大肠菌群的测定论文

大肠菌群的测定论文
目录
1 普通光学显微镜的使用
2 微生物大小的测定
3 微生物直接计数法
4 细菌的简单染色和革兰氏染色法
5 常用玻璃器皿的清洗及包扎
6 牛肉膏蛋白胨培养基的制备
7灭菌
8 微生物溶液的十倍稀释法
9微生物平板菌落计数法
10 微生物的分离、接种和培养
大型实验：水中细菌总数和大肠菌群的检测
厌氧菌的分离、培养及鉴定
第一节普通光学显微镜的使用
一．实验器材
普通光学显微镜，切片标本，香柏油，二甲苯，擦镜纸。

二．实验步骤
图？显微镜的结构
1-目镜2-镜筒3.物镜转换器4.物镜5.通光孔6.聚光器7.光圈
8.反光镜9.粗调节器10.细调节器11.镜臂12.推进器13.载物台
14.倾斜关节15.镜柱16.镜座17. 照明装置18.粗调限位环凸柄
(一)低倍镜的使用
1. 把显微镜放在桌面的左侧，镜臂对向胸前，坐下进行操作。

用手转动粗调螺旋，使镜筒上升，然后转动物镜转换器，使低倍镜对准镜台中央圆孔（当转动到听见“咔”声响，或同时亦感到有阻力时立即停止转动，说明物镜已与镜筒成一直线）。

2. 对光：拨动聚光镜底部圆环的小柄，使光栏完全打开。

旋转聚光镜升降螺旋，使聚光镜上升到和镜台相平。

用左眼（两个眼睛都要睁开）在目镜上观察，同时用手调整反光镜，对好光源。

要求视野达到完全均匀明亮。

3. 放置玻片标本：取玻片标本放在镜台上，有盖玻片的一面朝上。

玻片两端用移动器夹住，然后转动螺旋，使玻片上要观察的标本对准镜中央圆孔。

注意，镜台上的刻度可以标示玻片
的坐标位置。

4. 调节物距：转动粗调螺旋，使低倍镜距玻片标本0.5mm左右。

注意：必须从显微镜侧面观察物镜与玻片的距离。

切勿用眼在目镜上观察的同时转动粗调螺旋，以防镜头碰撞玻片造成损坏。

用左眼从目镜上观察，用手慢慢转动粗调螺旋下降镜台，当视野中出现物像时，再调节细调螺旋，直至视野中出现清晰的物像（许多椭圆形的红细胞）为止。

如果物像不在视野中央，可稍微移动玻片位置（注意：移动玻片的方向与观察物像移动的方向恰好是相反的）。

5、使用推动器移动标本认真观察标本各部分，寻找要观察的目标。

(二)高倍镜的使用
1. 一定要先在低倍镜下找到要观察的标本物像后，并把要放大的部分移至视野正中，同时调节到最清晰程度，才能进行高倍镜的观察。

2. 转动物镜转换器，用高倍镜（40×）观察。

使高倍镜转到镜台中央圆孔处。

转换高倍镜时速度要慢，要细心，并从侧面进行观察（防止高倍镜碰撞玻片）。

如果高倍镜碰到玻片，说明低倍镜的物距没有调节好，应重新进行操作。

3. 调节物距：转换好高倍镜后，用左眼在目镜上观察。

这时物像往往不清楚、或者要观察的部分不在视野当中，可用细调螺旋慢慢向上或向下转动（切勿用粗调螺旋）即能清楚看到物像。

一般只需转动半圈或一圈就能达到要求。

注意：此过程中不动任何旋钮，只用细调节器稍加调节，就可获得清晰的图像。

转动转换器时，不要用手指直接扳动物镜镜头。

(三)油镜的使用
1. 首先在高倍镜下找到所要观察的标本后，把所要观察的部分移至视野中央。

2. 转动物镜转换器，移开高倍镜，调转高倍镜（40×）和油镜（100×）呈“八”字，在标本上所要观察的位置加一滴镜油（香柏油）。

3. 转动物镜转换器，转换油镜，使之对准镜台中央圆孔处，旋进油镜。

调节光线至最大光圈。

4. 转换好油镜后，用左眼在目镜上观察。

物像如不清楚，可用细调螺旋慢慢向上或向下转动，直至视野中出现清晰的物像。

如仍看不清标本，需重新用低倍镜、高倍镜观察，然后再转换油镜。

（四）观察完毕的处理
油镜镜头：先用干净擦镜纸擦1～2次，然后用二甲苯润湿擦镜纸，再擦1次，最后再用干净的擦镜纸擦2次。

擦拭镜头应顺着一个方向擦，不能来回擦拭。

切片标本：先用吸水纸擦去香柏油；再滴一滴二甲苯在上面，用吸水纸擦去，最后用水清洗。

显微镜：物镜镜头转成“八”字形，下降载物台至最低点，取下切片标本，关闭开关，拔掉电源线，如实填写使用情况，填罩上皮罩。

将显微镜放回镜箱。

搬动显微镜时应
一手握镜臂，一手托镜座。

（五）使用显微镜注意事项
1. 持镜时要一手紧握镜臂，一手托住镜座，绝不能一把提起显微镜便走，以防目镜从镜筒滑出或反光镜脱落。

2. 轻拿轻放，不要把显微镜放在实验台边缘，防止碰翻落地。

3. 显微镜光学系统部件要用清洁的擦镜纸轻轻揩擦，切勿口吹、手抹或用粗布揩擦。

4. 使用时先用低倍镜调整光线。

观察活体标本或染色较浅的标本时，要适当关小可变光栏便视野变暗，方能看得清楚。

5. 放置玻片标本时要对准镜台孔正中央，并且不能反放玻片，如标本玻片反放时高倍镜下看不到物像，并容易压坏玻片或物镜。

6. 观察时要双目睁开，切勿闭上一只眼睛。

左眼观察视野，右眼用以绘图。

低倍镜用粗调螺旋调节物距，高倍镜要用细调螺旋，粗、细调节螺旋都不能单方向过度地旋转。

单向上升粗调螺旋会压碎镜片和损坏物镜。

7. 不要随便取出目镜，以防尘土落人物镜上。

也不要任意拆卸任何零件，以防损坏。

8. 使用完毕后，转动粗调螺旋使镜台下降，取下玻片，转动物镜转换器，使物镜离开聚光孔。

再上升镜台使物镜接近镜台（不要对着镜台孔）。

然后以右手握镜臂，左手托镜座轻轻放人镜箱中。

9. 每次使用显微镜之前，先按显微镜登记卡片逐项检查显微镜各部分有无损坏。

如发现损坏，应及时向教师报告。

使用之后，认真填写显微镜使用登记卡片。

2 微生物大小的测定
一．材料及器材
菌种：酵母菌
仪器及其他用具：目镜测微尺，镜台测微尺，载玻片，盖玻片，显微镜、吸水纸
二．方法与步骤
(1) 装目镜测微尺。

取出接目镜，把目镜上的透镜旋下，将目镜测微尺刻度朝下放在目镜镜筒内的隔板上，然后旋上目镜透镜，再将目镜插入镜筒内。

(2) 校正目镜测微尺。

① 放镜台微尺。

将镜台测微尺刻度面朝上放在显微镜载物台上。

② 校正。

先用低倍镜观察，将镜台测微尺有刻度的部分移至视野中央，调节焦距，当清晰地看到镜台测微尺的刻度后，转动目镜使目镜测微尺的刻度与镜台测微尺的刻度平行。

利用推动器移动镜台测微尺，使两尺在某一区域内两线完全重合，然后分别读出两重合线之间镜台微尺和目镜微尺所占的格数。

用同样的方法换成高倍镜和油镜进行校正，分别测出在高倍镜和油镜下，两重合线之间两尺分别所占的格数。

观察时光线不宜过强，否则难以找到镜台测微尺的刻度；换高倍镜和油镜校正时，务必十分细心，防止接物镜压坏镜台测微尺和损坏镜头。

③ 计算。

由于已知镜台测微尺每格长10μm ，根据下列公式即可分别计算出在不同放大倍数下，目镜测微尺每格所代表的长度。

目镜测微尺每格长度（μm ）=格数两重合线间目镜测微尺格数
两重合线间镜台测微尺×10
(3) 菌体大小测定。

目镜测微尺校正完毕后，取下镜台测微尺，换上酵母细胞切片。

酵母细胞切片的制作：①载玻片、盖玻片的清洗、干燥。

②滴酵母液。

注意量要少，滴在载玻片中间部位。

③盖盖玻片。

盖玻片一边与酵母液接触，缓慢放下，避免产生气泡。

④用吸水纸吸干余液。

测定：先用低倍镜找到标本，换高倍镜测定酵母菌的宽度和长度。

测定时，通过转动目镜测微尺和移动载玻片，测出酵母菌的宽和长所占目镜测微尺的格数。

最后将所测得的格数乘以目镜测微尺（用油镜时）每格所代表的长度，即为该菌的实际大小。

(4) 测定完毕。

取出目镜测微尺后，将目镜放回镜筒，再将目镜测微尺和镜台测微尺分别用擦镜纸擦拭干净，放回盒内保存。

(5) 结果
目镜测微尺每格长度（μm ）=
格数两重合线间目镜测微尺格数两重合线间镜台测微尺×10
3 微生物直接计数法
一．材料及器材
酵母菌液、显微镜、血球计数板、载玻片、盖玻片
二．方法步骤
1、镜检计数室
在加样前，先对计数板的计数室进行镜检。

若有污物，则需清洗，干燥后才能进行计数。

2、加样品
将清洁干燥的血球计数板盖上血盖片，再用无菌的毛细滴管将摇匀的菌悬液由盖玻片边缘滴一小滴,让菌液沿缝隙靠毛细渗透作用自动进入计数室，用吸水纸吸去多余水液。

样品要均匀充满计数室，不可有气泡。

3、显微镜计数
加样后静止5min ，然后将血球计数板置于显微镜载物台上，先用低倍镜找到计数室所在位置，然后换成高倍镜进行计数。

计数左上、左下、右上、右下、中间共5个中方格，即计数80个小方格中的酵母细胞数。

显微镜视野中的光线要暗一些，对于用反光镜采光的显微镜还要注意光线不要偏向一边, 否则，不容易看清计数室的方格线,或只见竖线或只见横线。

在计数前若发现菌液太浓或太稀，需重新调节稀释度后再计数。

一般样品稀释度要求每小格内约有5~10个菌体为宜。

计数时，对位于线上的酵母菌，可采用只计数两条边的办法，即遵循查上不查下，查左不查右的原则。

当酵母菌芽体达到母细胞大小l/2时，即可计作两个细胞。

计数一个样品要从两个计数室中计得的平均数值来计算样品的含菌量。

设五个中方格中的总菌数为A ，菌液稀释倍数为B ，如果是25个中方格的计数板，则 1mL 菌液中的总菌数=A/5×25×104×B=50000A•B （个）
同理，如果是16个中方格的计数板，
1mL 菌液中的总菌数=A/5×16×104×B=32000A•B （个）
4、出芽率的测定
按前法，测定出酵母菌芽体数(小于母细胞1/2的)，计算出单位体积内测得酵母细胞的芽
体占总数的百分率，即为酵母的出芽率。

出芽率 =
细胞总数芽体数
×100％
%3
2+=出 5、酵母死亡率的测定
滴一滴0.1％吕氏美蓝液于载玻片中央，再加菌悬液少许，与美蓝液混匀，加盖玻片，立即在显微镜下检查，记数在一个视野中，已变蓝(死)和未变蓝(活)的细胞数。

依法再计数2～3个视野中的细胞数。

死亡率=细胞总数死细胞数
×100％
死亡率是单位体积内死亡的细胞数占总细胞数的百分率。

6、计数完毕，将计数板在水龙头下冲洗干净，切勿用硬物洗刷，洗完后自行晾干。

7、镜检，观察每小格内是否有残留菌体或其他沉淀物。

若不干净，则必须重复洗涤至干净为止。

4 细菌的简单染色和革兰氏染色法
一．材料及器材
1、菌种：培养24h 的大肠杆菌和葡萄球菌，培养12～16h 的枯草杆菌、牙垢。

2、试剂：草酸铵结晶紫、路哥氏碘液、95％乙醇、番红染液、香柏油、二甲苯。

3、仪器或其他：显微镜，载玻片，吸水纸，擦镜纸，接种环，酒精灯。

二．方法与步骤
1、简单染色法
简单染色一般经过以下步骤：
涂片—干燥—固定—染色—水洗—干燥—镜检
(1) 涂片。

用接种环以无菌操作(图1)从试管培养液中取一环菌，于载玻片中央涂成薄层即可，或滴一小滴生理盐水于载玻片中央，用接种环从斜面上挑出少许菌
体，与水滴混合均匀，涂成极薄的菌膜, ,注意滴的水滴要小，取菌要少,一般涂布
直径1cm 大小范围为宜。

还可以用牙签取牙齿缝间的牙垢制涂片，以观察其中的螺旋菌。

(2) 干燥。

涂片后在室温下自然干燥，也可在酒精灯上略微加热，使之迅速干燥。

(3) 固定。

用手持载玻片一端，标本面朝上，在酒精灯的火焰外侧快速来回移动3～4次，要求玻片温度不超过60℃脱使细胞质凝固，以固定细菌的形态，并使其牢固附在载玻片上，不易落。

以玻片背面触及手背皮肤不觉过烫为宜。

(4) 染色。

滴加结晶紫或其他染色液，覆盖玻片涂菌部分，染色1min。

图1 无菌操作过程（1～8为操作步骤）
图2 涂片、干燥和热固定
(5) 水洗。

斜置玻片，倒去染料，用细小的缓水流自标本的上端流下，洗去多余的染料，勿
使过急的水流直接冲洗涂菌处，直到流下的水无色为止。

(6) 干燥。

将标本置于桌上风干，也可用吸水纸轻轻地吸去水分，或微微加热，以加快干燥速
度。

(7) 镜检。

镜检顺序按由低倍镜到高倍镜，最后用油镜观察。

2、革兰氏染色法
操作过程：涂片→干燥→固定→草酸铵结晶紫初染→路哥氏碘液媒染→95％乙醇脱色→番红复染→干燥→镜检。

(1) 制片。

取要观察的菌体进行常规涂片、干燥、固定。

(2) 初染。

在菌膜上覆盖草酸铵结晶紫，染色l～2min，水洗。

(3) 媒染。

用路哥氏碘液冲去残水，并用路哥氏碘液覆盖1min，水洗。

(4) 脱色。

用滴管流加95％的乙醇脱色，直到流下的乙醇无紫色为止，时间为20～30s，水洗。

乙醇的浓度、用量及涂片厚度都会影响脱色速度。

脱色是革兰氏染色中关键的一步，
脱色不足，阴性菌被误染成阳性菌，脱色过度，阳性菌被误染成阴性菌。

(5) 复染。

用番红复染液覆盖2min，水洗，(如图3)。

(6) 镜检。

干燥后镜检。

干燥后用油镜观察，革兰阳性细菌呈蓝紫色，革兰阴性细菌呈红色。

以分散开的细菌革兰染色反应为准，过于密集的细菌常由于脱色不完全而呈假阳性。

图3 革兰氏染色程序
1．加草酸铵结晶紫染色1～2min；2．水洗；3．碘液媒染lmin；4．水洗；5．乙醇脱色20～30s；6．水冼；7．番红复染2min；8．水洗；9．用吸水纸吸干
注意：脱色是革兰染色关键的一步，可直接用95%酒精冲洗脱色，直到流下的酒精接近无色为止，然后立即用水冲洗，以免脱色时间过长而影响最终染色结果。

另外，挑菌量，固定温度，染色时间也是影响结果的重要因素。

阳性紫色阴性红色
5 常用玻璃器皿的清洗及包扎
一．实验材料及仪器
1、玻璃器皿：吸量管、培养皿、试管、三角瓶
2、仪器：电热鼓风干燥箱、电热干燥箱、立式高压蒸汽灭菌锅
二．方法与步骤
1、载玻片及盖玻片的清洗
用纸擦去油垢，将盖玻片散入1％的洗衣粉液中，煮沸lmin，待沸点泡平下后，再煮沸1min，如此反复(约30min左右)。

冷却后用自来水冲洗干净。

注意：煮沸时间过长会使玻片钙化变白且变脆易碎.
2、含有琼脂培养基的玻璃器皿的清洗
先用小刀或铁丝将器皿中的琼脂培养基刮下。

如果琼脂培养基已经干燥，可将器皿放在水中蒸煮，使琼脂融化后趁热倒出，然后用水洗涤，并用毛刷沾肥皂擦洗内壁，然后用自来水洗去肥皂。

是否已将油垢完全除去，可以这样检查：即将瓶子或试管的外壁擦干，如果水在内壁是均匀地分布一薄层，可以认为是将油垢除去了。

如果经过这样洗涤的器皿，油垢还未洗净，就需用洗涤液来清洗。

3、吸量管、移液管
清洗：①将准备好的吸量管清洗。

（以管内壁流下的水成线为标准）；
②洗好的吸量管竖于试管架上，自然干燥；
包扎：①取适量脱脂棉塞入1ml吸量管的后部约0.8cm。

用上面准备好的宽约3-5cm长约12cm 报纸条以30°～45°的角度螺旋形卷起来，吸管的尖端在头部，另一端用剩余的纸条打成一结，以防散开，标上容量。

（包扎要严密，保证不会松散）
②若干支吸管包扎成一束进行灭菌。

使用时，从吸管中间拧断纸条，抽出吸管。

4、培养皿
清洗：①将培养皿清洗干净（以皿上不挂水珠为标准）。

②将培养皿放入电热鼓风干燥箱中烘干。

取出备用。

包扎：用普通报纸将8~10个培养皿包扎紧密，必要时可用棉绳扎困。

5、试管和三角瓶
清洗：①将试管、三角瓶用试管刷清洗；（以试管内壁流下的水成线为标准）
②将试管口朝下放入试管架自然干燥，或放入50℃左右电热鼓风干燥箱中烘干。

包扎：①用8㎝~10㎝左右方形棉花，制成棉塞（如图4），棉塞的长度不小于管口直径的2倍，应使棉塞长度的1/3在管口外，2/3在管口内。

②用左右方形牛皮纸覆盖棉花塞，用棉绳缠绕包扎；也可以2~3个试管为一组用一张
牛皮纸包扎。

图4 棉塞的制作
6 牛肉膏蛋白胨培养基的制备
一．准备材料及器材
1、配制药品：牛肉膏、蛋白胨、琼脂条、NaCl；
2 、调PH值用试剂：2mol/L NaOH、2mol/L HCl；
3 、玻璃器皿：试管、三角瓶、烧杯、量筒、漏斗；
4 、仪器：电炉、天平、高压立式蒸汽灭菌锅；
5 、其他：纱布、棉花、牛皮纸、棉绳、pH试纸；
二．方法与步骤
1、称量
牛肉膏1.5g、蛋白胨5g、琼脂条7.5~10g、NaCl 2.5g、水500ml；
注解：①牛肉膏用玻璃棒挑取，放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶化后倒入烧杯。

②蛋白胨易吸湿，称量时要迅速。

2、溶解
烧杯中加入约400ml水，加热约80℃，加入牛肉膏、蛋白胨、NaCl，用玻棒搅匀，使其溶解。

琼脂在溶液沸腾后加入。

融化过程中不断搅拌，注意火力，以防将培养基烧焦使烧杯破裂或溢出。

待药品完全溶解后，补足所需水分。

3、调pH
在未调pH前，先用精密pH试纸测量培养基的原始pH值，如果pH偏酸，用滴管向培养基中逐滴加入2mol/L NaOH，边加边搅拌，并随时用pH试纸测其pH值，直至pH达7．0~7.2。

反之，则用2mol/L HCl进行调节。

注意pH值不要调过头，以避免回调，否则，将会影响培养基内各离子的浓度。

对于有些要求pH值较精确的微生物，其pH的调节可用酸度计进行。

4、过滤
趁热用多层纱布过滤。

以利结果的观察。

如无特殊要求可省去此步骤。

5、分装
试管：将试管放于试管架上，插入玻璃漏斗，缓慢倾倒培养基，分装高度以试管高度的1/4~1/5（试管架底二层栏板处）左右为宜；
三角瓶：玻璃漏斗插入三角瓶，装入一般以不超过三角瓶容积的1/2为宜；
注意：分装时勿使培养基沾染在容器口上，以免沾污棉塞引起污染。

6、加棉塞
分装完毕后，在试管口、三角瓶口塞上棉塞。

7、包扎
加塞后，将全部试管用麻绳捆扎好，再在棉塞外包一层牛皮纸，以防止灭菌时冷凝水润湿棉塞，其外再用一道麻绳扎好。

用记号笔注明培养基名称、组别、日期。

三角烧瓶加塞后，外包牛皮纸，用麻绳以活结形式扎好，使用时容易解开，同样用记号笔注明培养基名称、组别、日期。

8、灭菌
将上述培养基12l℃，高压蒸汽灭菌20min。

9、搁置斜面
将刚灭过菌的试管培养基（趁热）管口端搁在玻璃棒或其他合适高度的器具上，搁置的斜面长度以不超过试管总长的一半为宜。

图6 搁置斜面
10．无菌检查
将灭菌的培养基放入37℃的温室中培养24—48小时，以检查灭菌是否彻底。

7 灭菌
方法分为两类：干热灭菌和高压蒸汽灭菌
一、干热灭菌
适于空的、干燥的玻璃器皿灭菌（比如移液管、培养皿）。

培养基不适用。

操作步骤：
1、装入待灭菌物品将包好的待灭菌物品放入电烘箱，物品摆放不要太挤，以免妨碍热空气流通。

同时，灭菌物品也不能接触干燥箱内壁铁板，以防包装纸烤焦起火。

关好箱门。

2、升温接通电源，打开开关，打开电烘箱排气孔，旋动恒温调节器至绿灯亮，让温度逐渐上升。

当温度升至100℃时，关闭排气阀。

在升温过程中，如果红灯熄灭，绿灯亮，表示箱内停滞升温，如果此时还未达到所需温度，则需转动调节器使红灯再亮，如此反复调节直至达到所需温度。

3、恒温当温度升到160～170℃时，借恒温调节器的自动控制，保持温度2h。

在干热灭菌过程中，严防恒温调节器的自动控制失灵而造成安全事故。

4、降温切断电源，自然降温。

5、开箱取物冷却至70℃时，打开箱门，取出灭菌物品。

注意：未降至70℃以前，切勿打开箱门，否则温度骤降导致玻璃器皿炸裂。

二、高压蒸汽灭菌
对灭菌物品无特殊要求。

操作步骤：
1、接通电源，打开开关，取出内层锅，看水位指示灯是否为高水位，如果是低水位或缺水位灯亮则需从过上面注水，至高水位灯亮；
2、装入待灭菌物品放回内层锅。

向上抽提左侧螺栓旋进盖子，锁住；旋紧盖子上方螺旋盘，密闭，勿使漏气；
3、打开排气阀。

4、设定温度为120℃；时间为20min；
5、待排气阀冒热气5min，锅内的冷空气排除干净，关上排气阀；
6、停止加热，待压力表的压力降至零位时，打开排气阀，旋松螺栓，打开盖子，取出灭菌物
品。

注意：①当压力不为零时，不能开盖取物，否则由于压力突然下降，容器内外压力不平衡而冲出三角瓶或试管，造成棉塞沾染而发生污染，甚至灼烧操作者。

②高压灭菌锅上的安全阀，是保障安全使用的重要机构，不得随意调节。

8 微生物溶液的十倍稀释法
一、实验材料及器材
无菌9mL生理盐水、无菌lmL吸管、试管架、酒精灯、火柴、75%的乙醇、记号笔。

二、方法与步骤
1、点燃酒精灯，试管架摆在酒精灯前方；用含有75%的乙醇的棉球擦手灭菌。

2、取出灭过菌的10支吸量管（稀释几个浓度取几支吸量管）；从包装纸中间撕开一条（或
者从中间拧断包扎纸），上半部分抽出；分别在上面做标签。

标为0、-1、-2——-9
3、把9支装有生理盐水的试管包扎纸去掉，然后插到试管架上，分别在上面做标签。

从试管
架左至右分别标为-1、-2、-3——-9.
4、原始样品振荡，菌液混匀；
5、10－1稀释液：在原始样品中用1ml吸量管吸取1ml菌液，转入装有9ml生理盐水的试管，
沿试管管壁释放，切勿插入液面。

振荡摇匀。

6、10－2稀释液：在10-1样品中用1ml吸量管吸取1ml菌液，转入装有9ml生理盐水的试管，
沿试管管壁释放，切勿插入液面。

振荡摇匀。

7、10-3——10-9都可以依照2、3步骤操作。

注意每稀释一个浓度换一支移液管。

使用过的移液管放回标有相应液体浓度的包扎纸筒里。

9 微生物的平板菌落计数
一、材料及器皿
1、菌种：过期牛奶
2、培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基
3、仪器或其他用具：3个浓度的稀释菌液、无菌培养皿、无菌lmL吸管、试管架、酒精灯、
火柴、75%的乙醇、记号笔、玻璃涂布棒。

二、实验操作
1、倒平板
（1）培养皿、锥形瓶持法
培养皿持法：左手，在酒精灯无菌区，无名指和小拇指托起皿底，大拇指打开皿盖；
锥形瓶持法：右手，手握锥形瓶底部。

瓶口用酒精灯外焰灭菌。

（2）加培养基（加入量、污染皿壁、混匀）
锥形瓶口伸入培养皿靠中间部位倾倒，15-20ml（大约占皿底3/4到4/5）；动作迅速，缓慢竖起锥形瓶（不要完全竖起），待没有液滴留下盖上皿盖，慢慢小幅度转动培养皿使培养基铺满整个皿底，放在桌上，冷却；拿起第二个培养皿同上操作。

（3）酒精灯无菌区操作
整个过程注意锥形瓶口不要远离酒精灯外焰。

图7 倒平板
(a)皿架法；(b)手持法
2、按照微生物的十倍稀释法稀释2个浓度，即10-1、10-2；
3、平板接种培养
平板接种培养有混合平板培养法和涂抹平板培养法两种。

(1) 混合平板培养法
将无菌平板编上100、10-1、10-2号码，每一号码设置3个重复，用无菌吸管按
无菌操作要求吸取10-2稀释液各1mL放入编号10-2的3个平板中，另取一支1mL吸管同法吸取10-1稀释液各lmL放入编号1×10-1的3个平板中，再取一支1mL吸管吸取1×100稀释液各。