?L）1 ?L；探针probe（10 pmol/?L）1 ?L，Taq酶（5 U/?L）1 ?L（美国ABI公司），dNTPs（10 mmol/L）（Sigma公司）1 ?L，cDNA 5 ?L，ddH2O 32 ?L，总体积50 ?L。

反应条件：93 ℃、3 min，然后93 ℃、45 s，55 ℃、1 min，共40循环。

反应结束后保存检测数据文件，根据分析后图像调节baseline的start值、stop值及Threshold值，使Std curve窗口下的标准曲线图达到最佳（correlation数值介于-0.97～-1之间，correlation数值等同于|r|值），最后到Reporter窗口下记录仪器自动分析计算出的未知标本数值B（Qty，拷贝数）。

2.3.7 阳性标准模板的制备取阳性标本RNA作为模板，取反转录反应产物cDNA 5 ?L，按以下体系反应：5×PCR buffer 10 ?L，上游引物F（25 ?mol/L）1 ?L，下游引物R（25 ?mol/L）1 ?L，dNTPs（10 mmol/L）1 ?L，Taq酶2 ?L，cDNA5 ?L；ddH2O 30 ?L，总体积50 ?L。

反应条件为：93 ℃、2 min；93 ℃、1 min，55 ℃、1 min，72 ℃、1 min，共40个循环；72 ℃、7 min延伸。

仪器为PE9600PCR 仪。

PCR扩增产物经2%低熔点琼脂糖凝胶电泳，在长波紫外下，割下目的条带；用回收试剂盒（QIAquick Gel Extraction Kit）回收纯化。

测定OD260/280>1.8，表明纯度合格。

用OD260测定值和片段长度数据换算出浓度（copy/?L），再做梯度稀释，制备成阳性定量标准品梯度。

荧光定量阴性质控标准品采用灭菌双蒸水。

浓度计算：每样品在紫外分光光度计上测定波长为260 nm时的吸光度值。

浓度（g/L）=OD260×稀释倍数×40/1000。

2.3.8 引物序列Probe and primer for Mouse MHV-A59：Probe：FAM-CATGATACCTGCCTTGTTAATGATCGCTGCCA-TAMRA；Sense primer：TCTGTGCCAACAATTCATTTATTGGA；Antisense primer：GCAACTGCAAATCTGTGGAACA；Product size：132 b。

内参的序列：73 bp；M-GAPDH F 5’-CGTGTTCCTACCCCCAATGT-3’；M-GAPDH R 5’-TGTCATCATACTTGGCAGGTTTCT-3’；M-GAPDH probe 5’-FAM-TCGTGGATCTGACGTGCCGCC-TAMRA-3’。

2.3.9 病毒含量测定组织病毒含量（相对拷贝数）=组织MHV-A59拷贝数/组织内参拷贝数。

3 统计学方法
采用SPSS11.5统计软件进行分析。

实验数据以—x±s表示，如果数据满足正态性和方差齐性，采用方差分析，组间用q检验，2组间比较采用t检验。

P ＜0.05表示差异有统计学意义。

4 结果
4.1 小鼠一般情况
正常組小鼠活动、饮食、大便及活动状态一直正常；单纯湿热组小鼠从第7日开始可见轻微耸毛现象，活动减少，大便较稀；病毒组第11日开始出现明显发热（肛温升高）、活动减少等感染症状；模型组小鼠从第11日开始出现明显发热（肛温升高）、体质量减轻、饮食减少、活动减少、大便黏滞、毛发稀疏无泽等症状，符合湿热证改变特点[4]。

4.2 肝脏组织病理学改变
正常组小鼠肝脏未见肝细胞固缩坏死、空泡变、门静脉区无炎性细胞浸润，枯否氏细胞无增加；单纯湿热组小鼠肝脏可见空泡变、轻度脂肪样变，肝细胞点状坏死；病毒组小鼠肝脏未见脂肪变性，可见部分肝细胞固缩、灶状坏死，枯否氏细胞增加；模型组小鼠肝脏可见空泡样变、炎性细胞浸润，100%存在小叶内炎症，以单核细胞、淋巴细胞浸润为主，并可见点状坏死、灶状坏死、碎屑样坏死。

病理学评分见表2。

4.3 小鼠肝脏酶学变化（见表3）
4.4 湿热证模型MHV-A59病毒含量变化（见图1）
由图1可见，MHV-A59湿热证模型肝脏病毒含量与单纯病毒感染组比较无明显差异，可认为湿热因素对病毒感染影响不大。

5 讨论
研究提示，温病湿热证与内毒素血症有着密切的内在联系[5-6]。

细菌内毒素是革兰氏阴性菌外膜的主要成分，又称为脂多糖，是细菌的主要毒性成分，对机体具有广泛的生物学作用。

内毒素在体内可激活单核/巨噬细胞，内皮细胞等合成和释放各种细胞因子和炎症介质，导致血管通透性增加、体液渗出、淋巴细胞移行到炎症部位，这本是机体的一种防御性反应，有利于清除病原菌和机体的恢复，但若反应过度，则可引起全身难以控制的“瀑布式炎症级联反应”或伴免疫功能的严重抑制，即全身炎症反应综合征或代偿性抗炎反应综合征[7]。

本实验结
果表明，温病湿热证致病因素中生物感染因子是必不可少的；温病湿热证的本质中，“湿”性致病因子包括肥甘厚味和外湿环境，“热”性致病因子主要由各种因素所致内毒素血症，诚如薛生白所云：“热得湿而热愈炽，湿得热而湿愈横。

湿热两分，其病轻而缓，湿热交合，其病重而速。

”由此推测，温病湿热病证的致病机理可能是各种因素导致肠屏障功能障碍（太阴内伤），肠腔内细菌过度生长（客邪再至），致内毒素大量通过肠屏障进入机体，可直接对细胞的生物膜产生毒性，但更为重要的是可能通过单核-巨噬细胞介导的内毒素转导信号相关蛋白分子，导致TLR/NF-κBP65活化，下游细胞因子和炎症介质大量释放，引起瀑布式级联反应，造成靶细胞或靶器官损伤，产生相应的生理、病理变化。

因此，我们认为以饮食因素+气候环境因素+鼠肝炎病毒感染的综合因素进行造模，所复制的模型较为理想，无论是发病条件、病变脏腑，还是主要症状、体征均近似于中医温病湿热证特征，且具有操作簡单、重复性好的特点。

参考文献：
[1] 郭谦亨.温病述评[M].西安：陕西科学技术出版社，1987：76.
[2] 刘叶.清热化湿透表法干预小鼠流感病毒性肺炎湿热证免疫损伤的机理研究[D].广州：广州中医药大学，2008.
[3] Domenico Ferro，Andrea Celestini. Francesco violi hyperfibrinolysis in liver[J]. Disease Clinics in Liver Disease，2009，13（1）：21-31.
[4] 吴仕九，杨运高，佟丽，等.中医湿热证证候模型的应用研究[J].中医杂志，2001，42（9）：553-559.
[5] 吴智兵，彭胜权，舒彤.湿热环境在湿温发病中的作用机理探讨[J].上海中医药杂志，2003，37（12）：45.
[6] 周燕萍，高清华，李华锋，等.3种温病治法对温病湿热证模型血浆ETX、血清TNF-α、IL-1β影响的对比研究[J].中医药学刊，2006，24（8）：1567.
[7] Lutz Hamann，Cordula Stamme，Artur J Ulmer. Inhibition of LPS-induced activation of alveolar macrophages by high concentrations of LPS-binding protein[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications，2002，295（2）：553-560.。